Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

Les murs du ventricule latéral contiennent la plus grande région germinales dans le cerveau adulte des mammifères. Traditionnellement, les études sur la neurogenèse dans cette région se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement pour l'analyse histologique. Nous présentons ici une approche alternative, la technique wholemount, qui fournit une approche globale, en vue de face de cette région germinales.

Abstract

Les parois des ventricules latéraux contiennent la plus grande région germinales dans le cerveau adulte des mammifères. La zone sous-ventriculaire (SVZ) dans ces murs est un système modèle largement étudiés pour comprendre le comportement des cellules souches neurales et la régulation de la neurogenèse adulte. Traditionnellement, ces études se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement pour l'analyse histologique. Nous présentons ici une approche alternative, la technique wholemount, qui fournit une approche globale, en vue de face de cette région germinales. Comparé à des sections, des échantillons entiers de préserver la cytoarchitecture complète et les relations cellulaires dans le SVZ. Cette approche a récemment révélé que les cellules souches adultes de neurones, ou cellules de type B1, font partie d'un neuroépithélium mélangé avec des cellules différenciées épendymaires tapissant les ventricules latéraux. En outre, cette approche a été utilisée pour étudier la polarisation planaire des cellules épendymaires et l'écoulement du liquide céphalorachidien qu'ils génèrent dans le ventricule. Avec des preuves récentes que cellules souches neurales adultes constituent une population hétérogène qui est régionalement spécifié, l'approche wholemount sera probablement un outil essentiel pour comprendre l'organisation et parcellisation de ce créneau de cellules souches.

Protocol

I. Préparation de micropipettes de verre rempli de microbilles fluorescentes pour Assay flux épendymaire (ces étapes peuvent être sautées si la préparation des échantillons entiers à des fins de coloration uniquement).

  1. Fixer un tube de 5 ul Wiretrol capillaire en verre sur du verre micropipette extracteur et régler les paramètres de chauffage et électrovannes pour tirer pipette avec une surface lisse, conique peu profonde.
  2. Attacher une source de pression d'air positive sur l'extrémité de la micropipette tiré et abaissez doucement la pointe de la pipette sur une surface de grille métallique à un angle de 45 ° afin de créer un embout biseauté. Pression d'air positive aide à dégager les débris de verre de l'intérieur de la pipette. Nettoyer l'extrémité de la pointe en biseau avec un mélange éthanol-humidifiées tissus.
  3. Examiner la pointe de la pipette sous un microscope avec un micromètre. La pointe doit avoir un biseau en douceur avec un diamètre interne de l'ouverture ~ 100 um. Les petits diamètres peuvent être utilisés mais souvent entraîner l'obstruction de la pipette avec des perles fluorescentes.
  4. Remblai pipette d'huile minérale jusqu'à moitié plein, puis insérez-la graisse plongé plongeur dans le dos de la pipette. Ménisque avance de l'huile minérale à l'extrémité de la pipette manuellement en appuyant sur le piston.
  5. Fixez la micropipette et le piston sur un micromanipulateur, puis visser le porte-pipette micromanipulateur sur un petit bras stationnaire avec hauteur réglable.
  6. À chargement frontal de la pipette avec la solution microbille fluorescente, composée de solution à 50% des stocks de microbilles fluorescentes, 45% d'eau, et 5% de glycérol. Le glycérol est ajouté pour augmenter la densité de la solution de sorte que lorsque déposée sur la wholemount microbilles couler sur la surface.
  7. Placez le micromanipulateur dans un endroit sûr où l'aiguille ne sera pas accidentellement cassé et procéder à la dissection wholemount.

