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Neuroscience

La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

Le pareti del ventricolo laterale contiene la più grande regione germinale nel cervello adulto dei mammiferi. Tradizionalmente, gli studi sulla neurogenesi in questa regione hanno fatto affidamento su tecniche classiche di sezionamento per l'analisi istologica. Qui vi presentiamo un approccio alternativo, la tecnica wholemount, che fornisce un approccio globale, en-faccia vista di questa regione germinale.

Abstract

Le pareti dei ventricoli laterali contengono la più grande regione germinale nel cervello adulto dei mammiferi. La zona subventricolare (SVZ) di queste mura è un modello di sistema ampiamente studiati per capire il comportamento delle cellule staminali neurali e la regolazione della neurogenesi adulta. Tradizionalmente, questi studi si sono basati su tecniche classiche di sezionamento per l'analisi istologica. Qui vi presentiamo un approccio alternativo, la tecnica wholemount, che fornisce un approccio globale, en-faccia vista di questa regione germinale. Rispetto alle sezioni, wholemounts preservare la citoarchitettura cellulare completo e le relazioni all'interno della SVZ. Questo approccio ha recentemente rivelato che le cellule nervose adulte o cellule di tipo B1, fanno parte di un neuroepitelio mescolato con differenziate cellule ependimali rivestimento dei ventricoli laterali. Inoltre, questo approccio è stato utilizzato per studiare la polarizzazione planare delle cellule ependimali e il flusso del fluido cerebrospinale che esse generano nel ventricolo. Con i recenti evidenze che cellule staminali neurali adulte sono una popolazione eterogenea che è regionale specifica, l'approccio wholemount probabilmente sarà uno strumento essenziale per comprendere l'organizzazione e la parcellizzazione di questa nicchia delle cellule staminali.

Protocol

I. Preparazione dei Micropipette di vetro riempito di microsfere fluorescenti per analisi di flusso ependimale (questi passaggi possono essere saltati se la preparazione wholemounts per scopi colorazione solo).

  1. Assicurare un Wiretrol 5 tubo di vetro capillare ul su vetro micropipetta estrattore e regolare le impostazioni di riscaldamento e solenoide a tirare pipetta con una superficie liscia, conica poco profonda.
  2. Allegare una fonte di pressione positiva sulla fine della micropipetta tirato e abbassare delicatamente la punta della pipetta su una superficie metallica grata ad un angolo di 45 ° per creare una punta smussata. Pressione d'aria positiva aiuta a liberare i detriti di vetro dalla parte interna della pipetta. Pulire la fine della punta smussata con un tessuto inumidito etanolo.
  3. Esaminare la punta della pipetta al microscopio con un micrometro. La punta dovrebbe avere uno smusso liscio con un diametro interno di apertura ~ 100 um. Diametri più piccoli possono essere usati, ma spesso provocano intasamento della pipetta con perline fluorescenti.
  4. Backfill pipetta con olio minerale fino a mezzo pieno, quindi inserire grasso stantuffo immerso nella schiena di pipetta. Menisco anticipo di olio minerale per la punta della pipetta manualmente spingendo lo stantuffo.
  5. Fissare la micropipetta e stantuffo su un micromanipolatore, quindi avvitare il supporto pipetta micromanipolatore su un piccolo braccio fisso con altezza regolabile.
  6. Anticipare la pipetta con la soluzione microbead fluorescente, composto da 50% di soluzione fluorescente magazzino microbead, il 45% di acqua, e il 5% glicerolo. Glicerolo viene aggiunto per aumentare la densità della soluzione in modo che quando depositate sul wholemount le microsfere affondare sulla superficie.
  7. Posizionare il micromanipolatore in un luogo sicuro in cui l'ago non sarà accidentalmente rotto e procedere con la dissezione wholemount.

II. Dissezione Wholemount e Fixation

  1. Per preparare per la dissezione wholemount, quantità sufficiente di caldo L-15 Leibovitz media a 37 ° C. Avrete bisogno di circa 10 ml per animale si prevede di sezionare. Anche raccogliere tutte le forniture sarà necessario per la dissezione e la fissazione da parte dello stereomicroscopio: forbici, pinze a denti grandi, lisce una pinza sottile, Sharpoint 22,5 ° coltello pugnalata microchirurgia, piatto dissezione, un tovagliolo di carta, sacchetto, e un piatto ben 24 su ghiaccio pieno di paraformaldeide 4%, con o senza lo 0,1% Triton X-100. Triton X-100 è utilizzato per diminuire la tensione superficiale della soluzione PFA, che diminuisce l'incidenza del taglio della superficie wholemount quando immergere in questa soluzione.
  2. Versare 5-10 ml dei media in un piatto scaldato dissezione posto sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. I piatti sono preparati da dissezione versando un elastico polimero, chiamato Sylgard 184, in un piatto di plastica 6 cm e lasciando la cura soluzione polimerica per 1 settimana sotto vuoto, poi accuratamente risciacquo piatti in grandi volumi di acqua prima dell'uso. Di solito, abbiamo lasciato i piatti in ammollo in acqua in un bicchiere da 1 L per 1 settimana.
  3. L'animale è sacrificato per dislocazione cervicale e la testa è tagliata.
    Nota: Se lo si desidera, il sangue può essere eliminato dal sistema vascolare mediante perfusione l'animale con soluzione fisiologica prima di sezionare il cervello. Ciò è particolarmente importante se si esegue immunostaining cromogenico con diaminobenzidina (DAB).
  4. Si pratica un'incisione mediana è fatto, anteriore al posteriore, lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
  5. Una serie di 4 tagli nel cranio sono fatti per aprire il cranio: un taglio si estende su due orbite anteriore al bulbi olfattivi, i prossimi due tagli sono inferiori al cervelletto e separare il cranio dalla base del cranio, e il taglio finale corre posteriore alla anteriore, lungo la sutura sagittale.
  6. I lembi del cranio sono leggermente retratto e il cervello viene estratto e messo nel piatto la dissezione.
  7. Il resto della dissezione viene eseguita con lo stereomicroscopio. In primo luogo, i bulbi olfattivi sono sezionati lontano dal cervello. Se si desidera inoltre esaminare i bulbi olfattivi, semplicemente fissare per immersione nel 4% PFA durante la notte e si possono in seguito a prepararsi per il sezionamento e la colorazione.
  8. Dividere il cervello lungo la fessura interemisferica.
  9. Un coronale orientata taglio viene effettuato al posteriore, più aspetto della fessura interemisferica, permettendo l'ippocampo caudale da visualizzare nella sezione trasversale.
  10. L'ippocampo, che costituisce la parete mediale del ventricolo laterale in questa posizione, deve poi essere rilasciato dalla corteccia sovrastante, che costituisce la parete dorso-laterale del ventricolo. In primo luogo, il coltello è inserito nello spazio ventricolare piccolo tra la corteccia e l'ippocampo dorsale, e un taglio avviene nella corteccia dove si riflette sul ventre, lontano dalla linea mediana, per unirsi l'ippocampo. Dopo questo taglio è fatto, la corteccia può essere lentamente staccato dal ippocampo per rivelare il ventricolo laterale passando da dorsale a ventrale. Questa manovra èaccelerato, tagliando un cuneo di corteccia in un angolo in cui è stato rilasciato l'ippocampo. Dopo aver raggiunto il ventrale più a misura del ventricolo laterale in questa posizione, si può sia visualizzare o sentire dove la corteccia avvolge di nuovo in giro, questa volta riflettendo medialmente, per unirsi l'ippocampo. Un altro taglio deve essere fatto in questa posizione per liberare completamente l'ippocampo o parete mediale del ventricolo laterale dalla corteccia o parete laterale del ventricolo laterale.
  11. Sarà quindi facile tirare l'ippocampo lontano dalla corteccia, medialmente e anteriormente, per aprire il ventricolo laterale ampiamente.
  12. Continuare a tirare delicatamente l'ippocampo anteriormente con piccoli colpi della pinza e coltello per ritrattare le pareti mediale e laterale a parte.
  13. Una volta che la resistenza a questa ritrattazione comincia ad aumentare, i tagli sono necessari ulteriori. In primo luogo, per aumentare l'esposizione al ventricolo laterale e, in particolare, il muro laterale e SVZ, sezionare via la corteccia. La corteccia è pulito sezionato via visualizzando l'interfaccia tra il corpo calloso e il VZ / SVZ. Basta tagliare lungo questa interfaccia stare dalla parte callosa per evitare di danneggiare la SVZ.
  14. Per continuare a scomparsa della parete mediale dalla parete laterale, due tagli più sono necessari: un taglio dorsalmente dove la parete laterale, parete mediale, e la corteccia convergono tutte, e un taglio sul ventre dove la parete laterale, parete mediale, e talamo convergono. Con questi tagli, più delicata retrazione della parete mediale permette l'anteriore più a misura del ventricolo laterale da aprire.
  15. Una corretta illuminazione è essenziale tutta la procedura ed in particolare nella fase successiva in cui sono separate le pareti mediale e laterale anteriormente. In questa posizione anteriore nel ventricolo laterale, la parete mediale riflette e si continua con la parete laterale. Regolare l'illuminazione in modo tale che ombre tra le due pareti rivelare questo punto di riflessione, che appare come una valle tra le due pareti. Tagliato esattamente in questa valle di separare questi due muri.
  16. Infine, completamente esporre la parete laterale, eliminando qualsiasi sbalzo corteccia dorsale e ventrale del talamo.
  17. Se la preparazione wholemounts per immunostaining, trasferire accuratamente l'wholemount, lato alto del ventricolo, dal piatto dissezione in un 24-pozzetti riempiti con 4% PFA con o senza lo 0,1% Triton-X100 per una fissazione notte a 4 ° C. Per il fissaggio sensibili antigeni, wholemounts possono essere fissati per periodi più brevi di tempo. Poi passare alla sezione 4 sul wholemounts immunocolorazione.
  18. Se la preparazione wholemounts per l'analisi del flusso ependimali, trasferire il wholemount dissezione di un piatto pulito pieno di fresco, 37 ° C di media Leibovitz e procedere alla sezione successiva.

