Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

De subventriculaire zone En-face: Wholemount Beitsen en ependymale Flow

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

De laterale ventrikel muren bevatten de grootste germinal regio in de volwassen hersenen van zoogdieren. Traditioneel, hebben studies over neurogenese in deze regio zich op de klassieke opdeling technieken voor histologische analyse. Hier presenteren wij een alternatieve aanpak, de wholemount techniek, die een uitgebreide, en-face het oog op deze germinal regio biedt.

Abstract

De muren van de laterale ventrikels bevatten de grootste germinal regio in de volwassen hersenen van zoogdieren. De subventriculaire zone (SVZ) in deze muren is een uitgebreid bestudeerd modelsysteem voor het begrijpen van het gedrag van neurale stamcellen en de regulering van volwassen neurogenese. Traditioneel hebben deze studies vertrouwd op de klassieke opdeling technieken voor histologische analyse. Hier presenteren wij een alternatieve aanpak, de wholemount techniek, die een uitgebreide, en-face het oog op deze germinal regio biedt. In vergelijking met secties, wholemounts het behoud van de volledige cytoarchitecture en cellulaire relaties binnen de SVZ. Deze aanpak heeft onlangs onthuld dat de volwassen neurale stamcellen, of het type B1 cellen, maken deel uit van een gemengd neuroepithelium met gedifferentieerde ependymale epitheelcellen van de laterale ventrikels. Daarnaast is deze benadering is gebruikt om de vlakke polarisatie van ependymale cellen en de liquor stroom die zij genereren in het ventrikel studie. Met recente bewijs dat adulte neurale stamcellen zijn een heterogene populatie dat regionaal is opgegeven, wordt de wholemount benadering waarschijnlijk een essentieel instrument voor het begrijpen van de organisatie en parcellation van deze stamcellen niche.

Protocol

I. Voorbereiding van Glass Micropipetten gevuld met fluorescente microbolletjes voor ependymale Flow Assay (deze stappen kunnen worden overgeslagen als voorbereiding wholemounts voor kleuring doeleinden).

  1. Secure een Wiretrol 5 ul glazen capillaire buis op glas micropipet trekker en aan te passen verwarming en elektro-instellingen om pipet te trekken met een gladde, ondiepe taper.
  2. Bevestig een bron van positieve luchtdruk op het einde van de getrokken micropipet toe en laat de punt van de pipet op een metalen rooster oppervlak in een hoek van 45 ° tot een afgeschuinde tip te creëren. Positieve luchtdruk helpt bij het glas vuil uit de binnenzijde van de pipet. Reinig het einde van de schuine tip met een ethanol-bevochtigd weefsel.
  3. Onderzoek de punt van de pipet onder een microscoop met een micrometer. De tip moet een gladde schuine kant met een inwendige diameter opening van ~ 100 um. Kleinere diameters kunnen worden gebruikt, maar vaak resulteren in verstopping van de pipet met fluorescerende kralen.
  4. Backfill pipet met minerale olie tot half-vol, en steek vet-gedompeld zuiger in de achterkant van de pipet. Advance meniscus van minerale olie aan de pipetpunt door handmatig te duwen in de zuiger.
  5. Zet de micropipet en zuiger op een micromanipulator, dan schroef de micromanipulator pipet houder op een klein stationair arm met instelbare hoogte.
  6. Voren halen van de pipet met de fluorescerende microbeads oplossing, bestaande uit 50% fluorescerende microbeads voorraad-oplossing, 45% water, en 5% glycerol. Glycerol is toegevoegd aan de dichtheid van de oplossing te verhogen, zodat wanneer afgezet op de wholemount de microkorrels zinken op het oppervlak.
  7. Plaats de micromanipulator op een veilige plaats waar de naald niet per ongeluk gebroken worden en ga verder met wholemount dissectie.

II. Wholemount Dissection en fixatie

  1. Ter voorbereiding op wholemount dissectie, warme voldoende hoeveelheid van L-15 Leibovitz media tot 37 ° C. U moet ongeveer 10 ml per dier u van plan bent om te ontleden. Verzamelen ook alle benodigdheden je nodig hebt voor dissectie en fixatie door de stereomicroscoop: schaar, getande grote tang, gladde fijne tang, Sharpoint 22,5 ° microchirurgische stab mes, ontleden schotel, een papieren handdoek, Biohazard zak, en een 24 wells plaat op ijs gevuld met 4% paraformaldehyde met of zonder 0,1% Triton X-100. Triton X-100 wordt gebruikt om de oppervlaktespanning van de PFA-oplossing, waarbij de incidentie van scheren de wholemount oppervlak als onder te dompelen in deze oplossing afneemt afnemen.
  2. Giet 5-10 ml van de verwarmde media in een dissectie schotel onder een tl-stereomicroscoop. Ontleden gerechten worden bereid door het gieten van een elastisch polymeer, de zogenaamde Sylgard 184, in een 6 cm kunststof schotel en laat de polymeeroplossing remedie voor 1 week onder vacuüm, daarna goed spoelen gerechten in grote hoeveelheden water voor gebruik. Meestal laten we de gerechten in het water laten weken in een bekerglas van 1 liter voor 1 week.
  3. Het dier wordt opgeofferd door cervicale dislocatie en de kop is afgesneden.
    Opmerking: Indien gewenst, bloed kan worden van de bloedvaten door perfuseren het dier met een fysiologische zoutoplossing voorafgaand aan het ontleden van de hersenen. Dit is vooral belangrijk als het uitvoeren van chromogene immunokleuring met diaminobenzidine (DAB).
  4. Een middellijn incisie wordt gemaakt, posterior naar anterior, langs de hoofdhuid om de schedel te onthullen.
  5. Een reeks van vier bezuinigingen in de schedel worden gemaakt met de schedel te openen: een cut overspant de twee banen voorste naar de olfactorische bollen, de volgende twee bezuinigingen zijn inferieur aan de kleine hersenen en de schedel gescheiden van de schedelbasis, en de final cut loopt posterior naar anterior langs het midden van de pijlnaad.
  6. De craniale flappen worden voorzichtig teruggetrokken en de hersenen wordt gewonnen en geplaatst in het ontleden schotel.
  7. De rest van de dissectie wordt uitgevoerd onder de stereomicroscoop. Eerst worden de olfactorische bollen weg ontleed van de hersenen. Als u wenst bovendien de olfactorische bollen te onderzoeken, gewoon ze op te lossen door onderdompeling in 4% PFA 's nachts en je kan vervolgens hen voor te bereiden voor het snijden en vlekken.
  8. Verdeel de hersenen langs de Interhemisferische spleet.
  9. Een coronaalwaarts-georiënteerde cut is dan die op de achterste meest aspect van de Interhemisferische spleet, waardoor de caudaal hippocampus te worden gevisualiseerd in doorsnede.
  10. De hippocampus, die de mediale wand van de laterale ventrikel op deze positie vormt, moet vervolgens worden vrijgelaten uit de bovenliggende cortex, die het dorsale-laterale wand van de hartkamer vormen. Eerst wordt het mes ingevoegd in de kleine ventriculaire ruimte tussen de cortex en de hippocampus dorsaal, en een snede gemaakt in de cortex, waar weerspiegelt ventraal, weg van de middellijn, aan de hippocampus aan te sluiten. Na deze bezuiniging is gemaakt, kan de cortex langzaam worden gepeld uit de buurt van de hippocampus naar de laterale ventrikel overgang van dorsaal naar ventraal te onthullen. Deze manoeuvre isversnelde door het afsnijden van een wig van cortex in de hoek waar de hippocampus werd uitgebracht. Na het bereiken van de ventrale meest omvang van de laterale ventrikel op deze positie, kan u ofwel visualiseren of voelen waar de cortex weer wraps rond, dit keer als gevolg van terug mediaal, naar de hippocampus aan te sluiten. Een ander gesneden moet in deze positie volledig los van de hippocampus of mediale wand van de laterale ventrikel van de cortex of laterale wand van de laterale ventrikel.
  11. Het is dan makkelijk om de hippocampus te trekken uit de buurt van de cortex, mediaal en naar voren, om de laterale ventrikel wijd open.
  12. Blijf trek de hippocampus voorzijde met kleine bewegingen van de tang en het mes uit elkaar trekken van de mediale en laterale muren.
  13. Zodra de weerstand tegen deze terugtrekking begint toe te nemen, zijn extra bezuinigingen nodig zijn. Ten eerste, om uw blootstelling aan de laterale ventrikel te verhogen en in het bijzonder, de laterale wand en SVZ, ontleden weg de cortex. De cortex is netjes weg doorsneden door het visualiseren van de interface tussen het corpus callosum en de VZ / SVZ. Knip langs deze interface een verblijf op de callosal kant om te voorkomen dat schade aan de SVZ.
  14. Met het oog op het terugtrekken van de mediale wand weg van de laterale wand blijven, zijn er nog twee sneden nodig: een cut dorsaal, waar de laterale wand, mediale wand, en cortex alle samenkomen, en een gesneden ventraal waar de laterale wand, mediale wand, en de thalamus samenkomen. Met deze bezuinigingen gemaakt, verder zachte terugtrekken op de mediale wand laat de voorste meest omvang van de laterale ventrikel worden geopend.
  15. Een goede verlichting is van essentieel belang tijdens de gehele procedure en in het bijzonder in de volgende stap, waar de mediale en laterale wanden naar voren worden gescheiden. Op deze anterieure positie in de laterale ventrikel, de mediale wand weerkaatst en is continu met de laterale wand. Stel de verlichting zodanig dat de schaduwen tussen de twee muren deze reflectie punt, dat lijkt op een vallei tussen de twee muren te onthullen. Snijd precies in deze vallei om deze twee muren te scheiden.
  16. Tot slot, volledig bloot te leggen van de laterale wand door het verwijderen van een overhangende cortex dorsaal en de thalamus ventraal.
  17. Als voorbereiding wholemounts voor immunokleuring, zorgvuldig tot overdracht van de wholemount, ventrikel kant, uit de ontleding schotel in een 24-wells plaat gevuld met 4% PFA met of zonder 0,1% Triton-X100 voor een overnachting fixatie bij 4 ° C. Voor bevestiging-gevoelige antigenen, kan wholemounts worden vastgesteld voor een kortere periode van tijd. Ga dan naar hoofdstuk 4 op immunokleuring wholemounts.
  18. Als voorbereiding wholemounts voor ependymale flow-analyse, overdracht van de wholemount naar een schone dissectie schaal gevuld met verse, 37 ° C Leibovitz medium en gaan naar de volgende sectie.