II. Dissection Wholemount et fixation

  1. Pour se préparer à une dissection wholemount, la quantité suffisante de chaleur L-15 des médias Leibovitz à 37 ° C. Vous aurez besoin d'environ 10 ml par animal que vous prévoyez à disséquer. Également recueillir toutes les fournitures dont vous aurez besoin pour la dissection et la fixation par le stéréomicroscope: ciseaux, pince à dents grandes, lisses pinces fines, Sharpoint 22,5 ° couteau couteau de microchirurgie, plat de dissection, serviette en papier, sac pour matières contaminées, et une plaque à 24 puits sur la glace rempli de paraformaldéhyde à 4%, avec ou sans 0,1% de Triton X-100. Triton X-100 est utilisé pour diminuer la tension superficielle de la solution de l'IFP, ce qui diminue l'incidence de la tonte de la surface quand il wholemount plongeant dans cette solution.
  2. Verser 5-10 ml de la presse dans un plat réchauffé dissection placée sous un stéréomicroscope fluorescentes. Disséquer les plats sont préparés en versant une polymère élastique, appelé Sylgard 184, dans un plat en plastique de 6 cm et en laissant la guérison solution de polymère pour 1 semaine sous vide, puis soigneusement rincer la vaisselle dans les grands volumes d'eau avant utilisation. Habituellement, nous laissons les plats tremper dans l'eau dans un bécher de 1 L pour 1 semaine.
  3. L'animal est sacrifié par dislocation cervicale et la tête est coupée.
    Note: Si désiré, le sang peut être effacé de la vascularisation en perfusant l'animal avec une solution saline normale avant de disséquer le cerveau. Ceci est particulièrement important si vous effectuez immunomarquage avec chromogène diaminobenzidine (DAB).
  4. Une incision médiane est faite, arrière en avant, le long du cuir chevelu pour révéler le crâne.
  5. Une série de 4 coupes dans le crâne sont faites pour ouvrir le crâne: une coupe s'étend sur les deux orbites antérieure vers les bulbes olfactifs, les deux prochaines coupes sont inférieurs au cervelet et séparer le crâne de la base du crâne, et le final cut fonctionne postérieure au long de la suture antérieure mi-sagittale.
  6. Les volets crâniens sont doucement rétracté et le cerveau est extrait et placé dans le plat à dissection.
  7. Le reste de la dissection est effectuée sous la loupe binoculaire. Tout d'abord, les bulbes olfactifs sont disséqués loin du cerveau. Si vous souhaitez de plus pour examiner les bulbes olfactifs, il suffit de les fixer par immersion dans 4% PFA durant la nuit et vous pouvez ensuite les préparer pour la coupe et la coloration.
  8. Diviser le cerveau le long de la fissure interhémisphérique.
  9. Une coupe coronaire orientée est alors pris à la face postérieure-la plupart de la fissure interhémisphérique, permettant l'hippocampe caudale pour être visualisées en coupe.
  10. L'hippocampe, qui forme la paroi interne du ventricule latéral à ce poste, doit ensuite être libéré par le cortex sus-jacente, qui forme la paroi dorso-latérale du ventricule. Tout d'abord, le couteau est inséré dans l'espace ventriculaire petite entre le cortex et l'hippocampe dorsal, et une coupe est faite dans le cortex où elle reflète le ventre, loin de la ligne médiane, à rejoindre l'hippocampe. Après cette coupe est faite, le cortex peut être lentement décollé de l'hippocampe pour révéler le ventricule latéral du déplacement dorsal au bord ventral. Cette manoeuvre estaccéléré en coupant un coin du cortex sur le coin où l'hippocampe a été libéré. Après avoir atteint l'ampleur ventrale plus du ventricule latéral à cette position, vous pouvez soit visualiser ou sentir où le cortex enveloppements nouveau autour, cette fois-ci renvoyant médialement, pour rejoindre l'hippocampe. Une autre coupe doit être faite dans cette position pour libérer complètement l'hippocampe ou paroi interne du ventricule latéral du cortex ou paroi latérale du ventricule latéral.
  11. Il sera alors facile de tirer de l'hippocampe loin du cortex, dedans et en avant, pour ouvrir le ventricule latéral largement.
  12. Continuer à tirer doucement vers l'avant de l'hippocampe à l'aide de petites touches de la pince et un couteau pour retirer les murs médial et latéral de l'autre.
  13. Une fois la résistance à cette rétractation commence à augmenter, des réductions supplémentaires sont nécessaires. D'abord, pour augmenter votre exposition au ventricule latéral et en particulier, la paroi latérale et la SVZ, disséquer l'écart du cortex. Le cortex est proprement disséqué en visualisant l'interface entre le corps calleux et du VZ / SVZ. Il suffit de couper le long de cette interface en restant sur le côté du corps calleux pour éviter d'endommager le SVZ.
  14. Afin de continuer à se rétracter la paroi médiale du mur latéral, deux coupes supplémentaires sont nécessaires: un coupé dorsalement où la paroi latérale, la paroi médiale, et le cortex convergent tous, et une coupe ventralement où la paroi latérale, paroi interne, et le thalamus convergent. Avec ces coupures, la rétraction encore doux sur la paroi interne permet la mesure antérieure la plus-du ventricule latéral pour être ouvert.
  15. Un éclairage adéquat est essentiel pendant toute la procédure et en particulier dans l'étape suivante où les murs médial et latéral sont séparés avant. À cette position antérieure dans le ventricule latéral, la paroi interne reflète en arrière et se continue avec la paroi latérale. Réglez l'éclairage tels que les ombres projetées entre les deux parois révéler ce point de réflexion, qui apparaît comme une vallée entre les deux parois. Découpé exactement dans cette vallée de séparer ces deux murs.
  16. Enfin, complètement exposer la paroi latérale en supprimant toute cortex surplombant dorsalement et ventralement le thalamus.
  17. Si la préparation des échantillons entiers d'immunomarquage, soigneusement transférer le wholemount, côté place du ventricule, du plat de la dissection dans une plaque de 24 puits rempli de 4% en PFA avec ou sans 0,1% de Triton-X100 pour une fixation nuit à 4 ° C. Pour la fixation des antigènes sensibles, échantillons entiers peuvent être fixés pour des périodes plus courtes. Ensuite, passez à la section 4 sur échantillons entiers immunomarquage.
  18. Si la préparation des échantillons entiers d'analyse des flux épendymaires, le transfert de la wholemount à un plat de dissection propre rempli avec des produits frais, 37 ° C moyenne Leibovitz et passez à la section suivante.