III. Analisi dei flussi di ependimali con microsfere fluorescenti

  1. Immobilizzare la wholemount su un piatto pulito dissezione con 2 perni di insetti, uno nel talamo e una in antero-dorsale angolo del wholemount.
  2. Posizionare la base del braccio fermo tenendo il micromanipolatore accanto al stereomicroscopio. Verificare che l'altezza del braccio regolabile è elevato al massimo per evitare di rompere l'ago contro il piatto dissezione.
  3. Con attenzione intingere nell'acqua la punta dell'ago in media in un tubo ependorf per pulire microsfere che sono presenti sulla punta esterna dell'ago. Se questi non vengono puliti via, possono essere successivamente depositati sulla superficie wholemout inavvertitamente durante il posizionamento dell'ago e ridurre la qualità complessiva del film.
  4. Posizionare la punta dell'ago sulla superficie dorsale della parete laterale e abbassare il braccio per portare la punta dell'ago nel mezzo. L'ago deve essere abbassato fino a quando non è appena sopra la superficie della parete laterale.
  5. Con l'ago in posizione regolare lo zoom e mettere a fuoco lo stereomicroscopio per coprire un campo desiderato. Se si farà una registrazione del flusso ependimali, iniziare l'acquisizione di immagini in questo momento.
  6. Espellere ~ 5 nl della soluzione microbead sulla superficie del wholemount. Una volta che il bolo iniziale di perline è stata cancellata la superficie di flusso ependimali, turni supplementari di eiezione del cordone possono essere eseguite.

IV. Wholemounts immunocolorazione

  1. Wholemounts sezionato per immunocolorazione immersione sono fissate in una notte in 4% PFA con o senza lo 0,1% Triton-X100 a 4 ° C. L'uso di Triton-X100 è preferita per gli antigeni che tollerano questo trattamento, ma può essere lasciato fuori nei casi in cui è diminuita la qualità colorazione di detergente.
  2. La mattina seguente, PFA viene aspirato dal 24-pozzetti e le wholemounts vengono lavati 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS 0,1 M con o senza lo 0,1% Triton-X100. Come in precedenza, l'uso di Triton-X100 è preferibile, ma non obbligatorio, per tutti i lavaggi in questo protocollo. In tutto questo protocollo, lo scambio di soluzioni su tutto il territoriomontaggio richiede accurata aspirazione della soluzione dal lato del bene. Poi, il pozzo è riempito con una soluzione con una pipetta di trasferimento ad angolo tale che questa soluzione lava il lato del bene e non direttamente sul wholemount. Fare attenzione a tenere il ventricolo laterale del wholemount rivolto verso l'alto in ogni momento. Pipettaggio vigoroso di soluzioni spesso capovolgere la wholemount. Noi preferiamo le soluzioni per lo scambio di oltre 1 wholemount alla volta per evitare che il tessuto si secchino.
  3. Dopo aver lavato via il PFA, wholemounts vengono incubate per 1 ora a temperatura ambiente in soluzione di blocco, contenente il 10% di siero normale di capra o asino in 0.1 M PBS con o senza Triton-X100. Se si utilizza Triton-X100 per la colorazione, si può scegliere di utilizzare sia il 2% o 0,5% Triton-X100 nella soluzione di blocco. Usiamo 2% Triton-X100 quando colorazione per gli antigeni che richiedano il passaggio di anticorpi più in profondità nel tessuto, come quelli antigeni trova nella SVZ. Tuttavia, quando colorazione per gli antigeni trova più vicino alla superficie della parete laterale, come antigeni trovato nella superficie apicale delle cellule ependimali, usiamo 0,5% Triton-X100. Inoltre, Triton-X100 può essere lasciato fuori per superficie cellulare o altri antigeni che vengono rimosse o alterate da detersivi.
  4. Quindi, rimuovere la soluzione di saturazione e aggiungere anticorpi primari diluiti nella stessa soluzione di bloccaggio e incubare per 24 o 48 ore a 4 ° C. Scelta del periodo di incubazione dipende l'antigene, simile a scelta dello 0,5% o 2% Triton. Per gli antigeni trova sulla superficie del wholemount, basta incubazione di 24 ore. Tuttavia, per gli antigeni situati più in profondità, come nel SVZ, periodi di incubazione 48 ore fornire risultati migliori.
    Ad esempio, per studiare la superficie apicale e corpi basali delle cellule che rivestono la parete laterale del ventricolo, macchia con anticorpi di β-catenina, per etichettare la membrana cellulare, e γ-tubulina, per etichettare corpi basali. Diluire topo anti-β-catenina anticorpi (1:500) e di coniglio anti-γ-tubulina anticorpi (1:1000) a 0,1 M PBS contenente 10% di siero normale di capra e 0,5% Triton-X100. Incubare a 4 ° C per 24 ore.
    Per colorare le cellule nervose adulte o cellule di tipo B1, macchia la parete laterale con l'anticorpo GFAP. Diluire topo anti-GFAP anticorpi (1:500) in 0,1 M PBS contenente 10% di siero normale di capra e il 2% Triton-X100. Incubare a 4 ° C per 48 ore.
  5. Anticorpi primari sono lavati via inizialmente da 2 risciacqui veloci in PBS con o senza lo 0,1% Triton-X100. Poi fare 3 lavaggi aggiuntivi per 20 minuti a temperatura ambiente.
  6. Diluire anticorpi secondari nella stessa soluzione utilizzata per bloccare gli anticorpi primari e aggiungere al wholemounts ad incubare per la stessa durata, come per gli anticorpi primari a 4 ° C.
    Ad esempio, per colorazione per la β-catenina e γ-tubulina: diluire Alexa Fluor 488 di capra anti-topo (1:400, riconosce topo anti-β-catenina) e Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio anticorpi (1:400, riconosce di coniglio anti-γ-tubulina) a 0,1 M PBS contenente 10% di siero normale di capra e 0,5% Triton-X100. Incubare a 4 ° C per 24 ore.
    Per immunocolorazione GFAP: diluire Alexa Fluor 488 di capra anti-topo (1:400, riconosce topo anti-GFAP) in 0.1 M PBS contenente 10% di siero normale di capra e il 2% Triton-X100. Incubare a 4 ° C per 48 ore.
  7. Anticorpi secondari sono lavati via la wholemount utilizzando la lava stessa eseguita per anticorpi primari.
  8. Se lo si desidera, nucleare contro-colorazione può essere eseguita, a questo punto incubando in DAPI diluito in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare una volta in PBS.

V. montaggio Wholemounts immunostained su vetrini per microscopia confocale

  1. Per imaging ad alta risoluzione confocale, seguendo immunostaining wholemounts il bisogno di essere sotto-sezionato per conservare solo la parete laterale del ventricolo laterale come un frammento di tessuto 200-300 um di spessore. Che separa la parete laterale dallo striato sottostante permette di essere montato su un vetrino e coperta con un coprioggetto in modo piatto.
  2. Ritorno alla stereomicroscopio con wholemounts immunostained e seguenti strumenti e attrezzature: liscia una pinza sottile, Sharpoint 22,5 ° coltello pugnalata microchirurgia, piatto dissezione, vetrini da microscopio e coprioggetto, 0,1 M PBS, e Aquamount mezzo di montaggio.
  3. Trasferire il wholemount dal 24-pozzetti per il piatto dissezione contenente 0,1 M PBS facendo attenzione a tenere il ventricolo laterale alto.
  4. In primo luogo, rimuovere completamente la corteccia dorsale del wholemount da anteriore a posteriore, tagliando proprio lungo la linea dove il corpo calloso incontra il muro laterale. Questo è riconosciuto come l'interfaccia tra la materia callosa bianco e il rosa che appare SVZ.
  5. Poi fare un taglio orizzontale lungo orientati attraverso l'aspetto ventrale del wholemount. Questa superficie di taglio fornirà una piattaforma su cui si può stabilize il wholemount durante il prossimo passo nella dissezione.
  6. Con la superficie dorsale del wholemount rivolto verso l'alto, sarete in grado di visualizzare lo spessore della SVZ da anteriore a posteriore lungo la parete laterale. Si noti che questa visione è stata resa possibile dalla rimozione iniziale della corteccia che permette lo striato sottostante e SVZ di essere visto. La SVZ viene identificato come la sottile striscia di tessuto che si estende dalla superficie ventricolare al corpo striato. La SVZ ha un aspetto omogeneo rosa, mentre il corpo striato è infiltrata da cordoni di sostanza bianca. Si noti che la SVZ è più spessa anteriormente e posteriormente diventa progressivamente più sottile.
  7. Dopo aver individuato l'interfaccia del SVZ e striato, con attenzione iniziare il taglio a questa interfaccia al-la maggior parte anteriore aspetto della parete laterale, avanzando il coltello dalla dorsale a ventrale. Per fare questo con precisione, stabilizzare il wholemount con il forcipe utilizzato come due pin. È anche possibile utilizzare il forcipe per accendere un po 'il wholemount per visualizzare la lama avanza da dorsale a ventrale attraverso la parete laterale. La chiave di questa dissezione è per il frammento di tessuto risulta essere molto piatto. Questo significa che mentre si tagliano le SVZ da anteriore a posteriore attraverso la parete laterale, l'orientamento dei tagli fai deve rimanere parallelo alla superficie ventricolare in ogni momento.
  8. Ricorda che più posteriormente, la SVZ diventa più sottile. Invece di diradamento tuo dissezione di tagliare solo la SVZ a questo punto, è importante che, come si avanza posteriormente, lo spessore del tessuto che viene sezionato rimane la stessa. Questo farà sì che il frammento di tessuto che sarà successivamente il montaggio è piatto.
  9. Dopo separando completamente la parete laterale dallo striato sottostante, rimuovere con cura tutti gli altri tessuti circostanti da questo frammento che non fanno parte della parete ventricolare.
  10. Quindi prendere questa scheggia dal basso utilizzando la tua pinza e posizionarlo al centro di un vetrino da microscopio. Applicare alcune gocce di aquamount direttamente sul wholemount e delicatamente posto un coprioggetto centrata su questo, cercando di non introdurre bolle sulla superficie del tessuto. Il peso della diapositiva farà sì che il aquamount disperde in modo uniforme e produce un appiattimento raffinata superficie della parete laterale. La quantità di aquamount utilizzati e la dimensione del vetrino dipende dall'età del tessuto viene sezionato. Per i tessuti embrionali e postnatale precoce, preferiamo 1 goccia di aquamount e 22 "x 30" coprioggetto. Più pesanti coprioggetto può distorcere il tessuto e più aquamount interferiscono con la qualità delle immagini, perché il laser confocale sarà meno in grado di penetrare uno strato sottile di residenti aquamount tra il coprioggetti e la superficie del tessuto. Per i tessuti più tardi postnatale e adulta, usiamo 4 gocce di aquamount e 24 "x 60" coprioggetto.
  11. I vetrini vengono poi riposti in un libro scivolo a 4 ° C per 1-2 giorni prima di imaging per consentire di risolvere i coprioggetti.

Rappresentante Risultati

Approcci Wholemount hanno fornito alcuni strumenti strategici per affrontare l'attività germinale dell'adulto SVZ. La rete di catene di migrazione dei neuroni giovani nel SVZ è stata osservata la prima volta dopo wholemounts della parete laterale del ventricolo laterale erano immunoistochimica con anticorpi per polysialylated molecola di adesione delle cellule neurali (PSA-NCAM) 1. Queste catene di neuroblasti migrazione può essere visto anche dopo immunostaining wholemounts con anticorpi doublecortin (Figura 1). Sorprendentemente, la rete di catene ha un modello stereotipato, con due flussi generale delle cellule, una corsa dorsalmente più e uno in esecuzione ventralmente intorno al punto di aderenza. Wholemounts della SVZ forniscono anche una visione completa delle attività proliferativa dei progenitori in questa regione, come si è visto con colorazione Ki67 in Figura 2. È interessante notare che due studi recenti suggeriscono una stretta interazione tra le cellule che divide SVZ e la vascolarizzazione locale 2,3 (Figura 2).

Quando esaminato al microscopio confocale ad alta potenza, la en-faccia visualizzazione fornita da wholemounts permette una prospettiva unica della superficie apicale delle cellule che rivestono il sistema ventricolare. Questo en-faccia prospettiva ha recentemente rivelato che le cellule SVZ tipo B1, le cellule staminali adulte neurali, fanno parte di un neuroepitelio mescolato con divisione delle cellule non differenziate ependimali 4. La superficie apicale di contatti tipo B1 cellule del ventricolo laterale ed è circondata da ampie superfici apicale delle cellule ependimali in una girandola di configurazione (Figura 3, le frecce indicano superfici B1 apicale). Inoltre, un attento esame della superficie apicale delle cellule ependimali ha rivelato che la posizione e l'orientamento traslazionale di rotazione del proprio corpo basale sono indicatori della loro polarità planare 5. Ependimali cellule basali bostampi sono raggruppati in una patch sulla superficie apicale. Questa patch è spostato dal centro della superficie apicale "nella direzione a valle rispetto al flusso liquorale (polarità traslazionale), all'interno di questa patch, ogni corpo basale è ruotato sul suo asse longitudinale in modo tale che il piede basale, un accessorio della basale corpo, nella direzione del flusso (polarità di rotazione). affini cellule ependimali hanno i loro corpi basali orientate nella stessa direzione. importante, videomicrographs del test flusso ependimali può essere usato per confrontare direttamente il flusso in una regione specifica della parete laterale l'orientamento dei corpi delle cellule ependimali basali in quella regione (Figura 4).

Oltre a fornire una prospettiva panoramica della più grande regione germinale nel cervello adulto, con immagini di potenza superiore, wholemounts permettono un'analisi più completa e dettagliata dei singoli morfologie cellulari nel SVZ. L'imaging confocale ad alta potenza di immunocolorazione GFAP su wholemounts ha rivelato che le cellule di tipo B1, in aggiunta alla loro breve ventricolo a contatto processo apicale, hanno un lungo processo basale a contatto con i vasi sanguigni (Figura 5) 4. Questo citoarchitettura non era stato apprezzato in precedenza in sezioni coronali, perché il processo basale è prevalentemente parallelo alla parete ventricolare. Sezionamento seriale taglia quindi le singole cellule in piccoli frammenti, rendendo quasi impossibile ricostruire la morfologia completare una cella di s, o per capire la sua relazione con altri tipi di cellule nel SVZ. L'approccio wholemount ha diversi vantaggi rispetto classiche tecniche di sezionamento, sia nel fornire una vista panoramica con il microscopio a basso consumo e una prospettiva completa delle singole cellule con la microscopia ad alta potenza. Questa tecnica continuerà ad essere un importante complemento per studi futuri di questa zona del cervello adulto germinale.

Figura 1
Figura 1. Rete di catene migratorie neuronale nel SVZ. Piastrelle immagini confocale wholemount ricostruire un muro laterale che era macchiata di anticorpi per doublecortin, quali etichette neuroblasti migrano in tutto il SVZ. Ci sono due correnti generali della migrazione, una corsa dorsalmente più e uno in esecuzione ventralmente intorno al punto di adesione, indicato da un asterisco (*). Le frecce indicano anteriore (a) e dorsale (d) le direzioni. Barra di scala = 1 mm.

Figura 2
Figura 2. Relazione tra il sistema vascolare e cellule in divisione nella SVZ. Questo wholemount laterale muro era immunoistochimica con anticorpi per Ki67, per etichettare le cellule in divisione in verde, e gli anticorpi contro le immunoglobuline del mouse, di etichettare la vascolarizzazione in rosso. Poiché questo non è stato wholemount perfusi con soluzione salina prima della colorazione, il topo molecole endogene IgG rimangono all'interno dei vasi sanguigni e sono macchiati da secondario anti-topo anticorpi. Un recente lavoro suggerisce che divide precursori SVZ (verde) si trovano in prossimità di vasi sanguigni (rosso) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie 2008 # 6522}. Le frecce indicano anteriore (a) e dorsale (d) le direzioni. Barra di scala = 1 mm.

Figura 3
Figura 3. La superficie apicale del ventricolo a contatto le cellule sulla parete laterale. Immagine ad alta potenza confocale di un wholemount immunostained per β-catenina, per etichettare le membrane cellulari in verde, e γ-tubulina, per etichettare corpi basali in rosso, rivela come l'organizzazione planare di queste cellule epiteliali. Celle di tipo B1, le cellule nervose adulte, hanno una piccola superficie apicale con un unico organismo basale, indicato da frecce. La superficie apicale di queste cellule è circondato dal grande superficie apicale delle cellule ependimali in una configurazione girandola. Cellule ependimali hanno polarità planare indicato dalla posizione dei loro corpi più basale sulla superficie apicale. Vicini cellule ependimali hanno i loro grappoli corpo basale situata sullo stesso lato della superficie apicale (verso il basso e verso sinistra in questa regione), corrispondente alla direzione del flusso CSF ​​{Mirzadeh 2010 # 6573}. Barra di scala = 10 micron.

Figura 4
Figura 4. L'analisi del flusso ependimali. Immagine composita creata dalla fusione di 100 fotogrammi in sequenza da un film scattate durante il test del flusso ependimali. Microsfere fluorescenti depositati dorsali e posteriori alla zona di adesione sono stati spinti da ciglia ependimali in due flussi orientati, uno sopra e uno sotto l'adesione, verso il forame di Monro. Questo flusso orientato rivela la polarità planare funzionale delle cellule ependimali. Ogni linea di flusso rappresenta la posizione di una sola perla in punti consecutivi nel tempo. Barra di scala = 0,5 mm.


Figura 5. GFAP + celle B1 tipo hanno una fibra lunga basale con finale piedi sui vasi sanguigni. Sporgenza massima di una pila alta potenza confocale preso da un wholemount parete laterale immunoistochimica con anticorpi per etichettare astrociti GFAP SVZ. Questa colorazione etichette cellule staminali neurali adulte o cellule di tipo B1, che hanno un finale apicale sulla superficie ventricolare e, come mostrato qui, un lungo GFAP + fibra basale che termina sui vasi sanguigni (frecce). I vasi sanguigni sono macchiati qui perché l'anticorpo secondario utilizzato per visualizzare topo anti-GFAP anticorpi riconoscono endogene IgG di topo all'interno del sistema vascolare. Barra di scala = 50 micron.

Discussion

La maggior parte degli studi di neurogenesi in zone ventricolare e subventricolare hanno fatto affidamento su tecniche classiche di sezionamento per esaminare la microanatomia e le relazioni cellulare in queste regioni. Qui si descrive una tecnica alternativa, prima utilizzato per analizzare la rete di catene migratorie dei neuroblasti generati nella SVZ 1, poi utilizzati per studiare la rigenerazione della popolazione progenitore SVZ seguenti anti-mitotico trattamento di 6, e più recentemente utilizzato per studiare il apicale preciso basali e interazioni cellula-cellula di cellule staminali neurali SVZ 2,3,4. È interessante notare che questa tecnica ha rivelato che le cellule staminali neurali, o cellule di tipo B1, dell'adulto SVZ sono parte di un neuroepitelio mescolato con differenziate non si dividono le cellule ependimali. En-faccia con l'imaging wholemounts ha dimostrato che questa architettura ha misto neuroepitelio girandola consistente delle terminazioni apicale delle cellule di tipo B1 circondata da ampie superfici apicale delle cellule ependimali 4. Questo en-faccia analisi ha chiarito la nostra comprensione della stirpe di cellule staminali neurali nel cervello embrionali e adulte come composto di cellule con terminazioni apicali in superficie ventricolo e dei processi basali contattando una nicchia vascolare. Questi risultati sarebbe stato quasi impossibile con le tecniche classiche di sezionamento. Wholemounts anche facilitare l'identificazione delle cellule staminali neurali tramite il loro ventricolo-contattando processo apicale. Come marcatori più specifici per queste cellule staminali si trovano, wholemounts sarà parte integrante di identificare e analizzare il comportamento delle cellule staminali neurali.

Wholemounts delle pareti ventricolo laterale forniscono anche la prospettiva ideale per studiare la polarità planare delle cellule ependimali. Cellule ependimali sono cellule multiciliated rivestimento dei ventricoli che la funzione di spingere CSF in modo coordinato. Con la tecnica wholemount, l'epitelio intero ependimali è esposto en-face e può essere colorato e studiato ampiamente dalla sua anteriore confini ventrale e dorsale posteriore al. Inoltre, le analisi di flusso ependimali eseguita su acutamente sezionato, wholemounts vivere robustamente dimostrare il flusso planare polarizzata generata da ciglia ependimali. Un recente lavoro utilizzando approcci wholemount ha scoperto determinanti cellulari di questa polarità planare ependimali 5. È interessante notare che gli studi wholemount hanno anche suggerito che ependimali-ha generato un flusso CSF stabilisce gradienti di chemorepellents che guidano la migrazione dei neuroni giovani nel SVZ 7. Approcci Wholemount che inizialmente individuato la rete di catene migratorie neuronali sono quindi continuando a fornire conoscenze sui meccanismi che regolano la migrazione a catena.

Analisi del VZ e SVZ da wholemount di imaging aggiunge un nuovo approccio per entrambi gli studi futuri e un modo per chiarire la nostra comprensione degli studi già esistenti. Per esempio, un recente studio ha suggerito che le cellule staminali neurali nel SVZ adulti erano CD133 + / CD24-cellule a contatto con il ventricolo 8. Sulla base delle loro immunostaining in sezioni, questi autori hanno affermato che queste cellule erano una sottopopolazione di cellule ependimali multiciliated. Tuttavia, nel nostro studio, utilizzando l'approccio wholemount, che dà una visione più completa dell'epitelio intero ependimali, abbiamo scoperto che tutte le cellule ependimali esprimere CD24 ed il solo ventricolo a contatto le cellule che sono state CD133 + / CD24-sono un sottoinsieme del tipo B1 cellule 4. Inoltre, la tecnica wholemount promette di essere utili in studi futuri esaminando l'organizzazione mosaico recentemente descritta delle cellule staminali neurali nel cervello adulto 9. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali neurali nel cervello adulto non sono una popolazione omogenea, ma sono specificati regionale e normalmente producono solo specifici sottotipi di interneuroni bulbo olfattivo. Questi studi hanno proposto che diverse sottopopolazioni di cellule staminali neurali possono essere distinti sia per l'espressione di specifici fattori di trascrizione 10,11,12,13,14 e / o dalla loro localizzazione regionale lungo le estensioni dorso-ventrale e antero-posteriore del parete laterale 9,15,16. Come più marcatori molecolari di sottopopolazioni regionale specificato di cellule staminali neurali adulte sono identificate, l'imaging wholemount dovrebbe fornire una visione completa della parcelation di questi domini progenitore diversi lungo la parete ventricolare.

La dissezione wholemount e tecniche di immagini presentate qui possono anche essere utilizzati per analizzare le pareti ventricolari nell'embrione. La dissezione della parete laterale embrionale viene eseguita, passo dopo passo, nella stessa maniera. Ci sono solo piccole differenze nel livello di difficoltà, i ventricoli embrionali sono relativamente più grandi rendendo più facile la dissezione, ma il tessuto è più morbido rende più difficile la manipolazione. In particolare, una simile esposizione del ventricolo laterale può essere utilizzato in Embryos a sezionare la parete corticale del ventricolo per studiare neurogenesi corticale. Prove recenti suggeriscono che l'eredità asimmetrica centrosoma mantiene glia radiale sulla superficie ventricolare durante la neurogenesi corticale 17. En-faccia immagini di superfici radiali gliali apicale possa fornire indicazioni su come centrosomi all'interno di queste cellule che si dividono asimmetricamente sono ereditate.

Come la maggior parte delle tecniche, specialmente quelle che implicano l'abilità precise, padronanza richiede pratica. Ci sono, tuttavia, alcuni elementi della dissezione che sono fondamentali per ottenere risultati migliori: 1) l'illuminazione regolare l'illuminazione del campione per creare ombre fornisce contrasto prezioso durante la dissezione dei tessuti che altrimenti relativamente omogenea, 2) usando le pinze, come due perni insetti la pinza in questa tecnica non sono mai usati per pizzicare insieme o prendere tessuti, ma sono utilizzati come perni maneggevole che può essere continuamente riadattato per stabilizzare il tessuto durante il taglio, 3) un equilibrio di dolce ritrattazione e il taglio del coltello non deve essere usato solo per tagliare ma anche per fornire retrazione dolce per separare le pareti mediale e laterale, ricordando che la maggior parte di questa dissezione viene effettivamente eseguita attraverso rientro dolce solo con il taglio intermittente.

Acknowledgments

Lavoro sostenuto da NIH concedere HD-32116, la Famiglia Sandler Sostenere Foundation, The John Bowes Fondo di cellule staminali, MEXT, MHLW, e HFSP. ZM sostenuto dalla Fondazione Baldoceda Carlos e UCSF Krevans Fellowship. AA-B. detiene il Heather e Melanie Muss presidente Dotata.

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La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale
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Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

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