III. Ependymale Flow analyse met behulp van TL-microbolletjes

  1. Immobiliseren de wholemount op een schone schotel ontleden met behulp van twee insect pennen, een in de thalamus en een in anterior-dorsale hoek van de wholemount.
  2. Plaats de basis van de stationaire arm die de micromanipulator naast de stereomicroscoop. Zorg ervoor dat de hoogte van de verstelbare arm is maximaal verhoogd om te voorkomen dat het breken van de naald tegen de dissectie schotel.
  3. Voorzichtig dip de punt van de naald in de media in een ependorf buis schoon te maken uit microbolletjes die aanwezig zijn op de buitenkant punt van de naald. Indien deze niet weg gereinigd, kunnen ze vervolgens worden afgezet op het oppervlak wholemout per ongeluk tijdens de naald positionering en vermindering van de algehele kwaliteit van de film.
  4. Plaats de naald op het dorsale oppervlak van de laterale wand en laat de arm om de naald te brengen in het medium. De naald moet worden verlaagd tot net boven de laterale wand.
  5. Met de naald in positie, stel de zoom en focus op de stereomicroscoop om een ​​gewenste veld te dekken. Als u het maken van een opname van de ependymale flow, begint het verwerven van foto's op dit moment.
  6. Eject ~ 5 nl van de microbeads oplossing op het oppervlak van de wholemount. Zodra de eerste bolus van kralen is verholpen het oppervlak door ependymale stroming, kunnen extra rondes van de kraal uitwerpen worden uitgevoerd.