III. Analyse des flux utilisant des microbilles fluorescentes épendymaire

  1. Immobiliser le wholemount sur une vaisselle propre dissection utilisant 2 broches d'insectes, l'un dans le thalamus et l'autre en antéro-dorsale coin de la wholemount.
  2. Placez la base du bras fixe maintenant le micromanipulateur à côté de la loupe binoculaire. Assurez-vous que la hauteur du bras réglable est maximalement surélevée pour éviter de casser l'aiguille contre le plat de dissection.
  3. Soigneusement trempe le bout de l'aiguille dans les médias dans un tube Ependorf pour nettoyer microbilles qui sont présents sur le bout extérieur de l'aiguille. Si elles ne sont pas nettoyées loin, ils peuvent ensuite être déposée sur la surface wholemout par inadvertance pendant l'aiguille de positionnement et de réduire la qualité globale du film.
  4. Placez le bout de l'aiguille sur la surface dorsale de la paroi latérale et abaisser le bras pour amener le bout de l'aiguille dans le milieu. L'aiguille doit être abaissée jusqu'à ce qu'il soit juste au-dessus de la surface du mur latéral.
  5. Avec l'aiguille en position, régler le zoom et le focus sur le stéréomicroscope pour couvrir un champ désiré. Si vous allez faire un enregistrement du flux épendymaires, commencer à acquérir des images à cette époque.
  6. Ejecter ~ 5 nl de la solution de microbilles sur la surface de l'wholemount. Une fois le bolus initial de perles a été effacée de la surface par écoulement épendymaires, des tours supplémentaires d'éjection de billes peut être effectuée.

IV. Échantillons entiers Immunocoloration

  1. Échantillons entiers sont disséqués pour l'immunocoloration immersion fixe la nuit dans PFA 4%, avec ou sans 0,1% de Triton-X100 à 4 ° C. L'utilisation de Triton-X100 est préféré pour des antigènes qui tolèrent ce traitement, mais peuvent être laissés de côté dans le cas où la qualité de la coloration est diminuée par un détergent.
  2. Le lendemain matin, l'IFP est aspiré de la plaque de 24 puits et les échantillons entiers sont lavées 3 fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS 0,1 M avec ou sans 0,1% de Triton-X100. Comme précédemment, l'utilisation de Triton-X100 est préférable, mais pas obligatoire, pour tous les lavages dans ce protocole. Tout au long de ce protocole, d'échanger des solutions sur l'ensemblemontage nécessite une aspiration prudente de la solution du côté du puits. Ensuite, le puits est rempli avec une solution en utilisant une pipette de transfert à angle tel que la solution se lave sur le côté du bien, pas directement sur le wholemount. Prenez soin de garder le côté ventricule du wholemount face à tout moment. Pipetage vigoureuse des solutions seront souvent retourner le wholemount. Nous préférons pour échanger des solutions de plus de 1 wholemount à la fois pour empêcher le tissu de sécher.
  3. Après lavage de la PFA, échantillons entiers sont incubés pendant 1 heure à température ambiante dans une solution de blocage, contenant 10% ou de sérum de chèvre normal âne dans 0,1 M PBS, avec ou sans Triton-X100. Si vous utilisez Triton-X100 pour votre coloration, vous pouvez choisir d'utiliser soit 2% ou 0,5% de Triton-X100 dans la solution de blocage. Nous utilisons 2% de Triton-X100 quand coloration pour les antigènes qui nécessitent une pénétration plus profonde des anticorps dans les tissus, comme ceux des antigènes situés dans le SVZ. Toutefois, lorsque coloration pour les antigènes situés près de la surface de la paroi latérale, comme les antigènes trouvés dans la surface apicale des cellules épendymaires, nous utilisons 0,5% de Triton-X100. En outre, le Triton-X100 peut être laissé de côté pour les cellules de surface ou d'autres antigènes qui sont supprimées ou modifiées par le détergent.
  4. Ensuite, retirez la solution de blocage et ajouter anticorps primaire dilué dans la même solution de blocage et incuber pendant 24 ou 48 heures à 4 ° C. Choix de la période d'incubation dépend de l'antigène, similaire au choix de 0,5% ou 2% de Triton. Pour les antigènes situés sur la surface de la wholemount, suffit d'incubation de 24 heures. Cependant, pour des antigènes situés plus profondément, comme dans le SVZ, les périodes d'incubation 48 heures de fournir de meilleurs résultats.
    Par exemple, pour étudier la surface apicale et corps basaux des cellules tapissant la paroi du ventricule latéral, coloration avec des anticorps à β-caténine, à l'étiquette de la membrane cellulaire, et γ-tubuline, d'étiqueter les organismes de base. Diluer de souris anti-β-caténine anticorps (1:500) et de lapin anti-γ-tubuline (1:1000) dans 0,1 M PBS contenant 10% sérum de chèvre normal et 0,5% de Triton-X100. Incuber à 4 ° C pendant 24 heures.
    Pour tacher les cellules adultes souches neurales, ou des cellules de type B1, tache de la paroi latérale avec des anticorps GFAP. Diluer la souris des anticorps anti-GFAP (1:500) dans 0,1 M PBS contenant 10% sérum de chèvre normal et 2% de Triton-X100. Incuber à 4 ° C pendant 48 heures.
  5. Les anticorps primaires sont lavés initialement par deux rinçages en PBS rapides avec ou sans 0,1% de Triton-X100. Puis faire 3 lavages supplémentaires de 20 minutes chacune à la température ambiante.
  6. Diluer Anticorps secondaires dans la même solution de blocage utilisé pour des anticorps primaires et ajouter à échantillons entiers à incuber pendant la même durée de temps que pour les anticorps primaires à 4 ° C.
    Par exemple, pour la coloration des β-caténine et γ-tubuline: diluer Alexa Fluor 488 chèvres anticorps anti-souris (1:400, reconnaît souris anti-β-caténine) et Alexa Fluor 594 chèvres anticorps anti-lapin (1:400, reconnaît lapin anti-γ-tubuline) dans 0,1 M PBS contenant 10% sérum de chèvre normal et 0,5% de Triton-X100. Incuber à 4 ° C pendant 24 heures.
    Pour immunomarquage GFAP: diluer Alexa Fluor 488 chèvres anticorps anti-souris (1:400, reconnaît souris anti-GFAP) dans 0,1 M PBS contenant 10% sérum de chèvre normal et 2% de Triton-X100. Incuber à 4 ° C pendant 48 heures.
  7. Anticorps secondaires sont lavés à l'aide de la wholemount les lavages effectués pour la même anticorps primaire.
  8. Si désiré, le nucléaire contre-coloration peut être effectué à ce point par incubation dans DAPI dilué dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante, puis laver une seule fois dans le PBS.

V. Montage des échantillons entiers immunocolorés sur des lames pour la microscopie confocale

  1. Pour l'imagerie haute résolution confocale, après immunomarquage des échantillons entiers besoin d'être sous-disséquées pour ne conserver que la paroi latérale du ventricule latéral comme un ruban de tissu de 200 à 300 um d'épaisseur. Séparation de la paroi latérale du striatum sous-jacente permet d'être monté sur une lame et recouvert d'une lamelle de façon plate.
  2. Retourner à la loupe binoculaire avec des échantillons entiers immunocolorés et les outils et équipements suivants: lisse pinces fines, Sharpoint 22,5 ° couteau couteau de microchirurgie, plat de dissection, des lames de microscope et des lamelles, 0,1 M de PBS, et Aquamount milieu de montage.
  3. Transférer la wholemount de la plaque de 24 puits à l'antenne dissection contenant 0,1 M de PBS en faisant attention de garder le côté du ventricule en place.
  4. D'abord, supprimer complètement le cortex dorsal du wholemount d'arrière en avant en coupant précisément le long de la ligne où le corps calleux rencontre la paroi latérale. Cela est reconnu comme l'interface entre la matière du corps calleux blanc et le rose apparaissant SVZ.
  5. Ensuite, faire une coupe longue orientées horizontalement à travers la face ventrale du wholemount. Cette surface de coupe fournira une plate-forme sur laquelle vous pouvez erabilize l'wholemount lors de la prochaine étape de la dissection.
  6. Avec la surface dorsale de la wholemount vers le haut, vous serez en mesure de visualiser l'épaisseur de la SVZ d'avant en arrière le long de la paroi latérale. Notez que ce point de vue a été rendue possible par le prélèvement initial du cortex permettant le striatum sous-jacents et SVZ d'être vu. Le SVZ est identifié comme la mince bande de tissu qui s'étend de la surface du ventricule vers le striatum. Le SVZ a un aspect homogène rose tandis que le striatum est infiltré par des cordons de substance blanche. Notez que la SVZ est plus épais en avant et devient progressivement plus mince vers l'arrière.
  7. Lorsque vous avez identifié l'interface du SVZ et du striatum, soigneusement commencer à couper à cette interface à l'aspect antérieur plus de la paroi latérale, avancer le couteau dorsal au bord ventral. Pour ce faire avec précision, de stabiliser le wholemount avec votre pince à servir deux broches. Vous pouvez également utiliser vos pinces pour tourner légèrement le wholemount de visualiser l'avancement de la lame du dorsal au bord ventral à travers la paroi latérale. La clé de cette dissection est pour le ruban de tissu résultant d'être très plat. Cela signifie que vous découpez au large de la SVZ d'avant en arrière à travers la paroi latérale, l'orientation de la coupe que vous faites doit rester parallèle à la surface ventriculaire à tout moment.
  8. Rappelez-vous que plus en arrière, le SVZ s'amincit. Plutôt que d'amincissement votre dissection de couper seulement le SVZ à ce stade, il est important que vous avancez arrière, l'épaisseur du tissu étant disséqué reste le même. Cela garantira que le ruban de tissu, vous seront par la suite de montage est plat.
  9. Après séparant complètement la paroi latérale du striatum sous-jacente, retirez soigneusement tous les autres tissus environnants à partir de ce ruban qui ne font pas partie de la paroi ventriculaire.
  10. Puis ramasser ce ruban d'en bas en utilisant votre pince et le positionner dans le centre d'une lame de microscope. Appliquez quelques gouttes de aquamount directement sur le wholemount et placez doucement une lamelle centrée sur ce, en essayant de ne pas introduire de bulles sur la surface du tissu. Le poids de la lame fera en sorte que l'disperse aquamount uniformément et produira un aplatissement raffinée de la surface du mur latéral. Le montant de aquamount utilisée et la taille de la lamelle dépend de l'âge du tissu étant disséqués. Pour embryonnaire et postnatale précoce des tissus, nous préférons une goutte de aquamount et un 22 "x 30" lamelle. Plus lourd lamelles peuvent fausser les tissus et plus aquamount va interférer avec la qualité de l'imagerie confocale, car les lasers seront moins en mesure de pénétrer une fine couche de aquamount résidant entre la lamelle et la surface du tissu. Pour les tissus plus tard, postnatal et adulte, nous utilisons 4 gouttes de aquamount et un 24 "x 60" lamelle.
  11. Les lames sont ensuite stockés à plat dans un livre glisser à 4 ° C pendant 1-2 jours avant d'imagerie afin de permettre les lamelles de s'installer.

Les résultats représentatifs

Des approches Wholemount ont fourni plusieurs renseignements clés sur l'activité germinales de l'adulte SVZ. Le réseau de chaînes de migrer les jeunes neurones dans le SVZ a d'abord été observée après des échantillons entiers de la paroi latérale du ventricule latéral étaient immunocolorés avec des anticorps à polysialylated molécule d'adhésion cellulaire neurale (PSA-NCAM) 1. Ces chaînes de neuroblastes migrant peut également être observée après immunomarquage avec des anticorps doublecortine échantillons entiers (figure 1). Remarquablement, le réseau de chaînes a un modèle stéréotypé, avec deux filières générales des cellules, un fonctionnement plus dorsalement et ventralement celui qui exécute autour du point d'adhérence. Échantillons entiers de l'SVZ fournissent également une vue complète de l'activité proliférative des progéniteurs dans cette région, comme on le voit avec Ki67 coloration à la figure 2. Fait intéressant, deux études récentes suggèrent une interaction étroite entre les cellules SVZ divisant et la vascularisation locale 2,3 (figure 2).

Lorsqu'ils sont examinés en microscopie confocale à haute puissance, la vue en face fournies par des échantillons entiers permet une perspective unique de la surface apicale des cellules tapissant le système ventriculaire. Cette perspective en face a récemment révélé que les cellules de type B1 SVZ, les cellules souches adultes de neurones, font partie d'un neuroépithélium mélangée avec des non-différenciées divisant cellules épendymaires 4. La surface apicale des cellules B1 contacts tapez le ventricule latéral et est entourée par de grandes surfaces apicales des cellules épendymaires dans une configuration moulinet (figure 3, les flèches indiquent les surfaces B1 apicale). Par ailleurs, un examen attentif de la surface apicale des cellules épendymaires a révélé que la position de translation et de rotation d'orientation de leur corps basaux sont des indicateurs de leur polarité planaire 5. Épendymaire basocellulaire bomatrices sont regroupés dans un patch sur la surface apicale. Ce patch est déplacé du centre de la surface apicale de l'aval "direction à l'égard de l'écoulement de CSF (polarité traductionnelle) au sein de ce patch, chaque basale du corps est mis en rotation autour de son axe longitudinal de telle sorte que le pied basale, un accessoire de la basale corps, des points dans le sens d'écoulement (polarité de rotation). voisins cellules épendymaires ont leur corps basaux orientés dans la même direction. Surtout, videomicrographs de l'essai d'écoulement épendymaires peuvent être utilisés pour comparer directement le débit dans une région spécifique de la paroi latérale à l'orientation du corps cellulaire épendymaire basale dans cette région (figure 4).

En plus d'offrir une perspective panoramique de la plus grande région germinales dans le cerveau adulte, avec l'imagerie de puissance plus élevée, des échantillons entiers permettre une analyse plus complète et détaillée des morphologies cellulaires individuelles dans la SVZ. Imagerie confocale de haute puissance immunomarquage GFAP sur échantillons entiers a révélé que les cellules de type B1, en ​​plus de leur courte ventricule contactant processus apical, ont un long processus basale en contact avec les vaisseaux sanguins (Figure 5) 4. Cette cytoarchitecture n'avait pas été apprécié auparavant dans coupes coronales parce que le processus fonctionne essentiellement basales parallèle à la paroi ventriculaire. Coupes sériées coupe donc des cellules individuelles en petits fragments, ce qui rend presque impossible de reconstituer la morphologie complète d'une cellule s, ou de comprendre sa relation à d'autres types cellulaires dans la SVZ. L'approche wholemount a plusieurs avantages sur les techniques classiques de sectionnement, en offrant des vues panoramiques à la microscopie de faible puissance et une perspective complète des cellules individuelles par microscopie à haute puissance. Cette technique va continuer à être un complément important aux études futures de cette zone du cerveau adulte germinales.

Figure 1
Figure 1. Réseau des migrateurs chaînes neuronales dans le SVZ. Carrelé images confocales reconstruire une wholemount paroi latérale qui a été coloré avec des anticorps à doublecortine, dont les étiquettes neuroblastes migrent à travers le SVZ. Il ya deux courants généraux de la migration, une course plus dorsalement et ventralement celui qui exécute autour du point d'adhérence, indiqués par l'astérisque (*). Les flèches indiquent antérieure (a) et dorsale (d) les directions. Barre d'échelle = 1 mm.

Figure 2
Figure 2. Relation entre le système vasculaire et des cellules en division dans la SVZ. Cette wholemount paroi latérale a été immunocolorées avec des anticorps pour Ki67, d'étiqueter les cellules à division dans le vert, et des anticorps contre les immunoglobulines de souris, à l'étiquette de la vascularisation en rouge. Parce que ce n'était pas wholemount perfusés avec une solution saline avant la coloration, la souris endogènes des molécules d'IgG restent dans les vaisseaux sanguins et sont colorés par du secondaire anticorps anti-souris. Des travaux récents suggèrent que la division des précurseurs SVZ (vert) sont situés à proximité de vaisseaux sanguins (en rouge) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. Les flèches indiquent antérieure (a) et dorsale (d) les directions. Barre d'échelle = 1 mm.

Figure 3
Figure 3. La surface apicale du ventricule en contact avec les cellules de la paroi latérale. L'image confocale haute puissance d'un wholemount immunocolorées pour β-caténine, d'étiqueter les membranes des cellules en vert, et γ-tubuline, d'étiqueter corps basaux en rouge, révèle l'organisation planaire de ces cellules épithéliales. Cellules de type B1, les cellules souches adultes de neurones, ont une petite surface apicale avec un seul corps basal, indiquées par des flèches. La surface apicale de ces cellules est entourée par la grande surface apicale des cellules épendymaires dans une configuration moulinet. Cellules épendymaires ont polarité planaire indiquée par la position de leur corps basaux multiples sur la surface apicale. Voisins cellules épendymaires ont leurs pôles basale du corps situé sur le même côté de la surface apicale (vers le bas et vers la gauche dans cette région), correspondant à la direction du flux du LCR {Mirzadeh, 2010 # 6573}. Barre d'échelle = 10 um.

Figure 4
Figure 4. Le test de débit épendymaires. Image composite créée par la fusion de 100 images séquentielles d'une vidéo prise lors du test de débit épendymaires. Microbilles fluorescentes déposé dorsale et postérieure à la zone d'adhérence ont été propulsés par les cils épendymaires en deux courants orientés, l'un plus et un sous l'adhérence, en direction du trou de Monro. Ce flux orientés révèle la polarité planaire fonctionnelle de cellules épendymaires. Chaque ligne d'écoulement représente la position d'une seule perle à points consécutifs dans le temps. Barre d'échelle = 0,5 mm.


Figure 5. GFAP + cellules de type B1 ont une longue fibre basale à fin pieds sur les vaisseaux sanguins. Projection maximale d'une pile haute puissance confocale prises à partir d'un wholemount paroi latérale avec des anticorps GFAP immunocolorés d'étiqueter les astrocytes SVZ. Cette coloration étiquettes cellules souches neurales adultes, ou des cellules de type B1, qui ont une fin à la surface apicale ventriculaire, et comme indiqué ici, une longue GFAP + fibre basale qui se termine sur les vaisseaux sanguins (flèches). Les vaisseaux sanguins sont colorés ici parce que l'anticorps secondaire utilisé pour visualiser la souris anti-GFAP anticorps reconnaissent endogènes IgG de souris dans le système vasculaire. Barre d'échelle = 50 microns.

Discussion

La plupart des études de la neurogenèse dans les zones ventriculaires et sous-ventriculaire se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement d'examiner les relations microanatomie et cellulaires dans ces régions. Nous décrivons ici une technique alternative, d'abord utilisé pour analyser le réseau de chaînes migratoires des neuroblastes générés dans le SVZ 1, puis utilisées pour étudier la régénération de la population progénitrices SVZ suivantes antimitotiques traitement de 6, et plus récemment utilisée pour étudier les apicale précise basale et interactions cellule-cellule des cellules souches neurales adultes SVZ 2,3,4. Fait intéressant, cette technique a révélé que les cellules souches neurales, ou des cellules de type B1, de l'adulte SVZ font partie d'un neuroépithélium mélangé avec différenciées ne se divisent cellules épendymaires. En face d'imagerie utilisant des échantillons entiers a montré que ce mélange a une architecture neuroépithélium moulinet composé des terminaisons apicale des cellules de type B1 entouré par de grandes surfaces apicales des cellules épendymaires 4. Cette analyse en face a clarifié notre compréhension de la lignée de cellules souches neurales dans le cerveau embryonnaire et adulte comme étant composé de cellules avec des terminaisons à la surface apicale du ventricule et des processus basale contactant une niche vasculaire. Ces résultats aurait été presque impossible en utilisant les techniques classiques de sectionnement. Échantillons entiers aussi faciliter l'identification des cellules souches neurales via leur ventricule contactant processus apical. Comme marqueurs plus spécifiques de ces cellules souches sont trouvées, des échantillons entiers seront une partie intégrante de l'identification et l'analyse de comportement des cellules souches neurales.

Échantillons entiers des murs ventricule latéral fournissent également la perspective idéale pour étudier la polarité planaire des cellules épendymaires. Cellules épendymaires sont les cellules tapissant les ventricules multiciliated cette fonction pour propulser le LCR de façon coordonnée. Avec la technique wholemount, l'épithélium épendymaire entière est exposée en face et peut être teinté et étudiées en détail de son avant vers l'arrière et dorsale des frontières ventrale. Par ailleurs, des tests de débit effectués sur épendymaires aiguë disséqué, échantillons entiers vivent robuste montrer le flux planaire polarisée générés par les cils épendymaires. Des travaux récents utilisant des approches wholemount a découvert déterminants cellulaires de cette polarité planaire épendymaires 5. Fait intéressant, les études wholemount ont également suggéré que épendymaires-généré des flux de LCR établit des gradients de chemorepellents qui guident la migration des jeunes neurones dans le SVZ 7. Des approches Wholemount qu'il a identifié le réseau de chaînes de neurones migratoires sont donc continuer à fournir des indications sur les mécanismes de régulation de la migration en chaîne.

L'analyse de la VZ et SVZ par wholemount imagerie ajoute une nouvelle approche à la fois pour les études futures et une façon de clarifier notre compréhension des études existantes. Par exemple, une étude récente suggère que les cellules souches neurales dans le SVZ adulte ont été CD133 + / CD24-cellules en contact avec les 8 ventricule. Basé sur leur immunomarquage dans les sections, ces auteurs ont prétendu que ces cellules ont été une sous-population de cellules épendymaires multiciliated. Cependant, dans notre étude en utilisant l'approche wholemount, ce qui donne une vue plus complète de l'épithélium toute épendymaires, nous avons constaté que toutes les cellules épendymaires exprimer CD24 et le seul ventricule contact de cellules qui ont été CD133 + / CD24-ont un sous-ensemble de l'type B1 cellules 4. Par ailleurs, la technique wholemount promet d'être utile dans de futures études examinant l'organisation de mosaïque récemment décrit des cellules souches neurales dans le cerveau adulte 9. Plusieurs études ont montré que les cellules souches neurales dans le cerveau adulte ne sont pas une population homogène, mais sont spécifiées régionalement et, normalement, ne produisent que des sous-types spécifiques d'interneurones bulbe olfactif. Ces études ont proposé que différentes sous-populations de cellules souches neurales peuvent être distingués soit par l'expression des facteurs de transcription spécifiques 10,11,12,13,14 et / ou par leur localisation régionale le long de la dorsale des degrés-ventral et antéro-postérieure de la paroi latérale 9,15,16. Comme plusieurs marqueurs moléculaires de la sous-populations régionalement spécifié de cellules souches neurales adultes sont identifiés, l'imagerie wholemount devrait fournir une vue complète de l'parcelation de ces domaines progénitrices différents le long de la paroi ventriculaire.

La dissection wholemount et des techniques d'imagerie présentées ici peuvent également être utilisés pour analyser les parois ventriculaires chez l'embryon. La dissection de la paroi latérale est réalisée embryonnaire, étape par étape, de la même manière. Il ya seulement de légères différences dans le niveau de difficulté; les ventricules embryonnaires sont relativement plus faire la dissection plus facile, mais le tissu est doux rendant la manipulation plus difficile. En particulier, une exposition similaire du ventricule latéral peut être utilisé dans EmbryOS pour disséquer la paroi corticale du ventricule pour étudier la neurogenèse corticale. Des données récentes suggèrent que l'héritage asymétriques centrosome maintient glie radiaire à la surface ventriculaire pendant la neurogenèse corticale 17. En face de l'imagerie radiale gliales surfaces apicales peuvent fournir des indications sur la manière dont les centrosomes au sein de ces cellules qui se divisent de façon asymétrique sont héréditaires.

Comme avec la plupart des techniques, en particulier celles impliquant la dextérité précise, la maîtrise exige la pratique. Il ya, cependant, quelques éléments dans la dissection qui sont essentiels à de meilleurs résultats: 1) l'éclairage ajuster l'éclairage de l'échantillon pour créer des ombres donne un contraste précieuse lors de la dissection du tissu qui est par ailleurs relativement homogène, 2) à l'aide de la pince, comme deux broches d'insectes de la pince dans cette technique sont jamais utilisés pour pincer ensemble ou ramasser des tissus, mais ils sont utilisés comme des épingles maniable qui peut être constamment réajustés afin de stabiliser le tissu tout en réduisant, 3) un équilibre de rétractation doux et la coupe du couteau ne doit pas seulement être utilisé pour couper, mais aussi de fournir la rétraction douce pour séparer les murs médial et latéral, en rappelant que la majorité de cette dissection est effectivement réalisé par le biais de rétraction douce avec seulement la coupe intermittente.

Acknowledgments

Les travaux pris en charge par NIH HD-32116, la famille Sandler Soutenir la Fondation, le Fonds John Bowes de cellules souches, le MEXT, le MHLW et HFSP. ZM soutenu par la Fondation Carlos Baldoceda et UCSF Krevans Bourse. AA-B. Heather détient la présidence et Melanie Muss Doté.

References

  1. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).
  2. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  3. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  4. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  5. Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).
  6. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).
  7. Sawamoto, K. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311, 629-632 (2006).
  8. Coskun, V. CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).
  9. Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. Science. 317, 381-384 (2007).
  10. Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb. J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).
  11. Waclaw, R. R. The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons. Neuron. 49, 503-516 (2006).
  12. Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).
  13. Kohwi, M. A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors. J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).
  14. Hack, M. A. Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis. Nat Neurosci. (2005).
  15. Ventura, R. E., Goldman, J. E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).
  16. Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns. PLoS Biol. 5, e300 (2007).
  17. Wang, X. Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors. Nature. 461, 947-955 (2009).
La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter