Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

אזור Subventricular En פנים: מכתים Wholemount ושפל Ependymal

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

קירות החדר לרוחב נבטי להכיל את האזור הגדול ביותר במוח של יונקים בוגרים. באופן מסורתי, מחקרים על נוירוגנזה באזור זה יש לסמוך על טכניקות חתך קלאסית לניתוח היסטולוגית. כאן אנו מציגים גישה חלופית, הטכניקה wholemount, אשר מספק מקיף, en פנים נוף של האזור הזה נבטי.

Abstract

קירות החדרים לרוחב נבטי להכיל את האזור הגדול ביותר במוח של יונקים בוגרים. אזור subventricular (SVZ) בקירות אלה היא מערכת מודל למד בהרחבה להבנת התנהגותם של בתאי גזע עצביים, והסדרת neurogenesis למבוגרים. באופן מסורתי, מחקרים אלו הסתמכו על טכניקות חתך קלאסית לניתוח היסטולוגית. כאן אנו מציגים גישה חלופית, הטכניקה wholemount, אשר מספק מקיף, en פנים נוף של האזור הזה נבטי. לעומת חלקים, wholemounts לשמר את cytoarchitecture להשלים ויחסים הסלולר בתוך SVZ. גישה זו חשף לאחרונה כי תאים בוגרים גזע עצביים, או בתאים B1 סוג, הם חלק neuroepithelium מעורבת עם תאים ependymal הבדיל רירית החדרים לרוחב. בנוסף, בגישה זו נעשה שימוש כדי ללמוד את הקיטוב מישוריים של תאים ependymal ואת זרימת הנוזל השדרתי שהם מייצרים בתוך החדר. עם עדויות חדשות לפיהן מבוגר בתאי גזע עצביים הם אוכלוסייה הטרוגנית המצוין אזורית, הגישה wholemount צפוי להיות כלי חיוני להבנת הארגון פרצלציה של נישה זו בתאי גזע.

Protocol

I. הכנת micropipettes זכוכית מלאה microbeads פלורסנט עבור Assay תזרים Ependymal (השלבים הבאים עשויים להיות דילג אם הכנת wholemounts למטרות מכתים בלבד).

  1. Secure צינור Wiretrol 5 ul נימי זכוכית על זכוכית micropipette חולץ ולהתאים הגדרות מחמם סולנואיד למשוך פיפטה עם להתחדד, חלק רדוד.
  2. צרף מקור של לחץ אוויר חיובי על סוף micropipette משכו בעדינות את קצה התחתון של פיפטה על משטח סבכת מתכת 45 ° זווית כדי ליצור קצה משופעים. לחץ אוויר חיובי עוזר לנקות פסולת זכוכית מבפנים של פיפטה. נקו את קצה קצה משופעים עם רקמה אתנול לחלח.
  3. בדוק את קצה פיפטה תחת מיקרוסקופ עם מיקרומטר. טיפ צריך להיות שפוע חלקה בקוטר פתח פנימי של 100 ~ אממ. בקטרים ​​קטנים יותר ניתן להשתמש אך לעיתים לגרום לסתימה של פיפטה עם חרוזי ניאון.
  4. למילוי פיפטה עם שמן מינרלי עד חצי מלא, ולאחר מכן להוסיף גריז טבל הבוכנה לחלק האחורי של טפטפת. Advance במניסקוס של שמן מינרלי אל קצה פיפטה ידני על ידי דוחפים את הבוכנה.
  5. אבטח את micropipette ו הבוכנה על micromanipulator, ואז בורג בעל פיפטה micromanipulator על הזרוע נייח קטן עם גובה מתכוונן.
  6. Frontload פיפטה עם פתרון microbead פלורסנט, בהיקף של 50% מניות פתרון פלורסנט microbead, 45% מים, ו - 5% גליצרול. גליצרול נוסף כדי להגדיל את הצפיפות של התמיסה, כך שכאשר מופקדים על wholemount microbeads את הכיור על פני השטח.
  7. מניחים את micromanipulator במקום בטוח בו את המחט לא יהיה שבור בטעות ולהמשיך עם דיסקציה wholemount.