IV. Immunokleuring Wholemounts

  1. Wholemounts ontleed voor immunokleuring zijn immersie-vaste 's nachts in 4% PFA met of zonder 0,1% Triton-X100 bij 4 ° C. Het gebruik van Triton-X100 is de voorkeur voor antigenen die deze behandeling verdragen, maar kan worden weggelaten in de gevallen waarin vlekken kwaliteit wordt verminderd door wasmiddel.
  2. De volgende ochtend, is PFA aangezogen uit de 24-well plaat en de wholemounts worden gewassen 3 keer gedurende 5 minuten in 0,1 M PBS, met of zonder 0,1% Triton-X100. Als voorheen, is het gebruik van de Triton-X100 voorkeur, maar is niet vereist, voor alle wasbeurten in dit protocol. In dit protocol, het uitwisselen van oplossingen voor de gehelemount vereist een zorgvuldige aspiratie van de oplossing van de kant van de put. Dan is het goed gevuld met oplossing met behulp van een transferpipet hoek zodanig dat de oplossing spoelt over de rand van de put, niet rechtstreeks op de wholemount. Zorg ervoor dat het ventrikel zijde van de wholemount naar boven te allen tijde te houden. Krachtige pipetteren van oplossingen zal vaak draait de wholemount. Wij geven de voorkeur aan oplossingen uit te wisselen meer dan 1 wholemount op een tijd om weefsel te voorkomen uitdroging.
  3. Na het wassen uit de PFA, zijn wholemounts geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het blokkeren van oplossing, dat 10% normaal geit of ezel serum in 0,1 M PBS, met of zonder Triton-X100. Bij gebruik van Triton-X100 voor uw kleuring, kunt u ervoor kiezen om ofwel 2% of 0,5% Triton-X100 in de blokkering oplossing te gebruiken. We maken gebruik van 2% Triton-X100 als kleuring voor antigenen die dieper antilichaam penetratie in het weefsel, zoals die antigenen in de SVZ vereisen. Echter, wanneer kleuring voor antigenen dichter gelegen bij het oppervlak van de laterale wand, zoals antigenen gevonden in de apicale oppervlak van ependymale cellen maken wij gebruik van 0,5% Triton-X100. Daarnaast kunnen Triton-X100 worden weggelaten voor cel-oppervlak of andere antigenen die worden verwijderd of veranderd door afwasmiddel.
  4. Verwijder vervolgens de blockingbuffer en voeg primaire antilichamen verdund in dezelfde blokkeren oplossing en incubeer gedurende 24 of 48 uur bij 4 ° C. Keuze van de incubatietijd is afhankelijk van het antigeen, vergelijkbaar met de keuze van 0,5% of 2% Triton. Voor antigenen op het oppervlak van de wholemount, 24 uur incubatie volstaat. Echter, voor antigenen ligt dieper, zoals in de SVZ, 48 uur incubatieperiode betere resultaten.
    Bijvoorbeeld, om de apicale oppervlak en basale lichamen van epitheelcellen van de laterale ventrikel wand studie, vlek met antilichamen tegen β-catenine, de celmembraan label, en γ-tubuline, het basale lichamen label. Verdunnen muis anti-β-catenine antistoffen (1:500) en konijn anti-γ-tubuline antilichamen (1:1000) in 0,1 M PBS dat 10% normaal geit serum en 0,5% Triton-X100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 24 uur.
    Om vlekken op de volwassen neurale stamcellen, of het type B1 cellen, vlekken op de laterale wand met GFAP antilichaam. Verdunnen muis anti-GFAP antilichamen (1:500) in 0,1 M PBS dat 10% normaal geit serum en 2% Triton-X100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 48 uur.
  5. Primaire antilichamen zijn afgewassen in eerste instantie door twee snelle spoelingen in PBS, met of zonder 0,1% Triton-X100. Doe dan 3 extra wasbeurten voor 20 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verdunnen secundaire antilichamen in dezelfde blokkeren oplossing die wordt gebruikt voor de primaire antilichamen en toe te voegen aan wholemounts aan voor dezelfde tijdsduur incubeer als voor primaire antilichamen bij 4 ° C.
    Bijvoorbeeld, voor kleuring voor β-catenine en γ-tubuline: verdunnen Alexa Fluor 488 geit anti-muis antilichamen (1:400, erkent muis anti-β-catenine) en Alexa Fluor 594 geit anti-konijn antilichamen (1:400, erkent konijn anti-γ-tubuline) in 0,1 M PBS dat 10% normaal geit serum en 0,5% Triton-X100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 24 uur.
    Voor GFAP immunokleuring: verdunnen Alexa Fluor 488 geit anti-muis antilichamen (1:400, erkent muis anti-GFAP) in 0,1 M PBS dat 10% normaal geit serum en 2% Triton-X100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 48 uur.
  7. Secundaire antilichamen worden gewassen uit de wholemount met dezelfde wasbeurten uitgevoerd voor primaire antilichamen.
  8. Indien gewenst, kan nucleaire contra-kleuring uitgevoerd worden op dit moment door het incuberen in DAPI verdund in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en daarna te wassen een keer in PBS.

V. Montage Immunostained Wholemounts op dia's voor confocale microscopie

  1. Voor hoge-resolutie confocale imaging, na immunokleuring de wholemounts moest worden sub-ontleed om alleen de laterale wand van de laterale ventrikel te behouden als een stukje weefsel 200-300 um dik. Het scheiden van de laterale wand van de onderliggende striatum maakt het mogelijk om worden gemonteerd op een glijbaan en bedekt met een dekglaasje in een vlakke manier.
  2. Keer terug naar de stereomicroscoop met immunostained wholemounts en de volgende gereedschappen en apparatuur: glad fijne tang, Sharpoint 22,5 ° microchirurgische stab mes, ontleden schotel, microscoop dia's en dekglaasjes, 0,1 M PBS, en Aquamount montage medium.
  3. Breng de wholemount van de 24-wells plaat aan de ontleden schaaltje met 0,1 M PBS voorzichtig om het ventrikel kant te houden.
  4. De eerste, volledig verwijderen van de dorsale cortex van de wholemount van achterste naar voorste door te snijden precies langs de lijn waar het corpus callosum voldoet aan de laterale wand. Dit wordt erkend als de interface tussen de callosal witte stof en de roze-verschijnen SVZ.
  5. Maak vervolgens een lang horizontaal georiënteerde dwars door de ventrale aspect van de wholemount. Dit snijvlak zal zorgen voor een platform waarop u kunt stabilize de wholemount tijdens de volgende stap in de dissectie.
  6. Met het dorsale oppervlak van de wholemount naar boven, zult u in staat om de dikte van de SVZ visualiseren van anterior naar posterior langs de laterale wand. Merk op dat deze visie werd mogelijk gemaakt door de eerste verwijdering van de cortex waardoor de onderliggende striatum en SVZ te zien. De SVZ is geïdentificeerd als de dunne band van weefsel dat zich uitstrekt van de ventriculaire oppervlak naar het striatum. De SVZ heeft een homogene roze uitstraling, terwijl het striatum is geïnfiltreerd door koorden van witte stof. Merk op dat de SVZ is naar voren dikker en wordt geleidelijk dunner naar achteren.
  7. Zodra u de interface van de SVZ en het striatum geïdentificeerd, zorgvuldig gaan knippen op deze interface op de voorste meest aspect van de laterale wand, het bevorderen van de mes uit dorsale naar ventraal. Om precies dit te doen, het stabiliseren van de wholemount met uw tang gebruikt als twee pinnen. U kunt ook gebruik maken van uw tang om iets draait u de wholemount om het mes oprukkende van dorsaal naar ventraal over de laterale wand te visualiseren. De sleutel tot deze dissectie is voor de daaruit voortvloeiende stukje van het weefsel te zeer vlak. Dit betekent dat als je slice uit de SVZ van anterior naar posterior in de laterale wand, de oriëntatie van de bezuinigingen die u moet blijven parallel aan de ventriculaire oppervlak te allen tijde.
  8. Vergeet niet dat meer naar achter, de SVZ wordt dunner. In plaats van dunner uit uw dissectie af te snijden alleen de SVZ op dit punt, is het belangrijk dat als je verder naar achteren, de dikte van het weefsel opengesneden blijft hetzelfde. Dit zal ervoor zorgen dat het stukje van het weefsel zul je vervolgens monteren plat is.
  9. Na het volledig scheiden van de laterale wand van de onderliggende striatum, verwijder zorgvuldig alle andere omliggende weefsels van deze lont die geen deel uitmaken van de ventriculaire wand.
  10. Dan pikken deze splinter van onderaf met behulp van uw pincet en plaats het in het midden van een microscoop dia. Breng een paar druppels aquamount direct op de wholemount en voorzichtig plaats een dekglaasje gecentreerd over dit, probeer niet te bellen te introduceren op het oppervlak van het weefsel. Het gewicht van de dia zal dat de aquamount verspreidt gelijkmatig te verzekeren en zal een verfijnde afvlakking van de laterale wand. De hoeveelheid aquamount gebruikt en de grootte van het dekglaasje afhankelijk van de leeftijd van het weefsel wordt ontleed. Voor de embryonale en vroege postnatale weefsels, geven we de voorkeur een druppel aquamount en een 22 "x 30" dekglaasje aan. Zwaardere dekglaasjes kunnen verstoren het weefsel en nog veel meer aquamount zal interfereren met de beeldkwaliteit, omdat de confocale laser zal zijn minder goed in staat om een ​​dun laagje aquamount wonen tussen het dekglaasje en het weefsel oppervlak doordringen. Voor latere postnatale en volwassen weefsels, gebruiken we vier druppels van aquamount en een 24 "x 60" dekglaasje aan.
  11. De dia's worden vervolgens opgeslagen flat in een dia boek bij 4 ° C gedurende 1-2 dagen voor de beeldvorming, zodat de dekglaasjes om zich te vestigen.

Representatieve resultaten

Wholemount benaderingen hebben een aantal belangrijke inzichten in de germinale activiteit van de volwassen SVZ. Het netwerk van ketens van migrerende jonge neuronen in de SVZ werd voor het eerst waargenomen na wholemounts van de laterale wand van de laterale ventrikel werden immunostained met antilichamen tegen polysialylated neurale cel adhesie molecuul (PSA-NCAM) 1. Deze ketens van het migreren van neuroblasts kan ook worden gezien na immunokleuring wholemounts met doublecortin antilichamen (figuur 1). Opmerkelijk is dat het netwerk van ketens is een stereotype patroon, met twee algemene stromen van cellen, een loopt dorsaal over en een ventraal draaien rond de hechting punt. Wholemounts van de SVZ ook een uitgebreid overzicht van de proliferatieve activiteit van voorlopercellen in deze regio, zoals te zien is met Ki67 kleuring in figuur 2. Interessant is dat twee recente studies suggereren een nauwe interactie tussen delende cellen SVZ en de lokale vasculatuur 2,3 (figuur 2).

Bij het onderzoek onder hoge vermogen confocale microscopie, de en-face te bekijken door wholemounts zorgt voor een uniek perspectief van de apicale oppervlakte van epitheelcellen van de ventriculaire systeem. Dit en-face perspectief heeft onlangs onthuld dat SVZ type B1 cellen, de volwassen neurale stamcellen, maken deel uit van een gemengd neuroepithelium met niet-delende cellen gedifferentieerde ependymale 4. De apicale oppervlakte van het type B1 cellen contact op met de laterale ventrikel en is omgeven door grote apicale oppervlakte van ependymale cellen in een pinwheel configuratie (figuur 3, pijlen geven B1 apicale oppervlak). Bovendien heeft nauwgezet onderzoek van de apicale oppervlak van ependymale cellen is gebleken dat de translationele positie en rotatie-oriëntatie van hun basale lichamen zijn indicatoren van hun vlakke polariteit 5. Ependymale cel basale bosterft zijn geclusterd in een patch op het apicale oppervlak. Deze patch wordt verplaatst van het centrum van de apicale oppervlak in de stroomafwaartse "richting ten opzichte van CSF stroom (translationeel polariteit); binnen deze patch, iedere basale lichaam is gedraaid om de lengteas zodanig, dat de basale voet, een accessoire van de basale lichaam, wijst in de richting van de stroming (rotatie polariteit). Naburige ependymale cellen hebben hun basale lichaam georiënteerd in dezelfde richting. Belangrijk is, kan videomicrographs van de ependymale stroom test worden gebruikt om de stroom direct te vergelijken in een specifieke regio van de laterale wand om de oriëntatie van ependymale cel basale instellingen in die regio (figuur 4).

Naast het leveren van een panoramisch perspectief van de grootste germinal regio in het volwassen brein, met een hogere macht imaging, wholemounts staat een meer volledige en gedetailleerde analyse van individuele cellulaire morfologieën in de SVZ. Hoog vermogen confocale beeldvorming van GFAP immunokleuring op wholemounts heeft aangetoond dat het type B1 cellen, in aanvulling op hun korte ventrikel-contact apicale proces, een lang basale proces in contact met de bloedvaten (figuur 5) 4. Dit cytoarchitecture was niet eerder op prijs gesteld in coronale secties, omdat het basale proces loopt meestal parallel aan de ventriculaire wand. Serial snijden snijdt daarom individuele cellen in kleine stukjes, waardoor het bijna onmogelijk om een ​​cel s compleet morfologie te reconstrueren, of om de relatie te begrijpen aan andere soorten cellen in de SVZ. De wholemount aanpak heeft een aantal voordelen ten opzichte van klassieke opdeling technieken, zowel in het leveren van een panoramisch uitzicht met een laag vermogen microscopie en een complete perspectief van de individuele cellen met een hoog vermogen microscopie. Deze techniek blijft een belangrijke aanvulling op de toekomstige studies van deze volwassen hersenen germinal zone.

Figuur 1
Figuur 1. Netwerk van trekkende neuronale ketens in de SVZ. Betegelde confocale beelden te reconstrueren een laterale wand wholemount dat was gekleurd met antilichamen tegen doublecortin, die migreren neuroblasts labels in de SVZ. Er zijn twee algemene stromen van migratie, een loopt dorsaal over en een ventraal draaien rond de hechting punt, aangegeven met een asterisk (*). Pijlen geven anterior (een) en dorsale (d) richtingen. Schaal bar = 1 mm.

Figuur 2
Figuur 2. Verband tussen de bloedvaten en de delende cellen in de SVZ. Deze laterale wand wholemount was immunostained met antilichamen voor Ki67, om delende cellen in het groen, en antistoffen tegen muis label immunoglobulinen, aan de bloedvaten in het rood label. Omdat dit wholemount was niet geperfuseerd met zoutoplossing vóór de kleuring, de endogene muis IgG-moleculen blijven binnen de bloedvaten en worden gekleurd door secundaire anti-muis antilichamen. Recent onderzoek wijst erop dat het verdelen van SVZ precursoren (groen) bevinden zich in de nabijheid van de bloedvaten (rood) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. Pijlen geven anterior (een) en dorsale (d) richtingen. Schaal bar = 1 mm.

Figuur 3
Figuur 3. De apicale oppervlakte van ventrikel-contact cellen op de laterale wand. Hoog vermogen confocale beeld van een wholemount immunostained voor β-catenine, aan celmembranen label in groen en γ-tubuline, het basale lichamen label in het rood, onthult de vlakke organisatie van deze epitheelcellen. Type B1 cellen, de volwassen neurale stamcellen, hebben een kleine apicale oppervlak met een enkele basale lichaamstemperatuur, aangegeven met pijlen. De apicale oppervlak van deze cellen is omgeven door de grote apicale oppervlak van ependymale cellen in een pinwheel configuratie. Ependymale cellen hebben vlakke polen aangegeven door de positie van hun meerdere basale lichamen op het apicale oppervlak. Aangrenzende ependymale cellen hebben hun basale lichaamstemperatuur clusters zich aan dezelfde kant van het apicale oppervlak (naar beneden en naar links in dit gebied), wat overeenkomt met de richting van de liquorcirculatie {Mirzadeh, 2010 # 6573}. Schaalbalk = 10 micrometer.

Figuur 4
Figuur 4. De ependymale stroom test. Samengesteld beeld gemaakt door het samenvoegen van 100 opeenvolgende beelden uit een film gemaakt tijdens de ependymale stroom test. TL-microkorrels gedeponeerd rug en achterste tot de hechting gebied werden aangedreven door ependymale cilia in twee georiënteerd stromen, een over en een onder de hechting, naar het foramen van Monro. Deze gerichte stroom onthult de functionele vlakke polariteit van ependymale cellen. Iedere stroom lijn geeft de positie van een enkele kraal aan opeenvolgende punten in de tijd. Schaalbalk = 0,5 mm.


Figuur 5. GFAP + type B1 cellen hebben een lange basale vezel met end-voeten op de bloedvaten. Maximale projectie van een hoog vermogen confocale stack genomen van een laterale wand wholemount immunostained met GFAP antilichamen tegen SVZ astrocyten label. Deze vlekken labels volwassen neurale stamcellen, of het type B1 cellen, die een apicale eindigt op de ventriculaire oppervlak hebben, en zoals hier wordt getoond, een lange GFAP + basale vezel die eindigt op de bloedvaten (pijlen). Bloedvaten zijn hier gekleurd, omdat het secundaire antilichaam wordt gebruikt om te visualiseren muis anti-GFAP antilichamen herkennen endogeen muis IgG in het vatenstelsel. Schaalbalk = 50 pm.

Discussion

De meeste studies van neurogenese in ventriculaire en subventriculaire zones hebben vertrouwd op de klassieke opdeling technieken om de microanatomy en cellulaire relaties in deze regio's te onderzoeken. Hier beschrijven we een alternatieve techniek, voor het eerst gebruikt om het netwerk van trekkende ketens van neuroblasts gegenereerd in de SVZ 1 te analyseren, vervolgens gebruikt om de regeneratie van de SVZ stamvader bevolking onderzoek na anti-mitotische behandeling 6, en de meest recent gebruikte om de precieze apicale studie en basale cel-cel interacties van de volwassen SVZ neurale stamcellen 2,3,4. Interessant is dat deze techniek bleek dat de neurale stamcellen, of het type B1 cellen, van de volwassen SVZ maken deel uit van een gemengd neuroepithelium met gedifferentieerde niet-delende cellen ependymale. Nl-face beeldvorming met behulp wholemounts heeft aangetoond dat deze gemengde neuroepithelium pinwheel architectuur, bestaande uit de apicale uitgangen van het type B1 cellen omgeven door grote apicale oppervlak van ependymale cellen 4 heeft. Dit en-face onderzoek heeft verduidelijkt ons begrip van het geslacht van neurale stamcellen in embryonale en volwassen hersenen als bestaande uit cellen met apicale eindigen bij de ventrikel oppervlak en basale processen contact met een vasculaire niche. Deze bevindingen zou zijn geweest bijna onmogelijk met behulp van klassieke snijden technieken. Wholemounts vergemakkelijken ook de identificatie van neurale stamcellen via hun ventrikel-contact apicale proces. Naarmate er meer specifieke merkers voor deze stamcellen worden gevonden, zal wholemounts worden een integraal onderdeel van het identificeren en analyseren van neurale stamcellen gedrag.

Wholemounts van de laterale ventrikel muren ook de ideale perspectief voor het bestuderen van de vlakke polariteit van ependymale cellen. Ependymale cellen zijn multiciliated epitheelcellen van de hartkamers die functie CSF voort te bewegen op een gecoördineerde wijze. Met de wholemount techniek, wordt de gehele ependymale epitheel blootgesteld en-gezicht en kunnen worden gekleurd en uitvoerig bestudeerd vanuit de voorste tot achterste en dorsaal van ventrale grenzen. Bovendien ependymale stroom testen uitgevoerd op scherp ontleed, live wholemounts robuust tonen de vlakke gepolariseerde stroom gegenereerd door ependymale trilharen. Recent werk met behulp van wholemount aanpak heeft blootgelegd cellulaire determinanten van deze ependymale vlakke polariteit 5. Interessant is dat wholemount studies ook gesuggereerd dat ependymale gegenereerde CSF stroom gradiënten van chemorepellents dat de migratie van jonge neuronen gids in de SVZ 7 vaststelt. Wholemount benaderingen die in eerste instantie aangegeven het netwerk van de trekkende neuronale kettingen zijn daarom blijven inzichten in de mechanismen reguleren van keten migratie.

Analyse van de VZ en SVZ door wholemount imaging voegt een nieuwe benadering voor zowel de toekomstige studies en een manier om ons begrip van de bestaande studies te verduidelijken. Bijvoorbeeld, een recente studie suggereerde dat neurale stamcellen in de volwassen SVZ waren CD133 + / CD24-cellen in contact met het ventrikel 8. Op basis van hun immunokleuringen in secties, deze auteurs beweerd dat deze cellen werden een subpopulatie van multiciliated ependymale cellen. Echter, in onze studie het gebruik van de wholemount benadering, die een meer uitgebreid overzicht van de gehele ependymale epitheel geeft, vonden we dat allemaal ependymale cellen te uiten CD24 en de enige ventrikel-contact cellen die werden CD133 + / CD24-waren een subset van het type B1 cellen 4. Bovendien is de wholemount techniek belooft om bruikbaar te zijn in toekomstige studies naar het onlangs beschreven mozaïek organisatie van de neurale stamcellen in het volwassen brein 9. Verschillende studies hebben aangetoond dat neurale stamcellen in het volwassen brein niet een homogene bevolking, maar zijn regionaal gespecificeerd en normaal gesproken produceren alleen bepaalde subtypen van de bulbus olfactorius interneuronen. Deze studies hebben voorgesteld dat de verschillende subpopulaties van neurale stamcellen kan ofwel worden onderscheiden door de expressie van specifieke transcriptiefactoren 10,11,12,13,14 en / of door hun regionale lokalisatie langs de rug-buik-en anterior-posterior mate van de laterale wand 9,15,16. Naarmate er meer moleculaire merkers van de regionaal gespecificeerde subpopulaties van adulte neurale stamcellen zijn geïdentificeerd, moet wholemount imaging bieden een uitgebreid overzicht van de parcelation van deze verschillende domeinen voorlopercellen langs de ventriculaire wand.

De wholemount dissectie en beeldvormende technieken die hier gepresenteerd kan ook worden gebruikt om de ventriculaire wand te analyseren in de embryo. De dissectie van de embryonale laterale wand is uitgevoerd, stap-voor-stap, op dezelfde manier. Er zijn slechts kleine verschillen in de moeilijkheidsgraad, de embryonale ventrikels zijn relatief groter maken van de dissectie gemakkelijker, maar het weefsel is zachter maken van manipulatie moeilijker. In het bijzonder kan een vergelijkbare blootstelling van de laterale ventrikel worden gebruikt in Embryos van de corticale wand van de hartkamer te corticale neurogenese studeren ontleden. Recente gegevens wijzen erop dat asymmetrische centrosoom erfenis onderhoudt radiale glia op de ventriculaire oppervlak tijdens de corticale neurogenese 17. Nl-face beeldvorming van radiale gliale apicale oppervlakken kunnen geven inzicht in hoe centrosomen binnen deze delende cellen zijn asymmetrisch geërfd.

Zoals bij de meeste technieken, vooral die waarbij precieze handigheid, meesterschap vereist oefening. Er zijn echter een paar elementen in de dissectie die essentieel zijn voor betere resultaten: 1) verlichting aanpassen van de verlichting van het monster om schaduwen te creëren van onschatbare waarde contrast tijdens de dissectie van weefsel die anders is betrekkelijk homogeen zijn, 2) het gebruik van de tang, zoals twee insect pinnen de tang in deze techniek worden nooit gebruikt voor het knijpen samen of pick-up weefsel, maar worden gebruikt als wendbaar pinnen die kunnen worden voortdurend aangepast om het weefsel te stabiliseren tijdens het snijden, 3) een balans van zachte terugtrekken en snijden van het mes niet alleen worden gebruikt voor het snijden, maar ook om lichte terugtrekken bieden aan de mediale en laterale muren scheiden, te herinneren dat het merendeel van deze dissectie feitelijk wordt uitgevoerd door middel van zachte terugtrekken met slechts intermitterende snijden.

Acknowledgments

Werk ondersteund door de NIH subsidie ​​HD-32116, de Sandler Family Foundation ondersteunen, The John Bowes Stem Cell Fonds, MEXT, MHLW, en HFSP. ZM ondersteund door de Stichting Carlos Baldoceda en UCSF Krevans Fellowship. AA-B. houdt de Heather en Melanie Muss leerstoel.

References

  1. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).
  2. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  3. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  4. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  5. Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).
  6. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).
  7. Sawamoto, K. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311, 629-632 (2006).
  8. Coskun, V. CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).
  9. Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. Science. 317, 381-384 (2007).
  10. Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb. J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).
  11. Waclaw, R. R. The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons. Neuron. 49, 503-516 (2006).
  12. Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).
  13. Kohwi, M. A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors. J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).
  14. Hack, M. A. Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis. Nat Neurosci. (2005).
  15. Ventura, R. E., Goldman, J. E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).
  16. Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns. PLoS Biol. 5, e300 (2007).
  17. Wang, X. Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors. Nature. 461, 947-955 (2009).
De subventriculaire zone En-face: Wholemount Beitsen en ependymale Flow
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter