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Neuroscience

Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

Die Seitenventrikel Wände enthalten die größten germinal Region im erwachsenen Gehirn von Säugetieren. Traditionell haben die Studien auf die Neurogenese in dieser Region auf die klassische Schnitte Techniken für die histologische Analyse herangezogen. Hier präsentieren wir einen alternativen Ansatz, der wholemount Technik, die eine umfassende, en-face Angesichts dieser Keim Region bietet.

Abstract

Die Wände der Seitenventrikel enthalten die größten germinal Region im erwachsenen Gehirn von Säugetieren. Die subventrikulären Zone (SVZ) in diesen Mauern ist ein umfassend untersucht Modellsystem für das Verständnis des Verhaltens von neuralen Stammzellen und die Regulation der adulten Neurogenese. Traditionell wurden diese Studien über klassische Schnitte Techniken für die histologische Analyse herangezogen. Hier präsentieren wir einen alternativen Ansatz, der wholemount Technik, die eine umfassende, en-face Angesichts dieser Keim Region bietet. Im Vergleich zu Abschnitten, zu bewahren wholemounts die komplette Zytoarchitektur und zelluläre Beziehungen innerhalb der SVZ. Dieser Ansatz hat kürzlich ergeben, dass die adulten neuralen Stammzellen, oder geben Sie B1-Zellen, Teil eines gemischt Neuroepithel mit differenzierten Ependymzellen Auskleidung der Seitenventrikel sind. Darüber hinaus hat dieser Ansatz verwendet worden, um die planare Polarisierung der Ependymzellen und der Liquor fließen sie erzeugen in den Ventrikel zu studieren. Mit den letzten Beweis dafür, dass adulte neurale Stammzellen eine heterogene Population, die regional angegeben wird, werden die wholemount Ansatz wahrscheinlich ein wesentliches Instrument für das Verständnis der Organisation und Parzellierung des Stammzell-Nische.

Protocol

I. Herstellung von Glas Mikropipetten mit Fluorescent Microbeads für Ependymale Flow-Assay (diese Schritte können übersprungen werden, wenn Vorbereitung wholemounts zur Färbung dient nur sein) gefüllt.

  1. Sichern Sie sich einen Wiretrol 5 ul Glaskapillare auf Glasmikropipette Abzieher und passen Heizung und Magnetventil Einstellungen Pipette mit einer glatten, flachen Kegel zu ziehen.
  2. Bringen Sie eine Quelle positiver Luftdruck auf das Ende des gezogenen Mikropipette und senken die Spitze der Pipette auf eine Metall-Gitter-Oberfläche in einem 45 ° Winkel zu einer abgeschrägten Spitze zu schaffen. Positiver Luftdruck hilft, Glas Schmutz aus dem Inneren der Pipette klar. Reinigen Sie das Ende der abgeschrägten Spitze mit einem Ethanol-angefeuchteten Tuch.
  3. Untersuchen Sie die Spitze der Pipette unter dem Mikroskop mit einem Mikrometer. Die Spitze sollte eine glatte Schräge mit einer inneren Öffnung Durchmesser von ~ 100 um. Kleinere Durchmesser können verwendet werden, aber oft in ein Verstopfen der Pipette mit fluoreszierenden Beads führen.
  4. Backfill Pipette mit Mineralöl bis halb voll, dann legen Sie Fett-getaucht Kolben in Rückseite der Pipette. Advance-Meniskus von Mineralöl auf die Pipettenspitze durch manuelles Schieben in den Kolben.
  5. Sichern Sie die Mikropipette und der Kolben auf einem Mikromanipulator, dann schrauben Sie den Mikromanipulator Pipettenhalter auf eine kleine stationäre Arm mit einstellbarer Höhe.
  6. Vorgezogene die Pipette mit dem fluoreszierenden Mikrokügelchen Lösung, bestehend aus 50% fluoreszierende Mikrokügelchen Stammlösung, 45% Wasser und 5% Glycerin. Glycerin zugesetzt wird, um die Dichte der Lösung zu erhöhen, so dass, wenn auf die wholemount hinterlegt die Mikroperlen auf die Oberfläche sinken.
  7. Setzen Sie den Mikromanipulator an einem sicheren Ort, wo die Nadel nicht versehentlich zerbrochen werden und fahren Sie mit wholemount Dissektion.

II. Wholemount Dissection und Fixation

  1. Zur Vorbereitung auf wholemount Dissektion, warm ausreichende Menge an L-15 Leibovitz Medien bis 37 ° C. Sie benötigen ca. 10 ml pro Tier, das Sie zu sezieren zu planen. Auch sammeln alle liefert Ihnen für die Präparation und Befestigung durch das Stereomikroskop benötigen: Schere, gezahnt großen Pinzette, glatt feinen Pinzette, Sharpoint 22,5 ° mikrochirurgischen stab Messer seziert Gericht, Papiertuch, biohazard Tasche, und eine 24-Well-Platte auf Eis gefüllt mit 4% Paraformaldehyd mit oder ohne 0,1% Triton X-100. Triton X-100 wird verwendet, um die Oberflächenspannung des PFA-Lösung, die das Auftreten von Scherung der wholemount Oberfläche beim Eintauchen in dieser Lösung nimmt ab.
  2. Gießen Sie 5-10 ml des erwärmten Medien in einem Seziertisch Gericht unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop gelegt. Dissecting Gerichte werden durch Gießen ein elastisches Polymer, genannt Sylgard 184, in eine 6 cm Plastikschale und lässt die Polymerlösung Heilung für 1 Woche unter Vakuum vorbereitet und dann gründlich spülen Geschirr in großen Mengen Wasser vor dem Gebrauch. Normalerweise lassen wir die Gerichte in Wasser einweichen in einem 1 L Becherglas für 1 Woche.
  3. Das Tier ist durch Genickbruch getötet und der Kopf abgeschnitten wird.
    Hinweis: Falls gewünscht, kann das Blut aus dem Gefäßsystem durch Perfusion des Tieres mit physiologischer Kochsalzlösung vor Sezieren aus dem Gehirn gelöscht werden. Dies ist besonders wichtig, wenn die Durchführung chromogenen Immunfärbung mit Diaminobenzidin (DAB).
  4. Eine Mittellinie Schnitt gemacht, posterior nach anterior, entlang der Kopfhaut an den Schädel zu offenbaren.
  5. Eine Reihe von 4 Schnitte in den Schädel gemacht werden, um den Schädel zu öffnen: ein Schnitt erstreckt sich die beiden Umlaufbahnen anterior der Riechkolben, die nächsten beiden Schnitte sind schlechter als das Kleinhirn und trennen Sie die Schädel von der Schädelbasis und der Final Cut läuft posterior nach anterior entlang der Mitte der Pfeilnaht.
  6. Der kraniale Klappen sind sanft eingefahren und das Gehirn entnommen und in das Sezieren Schale gelegt.
  7. Der Rest der Präparation wird unter dem Stereomikroskop durchgeführt. Zunächst werden die Riechkolben vom Gehirn seziert. Wenn Sie zusätzlich zu den Riechkolben untersuchen möchten, einfach fixieren durch Eintauchen in 4% PFA über Nacht, und Sie können später bereiten sie für das Schneiden und Färben.
  8. Teilen Sie das Gehirn entlang der interhemisphärische Fissur.
  9. Ein koronal-orientierte Schnitt wird dann an der hinteren-am Aspekt der interhemisphärische Riss gemacht, so dass die caudalen Hippocampus zu sein im Querschnitt visualisiert.
  10. Der Hippocampus, welche die mediale Wand der Seitenventrikel an dieser Stelle bildet, muss dann von der darüber liegenden Kortex, die dorsal-laterale Wand des Ventrikels bildet freigegeben werden. Zuerst wird das Messer in der kleinen ventrikulären Raum zwischen den Cortex und Hippocampus dorsal eingefügt, und ein Schnitt in die Rinde, wo sie reflektiert ventral gemacht, weg von der Mittellinie, mit dem Hippocampus beizutreten. Nach dieser Schnitt gemacht wird, kann die Rinde langsam abgezogen werden vom Hippocampus zu den lateralen Ventrikel Wechsel von dorsal nach ventral zu offenbaren. Dieses Manöver wirdbeschleunigt durch das Abschneiden eines Keils des Kortex an der Ecke, wo der Hippocampus veröffentlicht wurde. Nach Erreichen der ventral-am Ausmaß der lateralen Ventrikel an dieser Stelle können Sie entweder zu visualisieren oder fühlen, wo die Rinde wieder umschlingt, diesmal zurück reflektiert medial, zum Hippocampus beizutreten. Ein weiterer Schnitt muss in dieser Position vorgenommen werden, um vollständig zu lösen Hippocampus oder mediale Wand der Seitenventrikel aus der Rinde oder Seitenwand des lateralen Ventrikel.
  11. Es wird dann einfach mit dem Hippocampus entfernt von der Hirnrinde zu ziehen, medial und vorn, um die lateralen Ventrikel weit offen.
  12. Weiter zum Ziehen des Hippocampus anterior mit kleinen Strichen der Zange und Messer, um den medialen und lateralen Wände auseinander zurückzuziehen.
  13. Sobald der Widerstand gegen diese Rücknahme zu steigen beginnt, sind weitere Einschnitte notwendig. Erstens, erhöhen Sie Ihre Belastung durch den lateralen Ventrikel und insbesondere die Seitenwand und SVZ, sezieren entfernt die Rinde. Die Rinde ist glatt weg durch die Visualisierung der Schnittstelle zwischen dem Corpus Callosum und der VZ / SVZ seziert. Einfach, an dieser Schnittstelle bleiben auf der Balkenfasern Seite, um eine Beschädigung der SVZ geschnitten.
  14. Um weiterhin das Zurückziehen der medialen Wand weg von der seitlichen Wand, sind zwei weitere Schnitte nötig: ein Schnitt dorsal, wo die Seitenwand, mediale Wand, und Cortex alle zusammenlaufen, und einem Schnitt ventral, wo die Seitenwand, mediale Wand, und Thalamus konvergieren. Mit diesen Kürzungen vorgenommen, ermöglicht eine weitere schonende Einfahren auf der medialen Wand der vorderen weitesten Ausmaß der lateralen Ventrikel geöffnet werden.
  15. Richtige Beleuchtung ist während des gesamten Verfahrens und vor allem im nächsten Schritt, wo die medialen und lateralen Wände anterior getrennt sind von wesentlicher Bedeutung. An diesem vorderen Position in den lateralen Ventrikel, spiegelt die mediale Wand zurück und ist kontinuierlich mit der Seitenwand. Passen Sie die Beleuchtung, so dass Schatten zwischen den beiden Mauern werfen diese Überlegungen zeigen, die wie ein Tal zwischen den beiden Wänden scheint zu offenbaren. Cut genau in dieses Tal, diese beiden Wände zu trennen.
  16. Schließlich vollständig freizulegen der Seitenwand durch Entfernen von überhängenden Kortex und dem Thalamus dorsal nach ventral.
  17. Wenn der Vorbereitung wholemounts für Immunfärbung sorgfältig übertragen wholemount, Ventrikel Seite nach oben, von der Dissektion Schüssel in einer 24-Well-Platte mit 4% PFA mit oder ohne 0,1% Triton-X100 gefüllt für eine Übernachtung Fixierung bei 4 ° C. Zur Fixierung-sensitive Antigene kann wholemounts für kürzere Zeiträume festgelegt werden. Dann Abschnitt 4 gehen auf Immunfärbung wholemounts.
  18. Wenn der Vorbereitung wholemounts für Ependymzellen-Flow-Analyse, Übertragung der wholemount, um eine saubere Präparation Schüssel mit frischem, 37 ° C Leibovitz Medium gefüllt und gehen zum nächsten Abschnitt.

III. Ependymale Flow Analysis unter Verwendung von fluoreszierenden Mikrokügelchen

  1. Immobilisierung der wholemount auf eine saubere Sezieren Schüssel mit 2 Insekten-Stifte, eine in den Thalamus und einer in anterior-dorsalen Ecke des wholemount.
  2. Legen Sie die Basis der stationären Arm und halten Sie den Mikromanipulator neben dem Stereomikroskop. Achten Sie darauf, die Höhe der verstellbaren Arm maximal erhöht ist zu vermeiden, bricht die Nadel gegen die Dissektion Gericht.
  3. Vorsichtig tauchen die Spitze der Nadel in die Medien in einem ependorf Rohr zu reinigen Sie Mikrokügelchen, die auf dem äußeren Spitze der Nadel sind. Wenn diese nicht gereinigt entfernt, können sie anschließend auf der Oberfläche abgelagert wholemout versehentlich während Nadelpositionierung und verringern die allgemeine Qualität des Films.
  4. Position der Nadelspitze über der dorsalen Oberfläche der Seitenwand und senken Sie den Arm an der Nadelspitze in das Medium zu bringen. Die Nadel sollte gesenkt, bis sie knapp oberhalb der seitlichen Wandfläche ist.
  5. Mit der Nadel in der Position, stellen Sie den Zoom-und Fokus auf das Stereomikroskop auf einen gewünschten Bereich zu decken. Wenn Sie machen werden, eine Aufzeichnung der Ependymzellen fließen beginnen Erfassung von Bildern zu diesem Zeitpunkt.
  6. Eject ~ 5 nl der Mikrokügelchen-Lösung auf der Oberfläche des wholemount. Sobald die erste Bolus von Perlen wurde von der Oberfläche durch Ependymzellen flow gelöscht, können weitere Runden der Raupe Auswurf durchgeführt werden.

IV. Immunfärbung Wholemounts

  1. Wholemounts für Immunfärbung seziert werden Immersion fixierten Nacht in 4% PFA mit oder ohne 0,1% Triton-X100 bei 4 ° C. Die Verwendung von Triton-X100 ist für Antigene, die diese Behandlung tolerieren bevorzugt, kann aber in Fällen, in denen Färbequalität durch Waschmittel verringert wird verlassen werden.
  2. Am nächsten Morgen ist PFA von der 24-Well-Platte abgesaugt und die wholemounts sind 3 mal für jeweils 5 Minuten gewaschen in 0,1 M PBS mit oder ohne 0,1% Triton-X100. Nach wie vor ist die Verwendung von Triton-X100 bevorzugt, aber nicht erforderlich, für alle Wäschen in diesem Protokoll. In diesem Protokoll, den Austausch von Lösungen über die gesamteMontage erfordert eine sorgfältige Aspiration der Lösung von der Seite des Brunnens. Dann wird das auch mit der Lösung mit einer Transferpipette abgewinkelt, so dass die Lösung wäscht über die Seite des na ja, nicht direkt auf die wholemount nachgefüllt. Achten Sie auf die Ventrikel Seite des wholemount nach oben zu allen Zeiten zu halten. Kräftige Pipettieren von Lösungen wird oft drehen die wholemount. Wir bevorzugen Lösungen über 1 wholemount Austausch in einer Zeit des Gewebes vor dem Austrocknen zu verhindern.
  3. Nach dem Abwaschen der PFA, sind wholemounts für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Blocking-Lösung inkubiert, mit 10% normalem Ziegenserum oder Esel-Serum in 0,1 M PBS mit oder ohne Triton-X100. Bei Verwendung von Triton-X100 für Ihre Färbung, können Sie entweder 2% oder 0,5% Triton-X100 in Blocking-Lösung verwenden. Wir verwenden 2% Triton-X100, wenn Färbung für Antigene, die tiefer Antikörper das Eindringen in das Gewebe, wie die Antigene in der SVZ finden, erfordern. Allerdings, wenn Färbung für Antigene näher an der Oberfläche der Seitenwand, wie Antigene in der apikalen Oberfläche der Ependymzellen gefunden befindet, verwenden wir 0,5% Triton-X100. Darüber hinaus können Triton-X100 aus für Zell-Oberflächen-oder andere Antigene, die entfernt oder durch Reinigungsmittel verändert gelassen werden.
  4. Dann entfernen Sie die Blockierung Lösung und fügen Primärantikörper in der gleichen Blockierungslösung verdünnt und inkubieren für 24 oder 48 Stunden bei 4 ° C. Wahl der Inkubationszeit hängt von der Antigen, ähnlich wie bei Wahl von 0,5% oder 2% Triton. Für Antigene auf der Oberfläche des wholemount gelegen, 24 Stunden Inkubationszeit reicht. Doch für Antigene tiefer, wie in der SVZ gelegen, bietet 48 Stunden Inkubationszeit bessere Ergebnisse.
    Zum Beispiel an die apikale Oberfläche und Basalkörper von Zellen entlang der seitlichen Ventrikelwand Studie mit Antikörpern gegen β-Catenin-Färbung, an die Zellmembran Label, und γ-Tubulin, um Basalkörpern Etikett. Verdünnen Maus-anti-β-Catenin-Antikörper (1:500) und Kaninchen-anti-γ-Tubulin-Antikörper (1:1000) in 0,1 M PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton-X100. Inkubation bei 4 ° C für 24 Stunden.
    Um Flecken auf den adulten neuralen Stammzellen, oder geben Sie B1-Zellen, Färbung der Seitenwand mit GFAP-Antikörper. Verdünnen Maus-Anti-GFAP Antikörper (1:500) in 0,1 M PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 2% Triton-X100. Inkubation bei 4 ° C für 48 Stunden.
  5. Primäre Antikörper sind aus zunächst durch 2 schnelle Spülungen in PBS gewaschen, mit oder ohne 0,1% Triton-X100. Dann machen 3 weitere Waschgänge für je 20 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Verdünnen Sekundärantikörper in der gleichen Blockierungslösung für primäre Antikörper verwendet und fügen wholemounts für die gleiche Zeitspanne wie für Primär-Antikörper inkubieren bei 4 ° C.
    Zum Beispiel für die Färbung für β-Catenin und γ-Tubulin: verdünnen Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus-Antikörper (1:400, erkennt Maus-anti-β-Catenin) und Alexa Fluor 594 Ziege anti-Kaninchen-Antikörper (1:400, erkennt Kaninchen-anti-γ-Tubulin) in 0,1 M PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton-X100. Inkubation bei 4 ° C für 24 Stunden.
    Für GFAP Immunfärbung: verdünnen Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus-Antikörper (1:400, erkennt Maus-Anti-GFAP) in 0,1 M PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 2% Triton-X100. Inkubation bei 4 ° C für 48 Stunden.
  7. Sekundäre Antikörper sind aus dem wholemount mit dem gleichen wäscht für Primär-Antikörper durchgeführt gewaschen.
  8. Falls gewünscht, können nukleare Gegenfärbung an dieser Stelle durch Inkubation in DAPI in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend Waschen einmal in PBS verdünnt durchgeführt werden.

V. Montage Immungefärbte Wholemounts auf Folien für die konfokale Mikroskopie

  1. Für hochauflösende konfokale Bildgebung nach Immunfärbung der wholemounts sein musste sub-seziert, um nur die Seitenwand des lateralen Ventrikel als Vorband von Gewebe 200-300 um dick zu bewahren. Die Trennung der Seitenwand von der zugrunde liegenden Striatum ermöglicht es, auf einem Schlitten montiert und mit einem Deckglas bedeckt in eine flache Form.
  2. Zurück zur Stereomikroskop mit immungefärbt wholemounts und die folgenden Werkzeuge und Geräte: glatt feinen Pinzette, Sharpoint 22,5 ° mikrochirurgischen stab Messer seziert Gericht, Objektträger und Deckgläser, 0,1 M PBS, und Aquamount Eindeckmedium.
  3. Übertragen Sie die wholemount von der 24-Well-Platte, die sezieren Schale mit 0,1 M PBS darauf achten an den Ventrikel Seite halten.
  4. Erstens die vollständige Entfernung des dorsalen Kortex des wholemount von posterior nach anterior, indem genau entlang der Linie, wo die Balken entspricht der Seitenwand. Dies ist die Schnittstelle zwischen den Balkenfasern weißen Substanz und der rosa erscheinenden SVZ anerkannt.
  5. Dann machen Sie einen langen horizontal ausgerichtete quer durch den ventralen Aspekt der wholemount. Diese Schnittfläche wird eine Plattform bieten, auf dem Sie stabilize die wholemount im nächsten Schritt in der Präparation.
  6. Mit der dorsalen Oberfläche des wholemount nach oben, werden Sie in der Lage sein, die Dicke der SVZ vom vorderen visualisieren, um entlang der Seitenwand hinten. Beachten Sie, dass diese Ansicht wurde möglich durch die anfängliche Entfernung der Rinde so dass die zugrunde liegenden Striatum und SVZ zu sehen. Die SVZ wird als dünnes Band von Gewebe, die sich von der ventrikulären Oberfläche bis zum Striatum identifiziert. Die SVZ hat eine homogene rosastichig während das Striatum durch Schnüre von der weißen Substanz infiltriert wird. Beachten Sie, dass die SVZ dicker ist nach vorne und wird immer dünner hinten.
  7. Sobald Sie die Schnittstelle des SVZ und Striatum identifiziert, sorgfältig zu beginnen Schneiden an dieser Schnittstelle an der Front-am Aspekt der Seitenwand, die Förderung der Messer von dorsal nach ventral. Um dies zu tun genau, stabilisieren die wholemount mit einer Pinzette als zwei Stifte verwendet. Sie können auch Ihre Pinzette leicht drehen Sie den wholemount an der Klinge voran von dorsal nach ventral über die Seitenwand zu visualisieren. Der Schlüssel zu dieser Sektion ist für die daraus entstehenden Splitter des Gewebes sehr flach sein. Dies bedeutet, dass Sie sofort nach der SVZ Scheibe von vorne nach über die Seitenwand posterior, die Orientierung der Schnitte Sie bleiben muss parallel zur ventrikulären Oberfläche zu allen Zeiten.
  8. Denken Sie daran, dass mehr nach hinten, wird der SVZ dünner. Anstatt Ausdünnung Ihrer Dissektion abzuschneiden nur die SVZ an dieser Stelle ist es wichtig, dass Sie hinten voraus, die Dicke des Gewebes seziert die gleiche bleibt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Splitter des Gewebes Sie anschließend montiert werden flach ist.
  9. Nach der vollständigen Trennung von der Seitenwand von der zugrunde liegenden Striatum, entfernen Sie vorsichtig alle anderen umgebenden Gewebe von dieser Band, die nicht Teil der Ventrikelwand.
  10. Dann nehmen Sie das Band von unten mit Ihrem Pinzette und positionieren Sie es in der Mitte eines Objektträgers. Geben Sie einige Tropfen des Aquamount direkt auf die wholemount und sanft Ort ein Deckglas über diese zentriert und versuchte, nicht zu Blasen auf der Oberfläche des Gewebes führen. Das Gewicht des Schlittens werden, dass die Aquamount verteilt gleichmäßig zu gewährleisten und eine raffinierte Abflachung der lateralen Wand Oberfläche zu erzeugen. Die Höhe der Aquamount verwendet und die Größe des Deckglases auf das Alter des Gewebes seziert ab. Für embryonalen und frühen postnatalen Geweben, bevorzugen wir 1 Tropfen Aquamount und ein 22 "x 30" Deckglas. Schwerere Deckgläser verzerren das Gewebe und mehr Aquamount mit Bildqualität beeinträchtigen, da die konfokale Laser wird weniger in der Lage, eine dünne Schicht von Aquamount Wohnsitz zwischen dem Deckglas und das Gewebe eindringen. Für die spätere postnatale und adulten Geweben, verwenden wir 4 Tropfen Aquamount und eine 24 "x 60" Deckglas.
  11. Die Objektträger werden dann flach gelagert bei 4 in einer Diashow Buch ° C für 1-2 Tage vor Bildgebung, damit die Deckgläser zu begleichen.

Repräsentative Ergebnisse

Wholemount Ansätze haben einige wichtige Einblicke in die Keimzentren Aktivität des erwachsenen SVZ zur Verfügung gestellt. Das Netzwerk aus Ketten von Migration jungen Neuronen in der SVZ wurde zum ersten Mal nach wholemounts der seitlichen Wand der Seitenventrikel beobachtet wurden mit Antikörpern gegen polysialylated neuronale Adhäsionsmolekül (PSA-NCAM) 1 immungefärbt. Diese Ketten der Migration Neuroblasten kann auch nach Immunfärbung wholemounts mit Doublecortin Antikörper (Abbildung 1) zu sehen. Bemerkenswert ist, dass das Netz der Ketten einer stereotypen Muster, mit zwei allgemeine Ströme von Zellen, von denen einer dorsal über und man läuft ventral um die Haftung Punkt. Wholemounts der SVZ auch einen umfassenden Überblick über die proliferative Aktivität von Vorläuferzellen in dieser Region, wie mit Ki67-Färbung in Abbildung 2 zu sehen. Interessanterweise deuten zwei neue Studien eine enge Interaktion zwischen Teilung SVZ-Zellen und der örtlichen Gefäßsystem 2,3 (Abbildung 2).

Wenn unter hoher Leistung konfokale Mikroskopie untersucht, kann der En-face-Ansicht wholemounts bot eine einzigartige Perspektive der apikalen Oberfläche von Zellen entlang der Ventrikelsystem. Das En-face-Perspektive hat kürzlich ergeben, dass SVZ Typ B1-Zellen, die adulten neuralen Stammzellen, Teil eines gemischt Neuroepithel mit nicht-teilenden differenzierten Ependymzellen 4 sind. Die apikale Oberfläche des Typs B1-Zellen in Kontakt mit der lateralen Ventrikel und von großen apikalen Oberflächen der Ependymzellen ist in einem Windrad Konfiguration umgeben (Abbildung 3 zeigen die Pfeile B1 apikalen Oberflächen). Darüber hinaus hat genaue Untersuchung der apikalen Oberfläche der Ependymzellen ergab, dass die translatorische Position und Drehlage der Basalkörper Indikatoren ihrer planaren Polarität 5 sind. Ependymzelle basalen boWerkzeuge werden in einem Patch auf der apikalen Oberfläche gebündelt. Dieser Patch von der Mitte der apikalen Oberfläche im downstream "-Richtung in Bezug auf CSF-Flow (translationale Polarität) verdrängt; in diesem Patch wird jede Basaltemperatur um seine Längsachse, so dass die basalen Fuß, ein Accessoire der basalen Körper, weist in die Richtung der Strömung (Rotations-Polarität). Benachbarte Ependymzellen haben ihre Basalkörper in die gleiche Richtung. Wichtig ist, dass videomicrographs der Ependymzellen Flow-Assay verwendet, um direkt vergleichen die Strömung in einem bestimmten Bereich der seitlichen Wand um die Ausrichtung der Ependymzelle Basalkörper in dieser Region (Abbildung 4).

Neben der Bereitstellung einer Panorama-Sicht der größte germinal Region im Gehirn von Erwachsenen, mit höherer Leistung Bildgebung, ermöglichen wholemounts eine vollständige und detaillierte Analyse der einzelnen zellulären Morphologie in der SVZ. Hohe Leistung konfokale Bildgebung von GFAP Immunfärbung auf wholemounts hat ergeben, dass Typ B1-Zellen, die neben ihrer kurzen Ventrikel-Kontakt apikalen Prozesses, haben eine lange basalen Prozess in Kontakt mit Blutgefäßen (Abbildung 5) 4. Diese Zytoarchitektur hatte zuvor nicht in koronalen Abschnitte geschätzt, weil der basalen Prozess läuft meist parallel zur Ventrikelwand. Serielle Schnitte schneidet daher einzelne Zellen in kleine Bruchstücke, so dass es fast unmöglich, eine Zelle s komplette Morphologie zu rekonstruieren oder seine Beziehung zu anderen Zelltypen in der SVZ zu verstehen. Die wholemount Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber der klassischen Schnitte Techniken, sowohl in mit Panoramablick mit Low-Power-Mikroskopie und eine vollständige Sicht der einzelnen Zellen mit hoher Leistung Mikroskopie. Diese Technik wird auch weiterhin eine wichtige Ergänzung zur zukünftigen Studien dieser erwachsenen Gehirn Keimzone werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Netzwerk von wandernden Nervenzellen Ketten in der SVZ. Tiled konfokalen Bildern zu rekonstruieren einer Seitenwand wholemount, die mit Antikörpern gegen Doublecortin, die Migration von Neuroblasten Etiketten in der SVZ gefärbt war. Es gibt zwei allgemeine Migrationsströme, von denen einer dorsal über und man läuft ventral um die Haftung Punkt, durch den Stern (*) gekennzeichnet. Die Pfeile zeigen die anterioren (a) und dorsal (d) Richtungen. Maßstab = 1 mm.

Abbildung 2
Abbildung 2. Beziehung zwischen dem Gefäßsystem und sich teilenden Zellen in der SVZ. Diese Seitenwand wholemount wurde mit Antikörpern für Ki67 immungefärbt, sich teilende Zellen in grün, und Antikörper gegen Maus-Immunglobuline Etikett, auf das Gefäßsystem in roten Etikett. Da diese wholemount war nicht mit Kochsalzlösung vor der Färbung perfundiert, bleiben die endogene Maus-IgG-Moleküle innerhalb der Blutgefäße und werden durch sekundäre Anti-Maus-Antikörper gefärbt. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass die Aufteilung SVZ-Vorstufen (grün) in der Nähe von Blutgefäßen (rot) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie 2008 # 6522} befinden. Die Pfeile zeigen die anterioren (a) und dorsal (d) Richtungen. Maßstab = 1 mm.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die apikale Oberfläche der Ventrikel-Kontakt-Zellen an der Seitenwand. Hohe Leistung konfokalen Bild eines wholemount immungefärbt für β-Catenin, um Zellmembranen in grünem Etikett, und γ-Tubulin, um Basalkörper in roten Etikett zeigt die planare Organisation dieser Epithelzellen. Typ B1-Zellen, die adulten neuralen Stammzellen, haben einen kleinen apikalen Oberfläche mit einem einzigen Basaltemperatur, durch Pfeile angedeutet. Die apikale Oberfläche dieser Zellen wird durch die große apikale Oberfläche der Ependymzellen in ein Windrad Konfiguration umgeben. Ependymzellen haben planare Polarität durch die Stellung ihrer vielfältigen Basalkörpern auf der apikalen Oberfläche angezeigt. Benachbarte Ependymzellen haben ihre Basaltemperatur-Cluster auf der gleichen Seite der apikalen Oberfläche (nach unten und nach links in dieser Region) befindet, entsprechend der Richtung des Liquorfluss {Mirzadeh, 2010 # 6573}. Balken = 10 um.

Abbildung 4
Abbildung 4. Die Ependymzellen flow Test. Composite-Bild durch die Zusammenlegung 100 sequentielle Bilder von einem Film während der Ependymzellen flow Test aufgenommen wurden. Fluoreszierende Mikrokügelchen hinterlegt dorsal und posterior, die Haftung Bereich von Ependymzellen Zilien wurden in zwei orientierten Streams, eine über und eine unter der Haftung angetrieben, in Richtung des Foramen Monro. Diese orientiert flow zeigt den funktionalen planaren Polarität der Ependymzellen. Jede Flow Linie zeigt die Position eines einzelnen Perle an aufeinander folgenden Zeitpunkten. Maßstab = 0,5 mm.


Abbildung 5. GFAP + Typ B1-Zellen haben eine lange basalen Faser mit end-Füße auf die Blutgefäße. Maximale Projektion einer hohen Leistung konfokalen Stack von einer Seitenwand wholemount genommen immungefärbt mit GFAP Antikörpern gegen SVZ Astrozyten Etikett. Diese Färbung Etiketten adulten neuralen Stammzellen, oder geben Sie B1-Zellen, die eine apikale Ende der ventrikulären Oberfläche haben, und wie hier gezeigt, eine lange GFAP + basalen Faser, die auf die Blutgefäße (Pfeile) endet. Blutgefäße sind hier, weil der sekundäre Antikörper verwendet, um zu visualisieren Maus-Anti-GFAP Antikörper erkennen endogene Maus-IgG im Gefäßsystem gefärbt. Balken = 50 um.

Discussion

Die meisten Studien der Neurogenese in ventrikuläre und subventrikulären Zonen auf klassischen Schnitte Techniken verlassen, um die Mikroanatomie und zellulären Zusammenhänge in diesen Regionen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine alternative Technik, zuerst verwendet, um das Netzwerk der wandernden Ketten von Neuroblasten in der SVZ 1 erzeugt analysieren, dann verwendet werden, um die Regeneration des SVZ Vorläufer-Population nach anti-mitotische Behandlung 6, und in jüngster Zeit verwendet, um den genauen apikalen Studie Studie und basalen Zell-Zell-Interaktionen von Erwachsenen SVZ neuralen Stammzellen 2,3,4. Interessanterweise hat diese Technik ergeben, dass die neuralen Stammzellen, oder geben Sie B1-Zellen, der erwachsenen SVZ Teil eines gemischt Neuroepithel mit differenzierten nicht-teilenden Ependymzellen sind. En-face-Aufnahme nach wholemounts hat gezeigt, dass dieser gemischten Neuroepithel Windrad-Architektur, bestehend aus den apikalen Enden des Typs B1-Zellen durch große apikalen Oberflächen der Ependymzellen 4 umgeben ist. Das En-face-Analyse hat unser Verständnis von der Linie von neuralen Stammzellen in embryonalen und adulten Gehirn als bestehend aus Zellen mit apikalen Enden an den Ventrikel Oberfläche und basale Prozesse Kontaktaufnahme mit einem vaskulären Nische geklärt. Diese Ergebnisse würden beinahe unmöglich gewesen Verwendung klassischer Schnitte Techniken. Wholemounts auch die Identifizierung von neuralen Stammzellen über ihre Ventrikel-Kontakt apikale Prozess. Als weitere spezifische Marker für diese Stammzellen gefunden werden, wird wholemounts ein integraler Bestandteil der Identifizierung und Analyse von neuronalen Stammzellen Verhalten sein.

Wholemounts der Seitenventrikel Wände bieten auch die ideale Perspektive für das Studium der planaren Polarität der Ependymzellen. Ependymzellen sind multiciliated Zellen entlang der Herzkammern, die CSF in einer koordinierten Art und Weise anzutreiben Funktion. Mit dem wholemount Technik wird die gesamte Ependymzellen Epithel en-face ausgesetzt und kann gebeizt und umfassend von der vorderen untersucht, um posterior und dorsal nach ventral Grenzen. Darüber hinaus Ependymzellen-Flow-Assays auf akut seziert durchgeführt, live wholemounts robust zeigen die ebene polarisierte flow von Ependymzellen Cilien erzeugt. Neuere Arbeiten mit wholemount Ansätze hat zellulären Determinanten dieser Ependymzellen planaren Polarität 5 freigelegt. Interessanterweise haben wholemount Studien auch vorgeschlagen, dass Ependymzellen-generated Liquorfluss Steigungen chemorepellents, dass die Abwanderung junger Neuronen in der SVZ 7 Leitfaden stellt. Wholemount Ansätze, die zunächst identifiziert das Netzwerk der wandernden Nervenzellen Ketten sind daher weiterhin Einblicke in Mechanismen, die Kette Migration.

Die Analyse der VZ und SVZ durch wholemount Bildgebung wird ein neuer Ansatz für zukünftige Studien und ein Weg, um unser Verständnis der vorhandenen Studien zu klären. Zum Beispiel, schlug einer aktuellen Studie, dass neurale Stammzellen im erwachsenen SVZ CD133 + / CD24-Zellen wurden in Kontakt mit der Herzkammer 8. Basierend auf ihrer Immunfärbung in den Abschnitten, behauptete diese Autoren, dass diese Zellen eine Subpopulation von multiciliated Ependymzellen wurden. Doch in unserer Studie mit dem wholemount Ansatz, der eine umfassendere Sicht auf die gesamte Ependymzellen Epithel gibt, fanden wir, dass alle Ependymzellen ausdrückliche CD24 und die einzige Herzkammer-Kontakt-Zellen, die CD133 wurden + / CD24-waren eine Teilmenge des Typs B1 Zellen 4. Darüber hinaus verspricht die wholemount Technik, um auch in Zukunft Studien, die kürzlich beschriebenen Mosaik Organisation von neuronalen Stammzellen im erwachsenen Gehirn 9 Nützliche. Mehrere Studien haben gezeigt, dass neurale Stammzellen im erwachsenen Gehirn keine homogene Bevölkerung, sind aber regional festgelegt und produzieren normalerweise nur bestimmte Subtypen der Riechkolben Interneuronen. Diese Studien haben vorgeschlagen, dass verschiedene Subpopulationen von neuralen Stammzellen können entweder durch die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren 10,11,12,13,14 und / oder durch ihre regionale Lokalisation entlang der dorsal-ventral und anterior-posterior Ausdehnungen der unterschieden werden Seitenwand 9,15,16. Als weitere molekulare Marker der regional festgelegten Subpopulationen von adulten neuralen Stammzellen identifiziert sind, sollte wholemount Bildgebung bieten einen umfassenden Blick auf die parcelation dieser unterschiedlichen Vorläuferzellen Domänen entlang der Ventrikelwand.

Die wholemount Dissektion und bildgebende Verfahren hier vorgestellten kann auch verwendet werden, um die Ventrikelwände in den Embryo zu analysieren. Die Zerlegung des embryonalen lateralen Wand durchgeführt wird, Schritt-für-Schritt, in der gleichen Weise. Es gibt nur geringe Unterschiede in der Schwierigkeit, die embryonale Ventrikel sind relativ größer machen die Präparation einfacher, aber das Gewebe weicher macht Manipulationen erschwert. Insbesondere kann eine ähnliche Darstellung des lateralen Ventrikel in Embry verwendet werdenos zu sezieren die kortikale Wand des Ventrikels auf kortikale Neurogenese zu studieren. Jüngsten Untersuchungen zufolge asymmetrische Zentrosom Erbe pflegt radialen Gliazellen an der ventrikulären Oberfläche während kortikale Neurogenese 17. En-face Bildgebung von radialen Gliazellen apikalen Oberflächen bieten Einblicke in die Zentrosomen in diesen teilende Zellen sind asymmetrisch vererbt.

Wie bei den meisten Techniken, insbesondere solche, bei denen eine präzise Fingerfertigkeit erfordert Meisterschaft zu praktizieren. Es gibt jedoch einige Elemente in der Sektion, die Schlüssel zu einer besseren Ergebnisse sind: 1) Beleuchtung Anpassung der Beleuchtung der Probe, um Schatten zu schaffen liefert wertvolle Kontrast bei der Präparation von Gewebe, die sonst relativ homogen, 2) mit der Zange wie zwei Insektennadeln der Zange in dieser Technik sind nie verwendet werden, um Prise zusammen oder holen Sie sich Gewebe, sind aber als wendiger Stifte, die ständig nachjustiert, um das Gewebe zu stabilisieren können beim Schneiden, 3) ein ausgewogenes Verhältnis von sanften Einfahren und Schneiden der Messer sollte nicht nur verwendet werden, um geschnitten, sondern auch auf sanfte Rückzug liefern, um die medialen und lateralen Wände trennen, nicht vergessen, dass die Mehrheit dieser Sektion ist eigentlich durch sanfte Einziehen nur mit unterbrochenem Schnitt durchgeführt werden.

Acknowledgments

Arbeit unterstützt durch NIH HD-32116, der Sandler Familie Unterstützung Foundation, The John Bowes Stem Cell Fund, MEXT, MHLW und HFSP. ZM durch die Carlos Baldoceda Foundation und UCSF Krevans Fellowship unterstützt. AA-B. hält die Heather und Melanie Muss Stiftungslehrstuhl.

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Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss
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Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

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