השנייה. Dissection קיבוע Wholemount ו

  1. כדי להתכונן לנתיחה wholemount, בכמות מספקת החם של L-15 ליבוביץ מדיה 37 ° C. אתה צריך כ 10 מ"ל לכל חיה אתה מתכוון לנתח. גם לאסוף את כל אספקה ​​תצטרך לנתיחה ו קיבעון על ידי stereomicroscope: מספריים, מלקחיים גדולים שיניים, מלקחיים בסדר חלקה, Sharpoint 22.5 ° סכין microsurgical לדקור, צלחת לנתח, מגבת נייר, שקית Biohazard, וצלחת 24 גם על הקרח מלא paraformaldehyde 4% עם או בלי 0.1% Triton X-100. טריטון X-100 משמש כדי להקטין את מתח הפנים של התמיסה PFA, אשר מקטין את שכיחות הגז משטח wholemount כאשר הוא שקוע בפתרון זה.
  2. יוצקים 5-10 מ"ל של התקשורת חיממה לצלוחית לנתח תחת stereomicroscope ניאון. כלים לנתח מוכנים ידי שפיכת פולימר אלסטי, שנקרא Sylgard 184, לתוך צלחת פלסטיק 6 ס"מ ולתת את התרופה פתרון פולימר שבוע 1 תחת ואקום, אז ביסודיות לשטוף כלים כמויות גדולות של מים לפני השימוש. בדרך כלל, אנחנו נותנים את הכלים להשרות במים בכוס 1 L שבוע 1.
  3. החיה היא הקריבה על ידי נקע בצוואר הרחם וראש מנותקת.
    הערה: אם תרצה, הדם עשוי להיות מסומנת על ידי מ vasculature המרוססת החיה עם מלח רגיל לפני לנתח את המוח. הדבר חשוב במיוחד אם ביצוע immunostaining chromogenic עם diaminobenzidine (DAB).
  4. חתך קו האמצע הוא עשה, אל אחורי קדמי, יחד הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
  5. סדרה של 4 חתכים בגולגולת עשויים לפתוח את הגולגולת: חתך אחד משתרע על פני שני מסלולים הקדמי של נורות חוש הריח, את שני החיתוכים הבאים נחותים במוח הקטן ולהפריד את הגולגולת מבסיס הגולגולת, ואת לחתוך סופית פועל האחורי אל הקדמי לאורך תפר אמצע sagittal.
  6. דשי גולגולתי הם חזר בו בעדינות את המוח מופק ו להציב לתוך צלחת הניתוחים.
  7. יתר לנתיחה מבוצע תחת stereomicroscope. ראשית, נורות חוש הריח הם גזור מן המוח. אם ברצונך בנוסף לבחון את נורות חוש הריח, פשוט לתקן אותם על ידי טבילה 4% PFA לילה ואתה יכול להכין אותם לאחר מכן חתך ו מכתים.
  8. מחלקים את המוח לאורך הבקע interhemispheric.
  9. לחתוך coronally מוכווני הוא עשה אז הפן האחורי ביותר של הבקע interhemispheric, המאפשר ההיפוקמפוס הזנב להיות דמיינו בחתך.
  10. ההיפוקמפוס, אשר מהווה את הקיר המדיאלי של החדר לרוחב בעמדה זו, אז צריך להשתחרר הקורטקס שמעליה, אשר מהווה את הגב לקיר, לרוחב של החדר. ראשית, הסכין מוחדרת לחלל החדר קטן בין קליפת המוח להיפוקמפוס ו dorsally, ואת החתך בקליפת המוח שבו הוא משקף ventrally, הרחק קו האמצע, להצטרף בהיפוקמפוס. לאחר החתך, בקליפת ניתן קלופים לאט מן ההיפוקמפוס כדי לחשוף את החדר נע לרוחב הגב על הגחון. תמרון זהמזורז על ידי חיתוך חיץ של קליפת בפינת שבו ההיפוקמפוס שוחרר. לאחר שהגיע היקף הגחון ביותר של החדר לרוחב במיקום זה, ייתכן גם לחזות או לחוש בו בקליפת שוב עוטפת סביב, הפעם המשקף חזרה מדיאלית, להצטרף בהיפוקמפוס. לחתוך נוספת צריכה להיעשות במצב זה לגמרי לשחרר את ההיפוקמפוס או הקיר המדיאלי של החדר הלטרלי של הקורטקס או לרוחב הקיר של החדר לרוחב.
  11. אז זה יהיה קל למשוך את ההיפוקמפוס הרחק בקליפת המוח, מדיאלית ו anteriorly, כדי לפתוח את החדר לרוחב נרחב.
  12. המשך משוך בעדינות את ההיפוקמפוס anteriorly באמצעות משיכות קטנות של מלקחיים וסכין לחזור בו קירות המדיאלי ו לרוחב בנפרד.
  13. לאחר התנגדות נסיגת זה מתחיל לעלות, קיצוצים נוספים נדרשים. ראשית, להגדיל את החשיפה שלך לרוחב החדר, ובמיוחד את הקיר לרוחב SVZ, לנתח משם קליפת המוח. קליפת המוח היא נקייה גזור משם על ידי לדמיין את הממשק בין כפיס המוח ואת VZ / SVZ. כל שעליך לעשות הוא לחתוך לאורך ממשק זה נשאר בצד callosal כדי למנוע נזק SVZ.
  14. כדי להמשיך retracting הקיר המדיאלי מהקיר לרוחב, שני חתכים נוספים נדרשים: חתך אחד dorsally שבו לרוחב הקיר, הקיר המדיאלי, ואת קליפת כל להתכנס, ואחד לחתוך ventrally שבו לרוחב הקיר, הקיר המדיאלי, ו התלמוס להתכנס. עם הקיצוצים האלה עשו, נסיגת עדין נוספת על הקיר המדיאלי מאפשר את מידת הקדמי ביותר של החדר לרוחב להיפתח.
  15. תאורה נכונה היא חיונית לאורך ההליך ובמיוחד לשלב הבא שבו קירות המדיאלי ו לרוחב מופרדות anteriorly. בעמדה זו הקדמי של החדר לרוחב, הקיר המדיאלי משקף הלוך היא רציפה עם הקיר לרוחב. להתאים את התאורה כך מטילים צללים בין שני קירות לחשוף את הנקודה הזו השתקפות, המופיע כמו בעמק שבין שני הקירות. גזור בדיוק בעמק להפריד בין שני קירות.
  16. לבסוף, לגמרי לחשוף את הקיר לרוחב על ידי הסרת כל הקליפה התלויים dorsally לבין התלמוס ventrally.
  17. אם מכינים wholemounts עבור immunostaining, להעביר בזהירות את הצד wholemount, החדר למעלה, מצלחת לנתיחה לתוך צלחת 24 גם מלא PFA 4% עם או בלי 0.1% X100-טריטון עבור קיבעון לילה בשעה 4 ° C. עבור קיבעון רגיש אנטיגנים, wholemounts עשוי להיות קבוע לתקופות קצרות של זמן. אז המשך לסעיף 4 על wholemounts immunostaining.
  18. אם מכינים wholemounts לניתוח זרימת ependymal, העברת wholemount לצלחת לנתיחה נקי מלאים טריים, 37 בינוני ° C ליבוביץ ולהמשיך לסעיף הבא.

ג. ניתוח תזרים Ependymal באמצעות microbeads פלורסנט

  1. לשתק את wholemount על צלחת נקייה באמצעות לנתח 2 סיכות חרקים, אחד בתלמוס אחד בפינה קדמית-הגבי של wholemount.
  2. מניחים את בסיס הזרוע נייח מחזיק את micromanipulator ליד stereomicroscope. ודאו את גובה הזרוע מתכווננת מוגבהת מקסימלית כדי למנוע שבירת מחט נגד המנה לנתיחה.
  3. בזהירות לטבול את קצה המחט בתקשורת בצינור ependorf לנקות את microbeads שנמצאים בקצה החיצוני של המחט. אם אלה לא מנקים משם, הם יכולים לאחר מכן להיות מופקד על פני השטח wholemout בשוגג במהלך מיצוב מחט ולהפחית את האיכות הכוללת של הסרט.
  4. מקם את חוד המחט על פני השטח הגבי של הקיר לרוחב ולהפחית את הזרוע כדי להביא את קצה מחט לתוך המדיום. המחט צריכה להיות הוריד עד שהוא רק מעל פני קיר לרוחב.
  5. בעזרת המחט בעמדה, להתאים את הזום ואת להתמקד stereomicroscope כדי לכסות שדה הרצוי. אם יהיה לבצע הקלטה של ​​תזרים ependymal, להתחיל לרכוש תמונות בשלב זה.
  6. הוצא ~ 5 nl הפתרון microbead על פני השטח של wholemount. לאחר בולוס ראשוני של חרוזים כבר פינה את השטח על ידי זרימת ependymal, סיבובים נוספים של פליטה חרוז יכול להתבצע.

IV. Immunostaining Wholemounts

  1. Wholemounts גזור עבור immunostaining הם טבילה קבועה לילה PFA 4% עם או בלי 0.1% Triton-X100 ב 4 ° C. השימוש X100-טריטון היא המועדפת עבור אנטיגנים כי לסבול את הטיפול הזה, אבל יכול להיות שמאל החוצה במקרים בהם איכות מכתים היא פחתה על ידי חומר ניקוי.
  2. למחרת בבוקר, PFA הוא aspirated מהצלחת 24 הבאר wholemounts נשטפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד 0.1 M-PBS עם או בלי 0.1% Triton-X100. כמו בעבר, השימוש X100-טריטון עדיפה, אבל לא חובה, לכל רוחץ בפרוטוקול זה. לאורך כל פרוטוקול זה, מחליפים פתרונות על כלהר דורש שאיפה זהיר של הפתרון מהצד של הבאר. ואז, גם הוא מחדש עם פתרון בעזרת פיפטה העברת בזווית כזו פתרון שוטף על הצד של הבאר, לא ישירות על גבי wholemount. תשמרי על עצמך כדי לשמור את הצד החדר של wholemount פונה כלפי מעלה בכל עת. Pipetting נמרץ של פתרונות לעיתים קרובות להפוך את wholemount. אנחנו מעדיפים להחליף פתרונות מעל wholemount 1 בכל פעם כדי למנוע רקמות מהתייבשות.
  3. אחרי כביסה את PFA, wholemounts מודגרת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר פתרון חסימה, המכיל עז נורמלי 10% או בסרום החמור 0.1 M-PBS עם או בלי X100-טריטון. אם אתה משתמש טריטון-X100 עבור מכתים שלך, אתה יכול לבחור להשתמש או 2% או 0.5% Triton-X100 בפתרון חסימה. אנו משתמשים 2% Triton-X100, כאשר מכתים עבור אנטיגנים הדורשים חדירה נוגדן עמוק יותר לתוך הרקמה, כגון אלה אנטיגנים הממוקמים SVZ. עם זאת, כאשר מכתים עבור אנטיגנים ממוקם קרוב לפני השטח של הקיר לרוחב, כגון אנטיגנים הנמצאים על פני השטח של תאים apical ependymal, אנו משתמשים 0.5% Triton-X100. בנוסף, טריטון-X100 ניתן להשאיר את פני השטח של תאים או אנטיגנים אחרים מוסרים או שונו על ידי חומר ניקוי.
  4. בשלב הבא, להסיר את פתרון חסימת ולהוסיף נוגדנים העיקרי מדולל הפתרון חוסם אותו דגירה של 24 או 48 שעות 4 ° C. הבחירה של תקופת הדגירה תלוי אנטיגן, בדומה לבחירה של טריטון 0.5% או 2%. עבור אנטיגנים הממוקמים על פני השטח של wholemount, די הדגירה 24 שעות. עם זאת, עבור אנטיגנים הממוקמים עמוק יותר, כמו ב SVZ, תקופות הדגירה 48 שעות לספק תוצאות טובות יותר.
    לדוגמה, כדי ללמוד את השטח apical וגופים הבסיסי של התאים המצפים את הקיר לרוחב החדר, כתם עם נוגדנים β-catenin, לתייג את קרום התא, ו γ-טובולין, לתייג גופים הבסיס. מדולל אנטי β-catenin עכבר נוגדנים (1:500) ואנטי γ-טובולין ארנב נוגדנים (1:1000) ב 0.1 M PBS המכילה 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton-X100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    כדי להכתים את תאים בוגרים גזע עצביים, או בתאים B1 סוג, כתם על הקיר לרוחב עם נוגדן GFAP. מדולל אנטי GFAP עכבר נוגדנים (1:500) ב 0.1 M PBS המכילה 10% נסיוב עז רגילה 2% Triton-X100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  5. נוגדנים ראשיים הם לשטוף תחילה PBS עם או בלי 0.1% Triton-X100 על ידי 2 מהיר ושוטף. ואז לעשות 3 שוטף נוסף במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר.
  6. מדולל נוגדנים משני הפתרון חוסם אותו המשמש נוגדנים ראשוניים להוסיף wholemounts כדי לדגור על אותו אורך זמן כמו נוגדנים העיקרי ב 4 ° C.
    לדוגמה, עבור מכתים עבור catenin-β ו-γ טובולין: לדלל אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עז נוגדנים (1:400, מזהה את העכבר אנטי β-catenin) ו אלקסה פלואוריד 594 נגד ארנב נוגדנים עזים (1:400, מכירה ארנבת אנטי γ-טובולין) ב 0.1 M PBS המכילה 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton-X100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    עבור immunostaining GFAP: לדלל אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עז נוגדנים (1:400, מזהה עכבר אנטי GFAP) ב 0.1 M PBS המכילה 10% נסיוב עז רגילה 2% Triton-X100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  7. נוגדנים משני נשטפים את wholemount שימוש שוטף אותו ביצעה עבור נוגדנים ראשוניים.
  8. אם תרצה, גרעיני נגד מכתים ניתן לבצע בשלב זה על ידי דוגרים ב DAPI מדולל PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף פעם אחת PBS.

V. הרכבה Wholemounts Immunostained על שקופיות עבור מיקרוסקופיה confocal

  1. עבור הדמיה confocal ברזולוציה גבוהה, בעקבות immunostaining wholemounts צריכה להיות תת גזור לשמר רק את הקיר לרוחב של החדר לרוחב כמו רסיס של רקמה עבה 200-300 אממ. הפרדת הקיר לרוחב מן בסטריאטום הבסיסי מאפשר לה להיות מותקן על גבי שקופית מכוסה coverslip בצורה שטוחה.
  2. חזור אל stereomicroscope עם wholemounts immunostained וכלי וציוד כדלהלן: מלקחיים בסדר חלקה, Sharpoint 22.5 ° microsurgical לדקור בסכין, צלחת לנתח, שקופיות מיקרוסקופ coverslips, 0.1 מ PBS, בינוני הרכבה Aquamount.
  3. מעבירים את wholemount מהצלחת 24 היטב כדי בצלחת לנתח המכיל 0.1 M PBS נזהר לשמור בצד החדר למעלה.
  4. ראשית, להסיר לחלוטין את קליפת הגבי של wholemount מן האחורי אל הקדמי דווקא על ידי חיתוך לאורך הקו שבו כפיס המוח פוגש את הקיר לרוחב. זו מוכרת כממשק בין החומר הלבן callosal ואת SVZ ורוד להופיע.
  5. ואז לעשות חתך אופקית מונחה ארוך על פני ההיבט הגחון של wholemount. זה משטח לחתוך יספק פלטפורמה שעליה ניתן רח'abilize wholemount במהלך לשלב הבא של הניתוח.
  6. עם פני השטח הגבי של wholemount פונה כלפי מעלה, תוכל לדמיין את עובי של SVZ מן הקדמי אל האחורי לאורך הקיר לרוחב. שים לב כי השקפה זו התאפשרה על ידי הסרה הראשונית של קליפת המוח המאפשר בסטריאטום SVZ הבסיס להיראות. SVZ מזוהה הלהקה דקה של רקמה המשתרעת על פני חדרי בסטריאטום. SVZ יש מראה ורוד הומוגנית בעוד בסטריאטום הוא הסתננו מיתרי של החומר הלבן. שים לב SVZ הוא עבה anteriorly והופך בהדרגה רזה בדיעבד.
  7. לאחר שזיהית את הממשק של SVZ ו בסטריאטום, בזהירות להתחיל גזירה על הממשק הזה על ההיבט הקדמי ביותר של הקיר לרוחב, לקדם את הסכין מן הגב אל הגחון. כדי לעשות זאת במדויק, לייצב את wholemount עם מלקחיים שלך משמש שתי סיכות. אתה יכול גם להשתמש במלקחיים כדי להפוך את מעט wholemount לדמיין את להב לקידום מן הגב אל הגחון על פני קיר לרוחב. המפתח דיסקציה זה מיועד רסיס כתוצאה של רקמת להיות שטוח מאוד. משמעות הדבר היא כי כפי שאתה לחתוך את SVZ מ קדמית אחורית על פני קיר לרוחב, הכיוון של הקיצוץ שתבצע חייב להישאר במקביל פני החדר בכל עת.
  8. זכור כי יותר בדיעבד, SVZ הופך דק יותר. במקום דילול דיסקציה שלך לחתוך רק את SVZ בנקודה זו, חשוב כי כפי שאתה מראש בדיעבד, עובי רקמת להיות גזור נשאר זהה. פעולה זו תבטיח כי פיסת הרקמה תוכלו לאחר מכן הר שטוח.
  9. לאחר הפרדת לחלוטין את הקיר לרוחב מן בסטריאטום הבסיסית, בזהירות להסיר את כל הרקמות הסובבות אחרים רסיס זה כי הם לא חלק מהקיר חדרית.
  10. ואז להרים את רסיס מלמטה בעזרת מלקחיים שלך ומקם אותה במרכז של המיקרוסקופ שקופית. החל כמה טיפות של aquamount ישירות על גבי wholemount ומניחים בעדינות coverslip מרוכז על זה, מנסה לא להכניס בועות על פני השטח של הרקמה. המשקל של השקופית תבטיח מפזר aquamount באופן שווה יפיק משטחת מעודן של פני קיר לרוחב. כמות aquamount משומשים בגודל של coverslip תלויים בגיל הרקמה להיות גזור. עבור רקמות לאחר הלידה העוברית המוקדמת, אנחנו מעדיפים 1 טיפה של aquamount ו 22 "x 30" coverslip. Coverslips כבד עלול לעוות את רקמות aquamount יותר יפריע איכות ההדמיה כי לייזרים confocal יוכלו פחות לחדור שכבה דקה של aquamount המתגוררים בין coverslip ועל פני השטח רקמות. עבור רקמות לאחר הלידה מאוחר יותר מבוגר, אנו משתמשים 4 טיפות aquamount ו 24 "x 60" coverslip.
  11. מגלשות מאוחסנים אז שטוח בספר להחליק על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים לפני הדמיה לאפשר coverslips להתיישב.

נציג תוצאות

גישות Wholemount סיפקו תובנות מרכזיות לתוך הפעילות של נבטי SVZ מבוגר. הרשת של רשתות של נוירונים נודדים צעירים SVZ נצפתה לראשונה לאחר wholemounts של הקיר לרוחב של החדר לרוחב היו immunostained עם נוגדנים polysialylated מולקולה הידבקות התא העצבי (PSA-NCAM) 1. רשתות אלה של neuroblasts נודדות ניתן לראות לאחר immunostaining wholemounts עם נוגדנים doublecortin (איור 1). למרבה הפלא, רשת של שרשראות יש דפוס סטריאוטיפית, עם שני זרמים הכללי של התאים, אחד רץ dorsally על אחד רץ ventrally סביב נקודת הידבקות. Wholemounts של SVZ גם לספק תמונה מקיפה של פעילות שגשוג של אבות באזור זה, כפי שניתן לראות עם מכתים Ki67 באיור 2. באופן מעניין, שני מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על יחסי הגומלין ההדוקים בין חלוקת התאים SVZ ואת vasculature המקומית 2,3 (איור 2).

כאשר נבדק תחת מיקרוסקופ כוח גבוהה confocal, תצוגת en פנים שמספק wholemounts מאפשר נקודת מבט ייחודית של פני השטח apical של התאים המצפים את מערכת חדרית. זו פרספקטיבה en פנים חשף לאחרונה כי B1 SVZ סוג תאים, תאים בוגרים גזע עצביים, הם חלק neuroepithelium מעורבת עם אי - חלוקת תאים ependymal הבדיל 4. המשטח apical של B1 סוג הקשר התאים לרוחב החדר והוא מוקף משטחים apical גדול של תאים ependymal בתצורה שבשבת (איור 3, החצים מצביעים על משטחים B1 apical). יתר על כן, בחינה מדוקדקת של פני השטח של תאים apical ependymal חשף כי עמדת translational וכיוון הסיבוב של גופים הבסיס שלהם הם אינדיקטורים של הקוטביות שלהם מישורי 5. Ependymal basal התא בו מת מקובצים בתוך כתם על פני השטח apical. תיקון זה הוא העקורים ממרכז השטח apical בכיוון "במורד הזרם ביחס זרימת CSF (קוטביות translational); במסגרת תיקון זה, כל הגוף הבסיסי הוא הסתובב על הציר הארוך שלה כזה רגל הבסיס, אביזר של הבסיס הגוף, נקודות כיוון הזרימה (קוטביות הסיבוב). תאים ependymal שכנות יש גופים אוריינטציה הבסיס שלהם באותו כיוון. חשוב לציין, videomicrographs של assay תזרים ependymal ניתן להשתמש כדי להשוות ישירות את זרימת באזור מסוים של הקיר לרוחב האוריינטציה של גופי התא ependymal הבסיס באזור זה (איור 4).

בנוסף לספק נקודת מבט פנורמי על האזור נבטי הגדול במוח הבוגר, עם הדמיה כוח עליון, wholemounts לאפשר ניתוח מלא ומפורט יותר של מורפולוגיות הסלולר בודדים SVZ. הדמיה של עוצמה גבוהה confocal immunostaining GFAP על wholemounts גילה כי תאים מסוג B1, בנוסף קצר החדר שלהם, ליצור קשר עם תהליך apical, יש תהליך ארוך הבסיסי במגע עם כלי הדם (איור 5) 4. Cytoarchitecture זה לא היה מוערך בעבר בסעיפים העטרה כי התהליך הבסיסי מקביל ברובו לקיר החדר. חתך סידורי ולכן הקיצוצים תאים בודדים לרסיסים קטנים, מה שהופך אותו כמעט בלתי אפשרי לשחזר מורפולוגיה להשלים של התא, או להבין את הקשר של סוגי תאים אחרים SVZ. הגישה wholemount יש מספר יתרונות על פני שיטות חתך הקלאסית, הן במתן נוף פנורמי עם מיקרוסקופ כוח נמוך פרספקטיבה מלאה של תאים בודדים עם מיקרוסקופיה מתח גבוה. טכניקה זו תמשיך להיות בבחינת השלמה חשובה מחקרים עתידיים של אזור זה במוח הבוגר נבטי.

איור 1
באיור 1. רשת של רשתות נוירונים נודדים ב SVZ. תמונות confocal פרוש לשחזר wholemount הקיר לרוחב כי היה מוכתם נוגדנים doublecortin, אשר תוויות neuroblasts נודדות ברחבי SVZ. ישנם שני זרמים הכללית של ההגירה, אחד רץ dorsally על אחד רץ ventrally סביב נקודת הדבקה, מסומן בכוכבית (*). חצים מצביעים קדמית (א) ו הגבי (ד) להוראות. בר סולם = 1 מ"מ.

איור 2
איור 2. הקשר בין כלי הדם לבין התאים המתחלקים ב SVZ. Wholemount זו לרוחב הקיר היה immunostained עם נוגדנים Ki67, לתייג את התאים המתחלקים ב ירוק, נוגדנים נגד אימונוגלובולינים העכבר, לתווית vasculature באדום. כי זה לא היה wholemount perfused עם מלוחים לפני מכתים, עכבר מולקולות אנדוגני IgG להישאר בתוך כלי הדם הם מוכתמים על ידי אנטי עכבר נוגדנים משני. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי חלוקת מבשרי SVZ (ירוק) נמצאים בקרבת כלי הדם (אדום) {שן, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. חצים מצביעים קדמית (א) ו הגבי (ד) להוראות. בר סולם = 1 מ"מ.

איור 3
איור 3. המשטח apical של החדר, לפנות תאים על הקיר לרוחב. תמונה של הכוח העליון confocal wholemount immunostained עבור β-catenin, לתייג קרום התא בירוק, ו γ-טובולין, לתייג גופים הבסיס באדום, חושף את הארגון מישוריים אלה לתאי האפיתל. B1 סוג תאים, תאים בוגרים גזע עצביים, יש משטח apical קטן עם גוף הבסיס יחיד, שמסומן על ידי חיצים. פני השטח של תאים אלה apical מוקף פני apical גדול של תאים ependymal בתצורה שבשבת. תאים Ependymal יש קוטביות מישוריים מסומנים על ידי העמדה של גופים רבים הבסיס שלהם על פני השטח apical. תאים ependymal שכנות יש אשכולות הבסיס שלהם נמצא הגוף באותו צד של משטח apical (כלפי מטה שמאלה באזור זה), המקביל לכיוון זרימת CSF {Mirzadeh, 2010 # 6573}. בר סולם = 10 מיקרומטר.

איור 4
איור 4. Assay תזרים ependymal. הדימוי מורכב נוצר על ידי מיזוג 100 מסגרות רציפים מתוך הסרט שצולם במהלך assay את זרימת ependymal. Microbeads פלורסנט שהופקדו הגב ואת האחורי לאזור הידבקות הונעו על ידי cilia ependymal בשני הזרמים אוריינטציה, אחד מעל ואחד מתחת הידבקות, לכיוון foramen של מונרו. זו זרימה בכיוון חושף את הקוטביות מישוריים התפקודית של התאים ependymal. כל שורה מתארת ​​זרימה את המיקום של חרוז אחד בנקודות רצופות בזמן. בר סולם = 0.5 מ"מ.

> איור 5
איור 5. GFAP + B1 סוג התאים הבזליים יש סיב ארוך עם קצה הרגליים על כלי הדם. הקרנה מקסימלי של ערימה מתח גבוה confocal שנלקחו wholemount קיר לרוחב immunostained עם נוגדנים GFAP לתייג האסטרוציטים SVZ. זה מכתים תוויות מבוגר בתאי גזע עצביים, או בתאים B1 סוג, אשר סוף apical על פני החדר, ואת כפי שמוצג כאן, GFAP ארוך + סיבים הבסיס המסתיימת על כלי הדם (חיצים). כלי דם הם מוכתמים כאן כי את הנוגדן בשימוש משני לדמיין אנטי GFAP העכבר לזהות נוגדנים IgG עכבר אנדוגני בתוך כלי הדם. בר סולם = 50 מיקרומטר.

Discussion

רוב המחקרים של neurogenesis באזורי חדרית ו subventricular יש לסמוך על טכניקות חתך קלאסי לבחון את microanatomy ויחסים הסלולר באזורים אלו. כאן אנו מתארים טכניקה חלופית, לראשונה לנתח את רשת של רשתות הנדידה של neuroblasts שנוצר SVZ 1, לאחר מכן נעשה שימוש כדי ללמוד התחדשות של האוכלוסייה אבי SVZ בעקבות טיפול אנטי mitotic 6, בשימוש לאחרונה ללמוד את apical מדויק ועל הבסיס תאים תאים האינטראקציות של תאים בוגרים SVZ גזע עצביים 2,3,4. מעניין לציין, כי טכניקה זו גילה כי תאי גזע עצביים, או בתאים B1 סוג, של SVZ מבוגרים הם חלק neuroepithelium מעורבת עם חלוקת תאים בלתי מובחנים ependymal. En פנים באמצעות הדמיה wholemounts הראו כי זה neuroepithelium מעורבת יש ארכיטקטורה שבשבת המורכבת קצות apical של תאים מסוג B1 מוקפת משטחים apical גדול של תאים ependymal 4. זה ניתוח en פנים הבהיר ההבנה שלנו של השושלת בתאי גזע עובריים עצביים במוח למבוגרים כמורכב תאים עם סיומות apical על פני החדר ותהליכים הבסיס פנייה נישה וסקולרית. ממצאים אלו היה כמעט בלתי אפשרי באמצעות טכניקות חתך הקלאסית. Wholemounts גם להקל על זיהוי של בתאי גזע עצביים באמצעות תהליך החדר שלהם, פנייה apical. כמו סמנים ספציפיים יותר עבור אלה בתאי גזע נמצאים, wholemounts יהיה חלק בלתי נפרד של זיהוי וניתוח התנהגות בתאי גזע עצביים.

Wholemounts של קירות החדר לרוחב גם לספק את הפרספקטיבה אידיאלי ללמוד את הקוטביות מישוריים של תאים ependymal. תאים Ependymal הם תאים המצפים את החדרים multiciliated כי הפונקציה כדי להניע CSF באופן מתואם. בעזרת הטכניקה wholemount, האפיתל ependymal כולו חשוף en-פנים יכול להיות מוכתם ולמד מקיף מן הקדמי שלה גבולות הגחון האחורי ואת הגב אל. יתר על כן, מבחני תזרים ependymal שבוצעו על גזור היטב, wholemounts לחיות וחסונה להדגים את זרימת מקוטב מישורי שנוצר על ידי cilia ependymal. מחקר שנערך לאחרונה באמצעות גישות wholemount חשף הגורמים הסלולר של הקוטביות הזאת מישוריים ependymal 5. מעניין לציין, כי מחקרים wholemount הראו גם כי ependymal שנוצר זרימת CSF קובע הדרגתיים של chemorepellents המנחים את נדידת נוירונים צעירים SVZ 7. גישות Wholemount כי בתחילה זיהו את רשת של רשתות נוירונים נודדים ולכן הם ממשיכים לספק תובנות מנגנוני ויסות הגירה שרשרת.

ניתוח של VZ ו SVZ ידי wholemount הדמיה מוסיפה גישה חדשה הן עבור מחקרים עתידיים ודרך להבהיר את ההבנה שלנו של מחקרים קיימים. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה הציעו כי תאי גזע עצביים של SVZ מבוגרים היו CD133 + / CD24-תאים במגע עם 8 החדר. בהתבסס על immunostaining שלהן בסעיפים, מחברים אלה טענו כי תאים אלה היו subpopulation של תאים ependymal multiciliated. עם זאת, במחקר שלנו באמצעות גישה wholemount, אשר נותן תמונה מקיפה יותר של האפיתל ependymal כולו, מצאנו כי כל התאים ependymal לבטא CD24 ואת רק החדר, ליצור קשר עם תאים שהיו CD133 + / CD24-היית משנה של B1 סוג 4 תאים. יתרה מכך, טכניקה wholemount מבטיח להיות שימושי במחקרים עתידיים בחינת ארגון פסיפס תיאר לאחרונה בתאי גזע עצביים במוח הבוגר 9. מספר מחקרים הראו כי תאי גזע עצביים במוח הבוגר אינם אוכלוסיה הומוגנית, אבל שצוינו האזורית בדרך כלל מייצרים רק תת ספציפיים של interneurons הנורה חוש הריח. מחקרים אלו הציע subpopulations שונים בתאי גזע עצביים ניתן להבחין באמצעות הביטוי של גורמי שעתוק ספציפיים 10,11,12,13,14 ו / או על ידי לוקליזציה האזורי שלהם לאורך ובמידות הגבי ו-הגחון הקדמי, האחורי של לרוחב הקיר 9,15,16. כמו סמנים מולקולריים יותר subpopulations שצוין אזורית של מבוגר בתאי גזע עצביים מזוהים, הדמיה wholemount אמור לספק תמונה מקיפה של parcelation של אלה תחומים שונים ובתאים לאורך קיר החדר.

דיסקציה wholemount טכניקות הדמיה המוצג כאן עשוי לשמש גם כדי לנתח את קירות החדר בעובר. דיסקציה של הקיר לרוחב העוברי מתבצעת, שלב אחר שלב, באותו אופן. יש רק הבדלים קלים ברמת קושי; החדרים עובריים הם יחסית גדולים עושים דיסקציה קלה יותר, אבל היא רקמה רכה עושה מניפולציה קשה יותר. בפרט, חשיפה דומה של החדר לרוחב ניתן להשתמש embryos לנתח את הקיר קליפת המוח של החדר ללמוד neurogenesis קליפת המוח. ראיות אחרונים עולה כי ירושה centrosome אסימטרית שומרת גליה רדיאלי על פני החדר במהלך neurogenesis קליפת המוח 17. En פנים הדמיה של משטחים רדיאלי apical גליה עשויים לספק תובנות איך centrosomes בתוך תאים אלה עוברים בירושה חלוקת סימטרית.

כמו ברוב טכניקות, במיוחד אלה הקשורות מיומנות מדויקת, שליטה דורשת תרגול. יש, עם זאת, כמה אלמנטים ב לנתיחה, כי הם המפתח תוצאות טובות יותר: 1) תאורה התאמת תאורה המדגם כדי ליצור צללים מספק בניגוד יסולא בפז במהלך דיסקציה של רקמה אחרת היא הומוגנית יחסית, 2) באמצעות מלקחיים כמו שתי סיכות החרק מלקחיים בטכניקה זו לא משמשים קמצוץ יחד או להרים רקמות, אך משמשים סיכות תמרון שניתן וסידרה הרף כדי לייצב את הרקמות תוך חיתוך, 3) איזון עדין של נסיגת חיתוך הסכין לא צריך לשמש רק לחתוך אלא גם כדי לספק נסיגת עדינה להפריד בין קירות המדיאלי ו לרוחב, נזכר כי הרוב המכריע של דיסקציה זה מתבצע בפועל רק עם חיתוך לסירוגין בין נסיגת עדין.

Acknowledgments

העבודה נתמכת על ידי NIH מענק HD-32116, משפחת סנדלר תמיכה Foundation, קרן ג'ון בואוז לתאי גזע, MEXT, MHLW ו HFSP. ZM נתמך על ידי קרן Baldoceda קרלוס קליפורניה בסן פרנסיסקו Krevans המלגה. AA-B. מחזיק התר מלאני מהומה יו"ר נתרמו.

References

  1. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).
  2. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  3. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  4. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  5. Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).
  6. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).
  7. Sawamoto, K. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311, 629-632 (2006).
  8. Coskun, V. CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).
  9. Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. Science. 317, 381-384 (2007).
  10. Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb. J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).
  11. Waclaw, R. R. The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons. Neuron. 49, 503-516 (2006).
  12. Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).
  13. Kohwi, M. A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors. J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).
  14. Hack, M. A. Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis. Nat Neurosci. (2005).
  15. Ventura, R. E., Goldman, J. E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).
  16. Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns. PLoS Biol. 5, e300 (2007).
  17. Wang, X. Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors. Nature. 461, 947-955 (2009).
אזור Subventricular En פנים: מכתים Wholemount ושפל Ependymal
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter