Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Summary

Video biyoinformatik otomatik işleme, analiz, anlayış ve mikroskobik videos çıkarılan biyolojik uzay-zamansal veri veri madenciliği. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni gelişimini ölçmek için bir yöntem göstermektir.

Abstract

Video veri karmaşık ve çok sayıda resim, video malzeme madencilik bilgileri oluşan Çünkü bilgisayar yazılım yardımı olmadan yapmak zor. Video biyoinformatik kalma madencilik ve analiz gerçekleştirmek için bilgisayar yazılımı kullanarak video görüntüleri uzay-zamansal veri ayıklamak için güçlü bir kantitatif bir yaklaşımdır. Bu makalede, zaman atlamalı video, video görüntüleme için bir kamera ile donatılmış bir Nikon BioStation CT inkübatör toplanan analiz ederek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyüme ölçülmesi için bir video biyoinformatik yöntemi tanıtmak. Deneylerde, Matrigel için bağlıydık hESC koloniler BioStation CT 48 saat için çekildi. Bu kolonilerin büyüme oranını belirlemek için, yemek tarifleri, kullanıcıların video görüntüleri çeşitli veri türlerini ayıklamak için sağlayan CL-Quant yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Doğru koloni gelişimini değerlendirmek için, üç yemek tarifleri oluşturuldu. Zamanla koloni koloni ve arka plan, video dizisi boyunca koloniler doğru tanımlamak için ikinci gelişmiş görüntü, ve üçüncü içine ilk bölümlenmiş görüntü piksel sayısı ölçülür. 48 saat içinde bireysel hESC kolonilerin büyüme oranını analiz için bir BioStation BT toplanan video veri sırayla üç tarifleri koşmak vardı. CL-Quant tarifleri doğruluğuna doğrulamak için, aynı veri Adobe Photoshop yazılımı kullanarak manuel olarak analiz edildi. CL-Quant tarifleri ve Photoshop karşılaştırıldı elde edilen veriler, sonuçlar, CL-Quant tarifleri dürüst gösteren hemen hemen aynıydı. Burada açıklanan yöntem hESC veya koloniler halinde yetişen diğer hücrelere büyüme oranlarını ölçmek için herhangi bir video verilere uygulanabilir. Buna ek olarak, diğer video biyoinformatik tarifleri, göç, apoptozis ve hücre yapışması gibi diğer hücre süreçleri için gelecekte geliştirilebilir.

Protocol

Bölüm 1: Deney Prosedürü

Video verileri bir bilgi zenginliği içeren. Ancak, bu bilgiler genellikle ayıklamak zor ve insanlar tarafından elle yapılması ve tamamlanması için personel kaç saat zaman gerekebilir. Insanlar tarafından Manuel analizi, yorumlanması ve hata değişimi tabi. Video biyoinformatik, video görüntüleri belirli bir veri benim için bilgisayar yazılım kullanımını içerir. Bu analiz metodu hızlı ve analiz insanlar tarafından elle yapılır oluşur hata ortadan kaldırabilir. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre kolonisi büyüme miktarının belirlenmesi için bir yöntem göstermektir.

Bu çalışmada, zaman atlamalı video görüntüleri hücre birden çok alan (Şekil 1) zamanla imaged sağlayan Nikon BioStation CT kuluçka ünitesi kullanılarak toplanmıştır. Bu raporda açıklanan yöntemler kurmak mikroskobik herhangi bir video tarafından toplanan video verilere uygulanabilir.

Bizim deney tasarımı, biz 48 saat için 12-iyi doku kültürü plakaları H9 hESC kaplamalı. Bu süre zarfında, koloniler Matrigel üzerinde tam olarak takın ve yaymak için izin verildi. Sonra, plakaları takılı hESC koloniler BioStation CT aktarılır ve ek bir 48 saat süreyle inkübe edildi. BioStation iken, koloniler görüntüleri 7 dakikalık aralıklarla toplanan ve daha sonra time-lapse video sekansları yaratmak için kullanıldı. Daha sonra her bir koloni için videolar CL-Quant yazılımı ile geliştirilen video biyoinformatik tarifleri kullanarak koloni gelişimini ölçmek için analiz edildi. CL-Quant yazılımı Adobe Photoshop kullanarak elle doğruluğuna kontrol edildi yaratılmış tarifleri kullanılarak analizler yapılır.

Bölüm 2: ekli hESC kolonilerinin hazırlanması

1. Matrigel kaplı 6-kuyucuğu hESC büyür ve bir kez% 70 confluency ulaşıldığında, aşağıdaki gibi bir 12-iyi Matrigel kaplı plaka 5 kuyu içine 6-iyi plaka iyi bir replate.
2. De içeren bir hESC orta aspire.
3. 1 ml PBS ile 2x iyice durulayın.
4. 37 1 dakika boyunca Accutase ve inkübe 1ml ekle ° C ve% 5 CO _2.
5. 10-12 cam boncuklar kuyunun içine ekleyin ve plaka koloniler tamamen kuyunun dibinden ayırmak kadar yavaşça sallayın.
6. MTeSR orta veya MEF klimalı ortamda 1ml kullanarak Accutase nötralize.
7. 3 dakika için 200 gr 15ml konik bir tüp içinde hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
8. 500μl taze mTeSR orta süpernatantı ve break pelet Durusu.
9. 12 plaka her kuyuya hESC süspansiyon Plaka damla bilge 100μl.
10. Kaya levhası, ileri geri yavaşça ve hafif bir mikroskop altında kültürleri gözlemlemek. Hücre kümeleri eşit plaka boyunca dağıtılan emin olun.
11. 12 plaka kuvöz içine geri yerleştirin.
12. HESC 48 saat (kısa bir süre olabilir) takın ve büyümeye izin verin.
13. 48 saat sonra, PBS 500ul ile süzün orta ve yıkama kuyu unattached hücreleri çıkarmak için.
14. Her bir kuyu için mTeSR orta 1 ml ekleyin.
15. Yorum: Derhal inkübatör / video görüntüleme için mikroskop plaka koyun.
16. Zaman atlamalı görüntüleri toplamaya başlar. Diğer koloniler halinde büyümesini olası değildir ayrık tek koloniler alanları seçmek için çalışın.
17. Kültür ve hESC kurmak için başka yöntemler de yukarıdaki protokolün yerde kullanılabilir.

Bölüm 3: video Biyoinformatik

CL-Quant yazılım sırayla çalıştırdığınızda zamanla her koloni için mikron piksel sayısı veya alan belirleyecek üç "tarifler" oluşturmak için kullanılır oldu. Segmentasyon, iyileştirme ve ölçme, üç yemek tarifleri, sırası ve bu uygulama için inşa edilmiştir.

CL-Quant yazılım / reçete geliştirme kullanarak hESC koloni büyüme analizi:

1. Segmentasyon tarifi ilk oluşturulur.
2. Video kullanılabilir olduğundan emin olmak için tüm video tarayın. Tüm koloni görüş alanında ve diğer koloniler alanında girmeyin kalır emin olmak için kontrol edin.
3. Segmentasyon sihirbazını açın ve "next" düğmesine tıklayın.
4. Doğru görüntü kanal (yani, faz, yeşil, kırmızı, vb.) Seçin ve "next" düğmesine tıklayın.
5. 3 seçenek "yumuşak eşleşen" Pick ve "next" butonuna tıklayınız.
6. Genellikle görüntü koloninin merkezi bir bölgede koloni dış kenarı bölgelerde çizerek "istiyorum" bölgeleri seçin.
   • Bu alan mümkün olduğunca küçük olmalıdır ancak tüm koloni temsilcisi olmalıdır.
   • Faz kontrast mikroskobu kullanırken, yazılım tarafından hassas bir koloni seçimi için koloni etrafında halo eklemeyi unutmayın.
   • Farklı gösterebilir faiz 1 veya 2 bölge haberleripiksel koloni içinde desenleri, ancak yanlış maske uygulaması neden olabilir çok fazla istiyor "almak gerekmez.
7. "Next" düğmesine tıklayın.
8. Arka planın parçası koloninin bir parçası değildir ve görüntü çizerek bölgelerde bölge "istemiyorum" seçeneğini seçin. Bunlar, enkaz ve ölü hücreleri gibi eserler piksel bastırmak ve eklemek istediğiniz desenler var bölgelerdir. "Next" tuşuna basın.
9. Bastırmak için istediğiniz bölgelerde çizerek "background" seçeneğini seçin.
   • "Istemiyorum" ve "arka plan" bölgeleri o arka planda farklı üniforma ve muhtemelen her karede göstermek olmalıdır.
   • Tipik koloni çevresinde gri bir arka plan seçin.
10. "Next" düğmesine tıklayın.
11. Renkli bir maske ilgi bölgesi (Şekil 2A) üzerinde görüntülenmesi gerekir.
12. Maske ilgi bölge doğru değilse, segmentasyon eşik aralığı (yazılım ekranın sağ alt köşesinde bulunan) artmış veya azalmış olabilir.
13. Segmentasyon sihirbaz, daha fazla maske alana ince ayar gerekirse ister.
14. Maske değiştirmek isterseniz, "yumuşak uyan bölgelerde güncelleyin" seçeneğini seçin. Bu, "istemiyorum", "istiyorum" ya da "arka plan" alanları değiştirmenize olanak verir.
15. Maske tatmin edici ise, "eşik uygulamak ve benim maske kaydetmek", ve "next" düğmesine tıklayın.
16. Maskesi, daha sonra farklı bir renk gözükecektir.
17. "Finish" i seçin.
18. Tarifi yazılımın sağ üst köşesinde görüntülenir ve "segmentasyon tarifi" aranmalıdır.
19. Sağ tıklayıp "adını" isterseniz tarifi yeniden adlandırın.
20. Yerinde kontrol etmek için, sağ tıklayıp "tarifi geçerlidir" üzerine fare yerleştirin.
21. Istediğiniz kare sayısını seçin nokta tarifi kontrol ederken kullanmak için izin veren bir menü görünecektir. Maske yerleştirme doğruluğunu kontrol nokta her 10 kare için reçete çalıştırın.
22. Maske, istenmeyen küçük bölgeler ya da enkaz parçaları alır, bölgeye ilgi maske uydurma iyileştirmek için bir "geliştirme tarifi" oluşturabilirsiniz.
23. Bir donanım tarifi oluşturmak için, "geliştirme tarifi" klasörünü sağ tıklatın ve sonra "yeni" butonuna tıklayınız. Yeni bir geliştirme tarifi görüntülenmesi gerekir.
24. View (FOV) özgün alan, görüntünün sağ tarafında yer alan "geçiş geliştirme modülü" butonuna tıklayın. Doğru olanı belirlemek için araç çubuğundaki simgelerin üzerine fare.
25. "Etiketleme" açılır menüsünden seçin.
26. "Etiketleme 4 bağlı" seçin.
27. Seç "etiketleme 4 connected2".
28. Yeni bir görev çubuğu görüntülenir olmalıdır.
29. Segmentasyon tarifi ilk maskesi (mask0) alın ve "giriş" kutusuna sürükleyin.
30. Çubuğu artık "# giriş maskesi" göstermesi gerekir.
31. Maske 0 simgesi "# giriş maskesi" simgesini sürükleyin.
32. Görev çubuğunda "min boyutu" ve faiz tek bölge görüntülenene kadar sayısını ayarlamak. Her uydurma deneme yoluyla "execute" tıklayın emin olun.
33. Minimum boyutu ayarı memnun, önceden yaratmış olduğunuz "geliştirme tarifi" tıklatın. (Şekil 2B)
34. Ekranın alt kısmında, "reçeteye kaydet" seçeneğini işaretleyin.
35. Yazılım şimdi seçilen tarifi üzerine yazılsın mı? "," Evet "seçin ister
36. Nokta nokta kontrol segmentasyon için yukarıdaki gibi aynı prosedürleri kullanarak geliştirme reçete kontrol.
37. Segmentasyon ve geliştirme tarifleri memnun varsa, sağ taraftaki araç çubuğunda 'ölçüm şablon oluşturmak' seçin.
38. İsterseniz şablonu yeniden adlandırın.
39. Ölçüm şablonu penceresinde, klip art hücre rakam üzerinden götür. Ctrl tuşunu basılı tutun ve hücreyi seçin.
40. Işaretini kaldırın 'varsayılan parametre' ve 'onay' morfolojisi 'başlığı altında alan parametresi'.
41. Çıkış 'şablon' penceresi.
42. Ölçüm tarifi oluşturulan simgesini seçin.
43. Tarifi yeniden adlandırın.
44. Gidin ve sağ üst köşedeki 'şablon' sekmesini seçin.
45. Ölçüm penceresinin üzerine, önceden oluşturulmuş bir ölçüm şablonu Sürükle ve bırak.
46. 'Evet'i devam etmek.
47. Ölçüm tarifi penceresinde seçin, sonra 'Tüm hücre', 'Kanal eşlemeleri'.
48. 'Maske seçin eşlemeleri'.
49. Geliştirilmiş maske Sonra 'Tüm hücre' seçeneği.
50. Ana pencerede Reçete sekmesi altında 'Ölçüm tarifi' seçin.
51. Ölçüm tarifi pencere içinde 'Kaydet' simgesini seçin.
52. Daha sonra pencereyi kapatın.
53. Şimdi, yakın ve 'FOV' yeniden.
54. 'Reçete' simgesini, 'Kilit reçete listesi' sağ tıklayın ve video verilerini tarifleri sırayla çalıştırın.

Bölüm 4: Photoshop yazılımı kullanarak tarifi hassasiyet kontrolü

(CL-Quant yazılımı ile oluşturulmuş tarifi doğrulamak için) vardır, Adobe Photoshop ile aynı veriyi elle analiz edilebilir. Bu analiz için, her 10. kare (her 70 dakikada bir zaman noktasında) 48 saatten fazla koloni boyutunu ölçmek için analiz edildi.

1. Adobe Photoshop bir koloni resmi bir çerçeve açın.
2. Magic Wand Tool araç çubuğunu tıklatın.
3. Koloni bölgesi hariç tüm alan kaplıdır ve bu alan üzerinde koloni çevresinde tıklayın.
4. Araç çubuğunda 'Quick Mask Mode Düzenle' ve koloni seçilir, böylece koloni tıklayın tıklayın.
5. Koloninin çevresinde noktalı çizgi koloninin çevre etrafında oturur ve içindeki emin olun. Noktalı çizgi çevre etrafında değilse, buna göre üst araç çubuğunda tolerans değeri değiştirin.
6. 'Pencere' Git menüsünde aşağı çekme ve 'Histogram' seçeneğini tıklayın.
7. Cache = 1 piksel değeri bir yere yazın. Önbellek 2 ise, '!' önbellek 1 olarak değiştirin ve sonra piksel değeri not edin.
8. 10. her çerçeve için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. Daha az toplam çerçeve, istenirse kullanılabilir.
9. Veri Photoshop ve CL-Quant yazılım kullanılarak toplanan birlikte çizilebilir. CL-Quant tarifleri dürüst iseniz, Photoshop ve CL-Quant analizi için eğrileri çok benzer (Şekil 3-5) olmalıdır.
10. CL-Quant ile geliştirilen tarifleri dürüst iseniz, diğer video verilerini güvenle uygulanabilir.
11. Bu analizin video biyoinformatik kullanarak değeri, segmentasyon, iyileştirme ve ölçme tarifleri geliştirilen ve doğrulandıktan sonra, onlar çok daha hızlı ve daha doğru bir insan daha Photoshop kullanarak analiz yapmak olacağını.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: hESC koloninin BioStation BT büyüme 48 saat boyunca çeşitli zamanlarda çerçeveler gösteren bir film şeridi. Çerçeveler 7 dakikalık aralıklarla alınmıştır.

Şekil 2: (A) Görüntü segmentasyonu tarifi kolonisi üzerinde yerleştirilen bir maske ile hESC. Enkaz ve arka alanları da bir donanım tarifi değerlendirmenin doğruluğu artırmak için gerekli olduğunu belirten maskelenir. (B) artışından sonra "A" gösterildiği gibi aynı koloni resmi yapılmıştır. Maske artık sadece koloni seçer ve gürültü seçim ortadan kalkmıştır.

Şekil 3: 48 saat içinde koloni boyutu (piksel) artış gösteren Grafik CL-Quant yazılım ve Photoshop kullanılarak belirlenir. Bu grafik araziler ham veriler ve koloniler farklı boyutlarda başlamak olduğunu göstermektedir. Bu ölçüm her iki yöntem de iyi bir anlaşma olduğunu gösterir.

Şekil 4: normalleştirme sonrası 48 saat içinde koloni boyutu yüzde göstermek için Grafik gösteren Şekil 3'te aynı veri. Bu büyüme oranları başlangıç ​​koloni boyutu ne olursa olsun ve analiz iki önlemleri benzer sonuçlar veren benzer olduğunu gösterir.

Şekil 5: Şekil 4 normalize veriler için araç gösteren grafiği Bu grafikte açıkça Video biyoinformatik (CL-Quant yazılım) ve Photoshop kullanarak ve tarifi dürüst olduğunu kurar yapılan analizler arasında iyi bir uyum gösterir. Çerçeve 325 Photoshop veri alanı hafif kriz Photoshop analizi dahil olmayan çeşitli videolar nedeniyle.

Discussion

Video biyoinformatik araçlar, video görüntüleri hızlı bir şekilde veri ayıklamak için güçlüdür. HESC koloni büyüme miktarının belirlenmesi için protokol biyolojik bir sorun video biyoenformatik bir uygulama göstermektedir. Bu yöntem, kantitatif ve bireysel hESC koloniler ifşa veri ilginç bir özelliği vardır. Video biyoinformatik tarifleri, proliferasyon, göç, apoptozis ve substrat hücre eklenti ve komşu hücrelere hücre eklenti gibi diğer hücresel işlemlerini izlemek için geliştirilebilir. Tarifler doğruluğu, Photoshop kullanılarak valide edilmiştir CL-Quant yazılımı kullanılarak geliştirilen ve gerçeğe uygun olduğu tespit edilmiştir. Uygun reçeteler geliştirmişlerdir sonra, herhangi bir kaynaktan gelen video veri çok hızlı bir şekilde analiz edilebilir. Video biyoinformatik araçları kullanarak video verilerini analiz etmek için gerekli zaman, Photoshop kullanarak elle yapılan analizi için gereken zaman önemli ölçüde daha az. Ayrıca, bilgisayarın bir analiz yapan bir insan, her seferinde bir görüntü analiz hataları ya da biraz farklı yargılar, her seferinde aynı şekilde verileri analiz olarak bilgisayar tarafından yapılan analiz, daha az hata eğilimli. Bu protokolün bir parçası olarak ele olmasa da, videolar kolonisi morfolojik değişiklikler de incelenecektir. Bu parametre tedavi grupları dahil olduğu durumlarda yararlı olacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).