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Neuroscience

脳室下帯恩顔:Wholemount染色と上衣の流れ

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

側脳室の壁は、成体哺乳動物の脳の最大の胚の領域が含まれています。伝統的に、この地域における神経新生の研究は、組織学的分析のための古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、この胚地域の包括的な、EN -顔のビューを提供する代替的なアプローチ、wholemountテクニックを、提示する。

Abstract

側脳室の壁は、成体哺乳動物の脳の最大の胚の領域が含まれています。これらの壁の脳室下帯(SVZ)の神経幹細胞と成体のニューロン新生の制御の挙動を理解するための広範囲に研究のモデルシステムです。伝統的に、これらの研究は、組織学的分析のための古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、この胚地域の包括的な、EN -顔のビューを提供する代替的なアプローチ、wholemountテクニックを、提示する。セクションに比べて、wholemountsは完全な細胞構築とSVZ内の細胞の関係を維持する。このアプローチは、最近、大人の神経幹細胞、またはタイプのB1細胞は、側脳室の内側を覆う、分化上衣細胞と混合した神経上皮の一部であることを明らかにした。さらに、このアプローチは、彼らは脳室で生成上衣細胞と脳脊髄液の流れの平面偏光を研究するために使用されています。成体神経幹細胞は、地域的に指定されている不均一な集団であることが最近の証拠で、wholemountアプローチは、おそらくこの幹細胞のニッチの組織とparcellationを理解するために不可欠なツールとなります。

Protocol

上衣フローアッセイ用蛍光マイクロビーズ(のみ染色の目的のためにwholemountsを準備する場合の手順はスキップされることがあります)で満たされたガラスのマイクロピペットのI.の準備。

  1. ガラスマイクロピペットプラーにWiretrol5μlのガラスキャピラリーチューブを固定し、スムーズな、浅いテーパーでピペットをプルするためにヒーターとソレノイドの設定を調整します。
  2. プルマイクロピペットの端に正の空気圧のソースを添付し、45 °の角度で金属格子の表面にピペットの優しく低い先端が斜めの先端を作成する。正圧は、ピペットの内側からガラスの破片をクリアするのに役立ちます。エタノールで湿らせたティッシュで斜めになった先端の端をきれいにします。
  3. マイクロメータによる顕微鏡下でピペットの先端を調べます。ヒントは、〜100ミクロンの内部の開口径を持つ滑らかなベベルを持つ必要があります。小さい直径が使用されますが、多くの場合、蛍光ビーズをピペットの目詰まりが生じることがあります。
  4. 鉱物油とフィルピペットは、ハーフ、フルになるまで、その後ピペットの背面にグリース浸したプランジャーを挿入します。手動でプランジャーで押してピペットの先端に鉱物油のメニスカスを進める。
  5. マイクロマニピュレータの上にマイクロピペットおよびプランジャーを固定し、調整可能な高さを持つ小さな固定アームにマイクロマニピュレーターピペットホルダーをねじ込みます。
  6. Frontload 50パーセント蛍光マイクロビーズのストック溶液、45%の水、および5%グリセロールから成る蛍光マイクロビーズ溶液でピペット。表面にwholemountマイクロビーズのシンク上に堆積するときになるようにグリセロールを、溶液の密度を高めるために追加されます。
  7. 針を誤って破壊しwholemount解剖を続行されません安全な場所にマイクロマニピュレーターを置きます。

II。 Wholemount解剖と固定

  1. ℃のwholemount解剖の準備を行うには、L - 15リーボビッツのメディアの暖かい十分な量の37〜あなたが解剖する予定の動物あたり約10mlが必要になります。はさみ、歯に大きな鉗子、滑らかな細かい鉗子、Sharpoint 22.5 °顕微刺すナイフ、解剖皿、紙タオル、医療用ごみ袋、とで満たされた氷の上に24ウェルプレート:また、すべてのお客様が実体顕微鏡で解剖し、固定のために必要な物資を集めるトリトンX - 100で0.1%なし4%パラホルムアルデヒド。トリトンX - 100は、この溶液に浸漬したときwholemount表面のせん断の発生率を低下させるPFA溶液の表面張力を減少させるために使用されます。
  2. 蛍光実体顕微鏡下に置かれた解剖皿に温めたメディアの5-10 mlを注ぐ。解剖皿は、十分に使用前に大量の水で皿を洗い、6 cmのプラスチックの皿にSylgard 184と呼ばれる弾性ポリマーを、、注入、真空下で1週間のためのポリマー溶液の治療をさせることによって調製される。通常、我々は、料理は1週間に1 Lのビーカーに水に浸してみましょう。
  3. 動物を頸部脱臼によって屠殺され、頭部は切断されます。
    注:必要に応じて、血液を生理食塩水で動物を灌流する前に脳を解剖することによって血管系から消去されることがあります。ジアミノベンジジン(DAB)で発色免疫染色を行う場合、これは特に重要です。
  4. 正中切開は、頭蓋骨を明らかにするために頭皮に沿って、前方後方、行われます。
  5. 頭蓋骨の4カット頭蓋を開くために行われる一連の:ワンカットは、嗅球の前方に2つの軌道にまたがる、次の二つのカットが小脳に劣っていると頭蓋底から頭蓋を分離し、最終的なカットが実行される半ば矢状縫合に沿って前方へ後方。
  6. 頭蓋フラップを穏やかに引っ込んでいると脳は、解剖皿に抽出して配置されます。
  7. 解剖の残りの部分は、実体顕微鏡下で実行されます。最初に、嗅球は脳から離れて解剖されています。あなたが嗅球を調べるためにさらにご希望の場合、単に一晩4%PFAに浸漬することによって、それらを修正し、その後、切片と染色のためにそれらを準備することができる。
  8. 大脳縦裂に沿って脳を割ります。
  9. coronally指向のカットは、尾側海馬の断面図で可視化できるようにすること、大脳縦裂の後、ほとんどの局面で行われている。
  10. この位置で側脳室の内壁を形成する海馬は、、その後、心室の背側壁を形成する上層の皮質、から解放されている必要があります。最初に、ナイフは背側皮質と海馬の間に小さな心室空間に挿入され、カットは海馬への参加を、離れて正中線から、それは腹側に反映皮質で作られています。このカットが行われた後、皮質はゆっくりと背側から腹側に移動する側脳室を明らかにするために海馬から剥離することができます。この操作は海馬がリリースされたコーナーで皮質のウェッジをカットすることにより迅速。この位置で側脳室の腹側のほとんどの範囲に到達した後、次のいずれかを海馬に参加する、、内側に反射するこの時間を可視化または皮質は再びラップアラウンドどこに感じるかもしれません。別のカットは完全に海馬や大脳皮質や側脳室の側壁から側脳室の内側の壁を解放するためにこの位置で行う必要があります。
  11. その後、広く側脳室を開くには、内側と前方に、離れて皮質から海馬を引っ張るために容易になります。
  12. 軽く前方に離れて内側と外側の壁を撤回する鉗子とナイフの小さなストロークを使用して海馬をプルし続ける。
  13. この撤回に抵抗が増加し始めると、追加のカットが必要です。最初に、側脳室に、特にあなたの露出を高めるために、側壁とSVZは、皮質を離れて分析する。皮質は、きれいに脳梁とVZ / SVZの間のインターフェースを視覚化することによって離れて解剖される。単にSVZの損傷を防ぐために、脳梁の側に滞在し、このインタフェースに沿ってカット。
  14. 離れて横方向の壁から後退内壁を続けるためには、さらに2つのカットが必要とされています:側壁、内壁、及び皮質がすべて収束どこ一つは背側に切り、もう一方は腹側にカットどこ側壁、内壁、および視床収束する。これらのカットが行われたと、内側の壁に、さらに穏やかな収縮は、側脳室の前、ほとんどの範囲を開くことができます。
  15. 適切な照明は、プロシージャ全体、特に内側と外側の壁が前方に分離されている次のステップで必要不可欠です。側脳室のこの前方位置に、内側の壁には戻って反映していると横方向の壁と連続している。二つの壁の間にキャストするように影が二つの壁の間の谷のように見えるこの反射点を、明らかに照明を調整します。これら2つの壁を分離するためにこの谷で正確にカット。
  16. 最後に、完全に腹側背側の任意張り出した皮質と視床を除去することにより横方向の壁を公開。
  17. 免疫染色のためにwholemountsを準備する場合、慎重に4℃で一晩固定のために0.1%のTriton - X100の有無にかかわらず、PFA 4%満たされた24ウェルプレートに解剖皿℃から、wholemount、心室側を上に移す固定敏感な抗原の場合は、wholemountsは短い期間のために固定することができる。その後、免疫染色wholemountsに、セクション4に進んでください。
  18. 上衣フロー分析のためのwholemountsを準備した場合、新鮮な、37 ° Cリーボビッツ媒体で満たされたクリーンな解剖皿にwholemountを転送し、次のセクションに進んでください。

III。蛍光マイクロビーズを使用して上衣フロー分析

  1. 2昆虫ピン、視床内の1つとwholemountの前方、背側隅に1つを使用してクリーンな解剖皿にwholemountを固定化する。
  2. 実体顕微鏡の隣にマニピュレータを保持する固定アームのベースを置きます。調節可能なアームの高さを最大限に解剖皿に対して針を破損しないように昇格されていることを確認します。
  3. 慎重に針の外側の先端上に存在するマイクロビーズをきれいにependorfチューブ内にメディアに針の先端を浸漬。これらは離れてクリーンアップされない場合、それらはその後、針の位置決め中に誤ってwholemoutの表面上に堆積し、映画の全体的な品質が低下する可能性があります。
  4. 側壁の背面上に針の先端を置き、培地中に針の先端を持って腕を下げて。それだけで側壁面より上になるまで針を小さくする必要があります。
  5. 位置の針で、目的のフィールドをカバーするために実体顕微鏡のズームとフォーカスを調整します。あなたが上衣フローの記録を作成する場合は、この時点で画像の取得を開始。
  6. wholemountの表面にマイクロビーズソリューションの〜5 NLを取り出します。ビーズの最初のボーラスが上衣の流れによって表面をオフにクリアされると、ビーズ放出の追加のラウンドを行うことができます。

IV。免疫染色Wholemounts

  1. 免疫染色のために解剖Wholemountsは4℃で、0.1%トリトン- X100のない4%PFAで一晩浸漬固定です。トリトン- X100の使用は、この治療に耐え抗原に適していますが、染色の品質は洗剤によって減少する場合には除外することができます。
  2. 翌朝は、PFAは、0.1%トリトン- X100の有無にかかわらず、0.1MのPBSで各5分間3回洗浄している24ウェルプレートとwholemountsから吸引される。前と同様に、トリトン- X100の使用は、このプロトコルのすべての洗浄のために、望ましいが、必須ではありません。このプロトコルを通じて、全体にわたってソリューションを交換マウントは井戸の側から解決策を慎重に吸引する必要があります。その後、よくは解がwholemountに直接、ウェルの側面を超えていない洗うように角度を付け、転送ピペットを使用してソリューションを再充填される。常に上を向くようwholemountの心室側を保つように注意してください。ソリューションの積極的なピペッティングがしばしばwholemountを反転します。私たちは、乾燥から組織を防止するために、一度に1 wholemountにわたってソリューションを交換することを好む。
  3. PFAを洗浄した後、wholemountsはトリトン- X100の有無にかかわらず、0.1MのPBSで10%正常ヤギやロバ血清を含む、ブロッキング溶液で、室温で1時間インキュベートする。あなたの染色のためにトリトン- X100を使用している場合は、ブロッキング溶液の2%または0.5%のTriton - X100のどちらかを使用することもできます。このようなSVZにあるものを抗原として​​組織に深く抗体の浸透を、必要とする抗原を染色するときに我々は、2%トリトン- X100を使用してください。しかし、そのような上衣細胞の頂端表面に見られる抗原として​​側壁の表面に近い位置抗原を染色する際、我々は、0.5%トリトン- X100を使用してください。さらに、トリトン- X100は、細胞表面または界面活性剤によって削除または変更されている他の抗原にするために省略することができます。
  4. 次に、ブロッキング溶液を除去し、同じブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加えると4で24または48時間インキュベート℃を潜伏期間の選択は、0.5%または2%のトリトンの選択に似て、抗原に依存します。 wholemountの表面にある抗原に対して、24時間のインキュベーションで十分です。しかし、より深く、そのようなSVZのようにある抗原に対して、48時間の潜伏期間は、良い結果をもたらします。
    例えば、側脳室の壁の内側を覆う細胞の先端面と基底体を研究するために、細胞膜を標識するために、β-カテニンに対する抗体で染色し、γ-チューブリン、基礎体にラベルを付けること。 0.1 M PBSは10%正常ヤギ血清、0.5%トリトン- X100を含むでマウス抗β-カテニン抗体(1:500)とウサギ抗γ-チューブリン抗体(1:1000)を希釈する。 ℃で24時間4℃でインキュベートする。
    成体神経幹細胞、またはタイプのB1細胞を染色するために、GFAP抗体と横方向の壁を汚す。 0.1 M PBSは10%正常ヤギ血清、2%トリトン- X100を含むでマウス抗GFAP抗体(1:500)を希釈する。 4℃で48時間インキュベートする。
  5. 一次抗体を0.1%トリトン- X100の有無にかかわらず、PBSで2迅速なリンスが最初に洗い流されている。その後、室温で20分間ずつ3追加の洗浄の操作を行います。
  6. 一次抗体に使用したのと同じブロッキング溶液に二次抗体を希釈し、4℃で一次抗体のための時間と同じ長さのためにインキュベートするwholemountsに追加℃に
    例えば、β-カテニンとγ-チューブリンの染色用:希釈のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウス抗体(1:400、マウス抗β-カテニンを認識)およびAlexa Fluor 594ヤギ抗ウサギ抗体(1:400、 0.1 M PBSは10%正常ヤギ血清、0.5%トリトン- X100を含むでウサギ抗γ-チューブリンを)認識する。 ℃で24時間4℃でインキュベートする。
    10%正常ヤギ血清、2%トリトン- X100を含む希釈のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウス抗体(1:400、マウス抗GFAPを認識する)0.1 M PBS:GFAP免疫染色がため。 4℃で48時間インキュベートする。
  7. 二次抗体を一次抗体のために行われた同じ洗浄液を使用してwholemountをオフに洗浄される。
  8. 必要に応じて、核の対比染色は室温で30分間PBSで希釈し、PBSで1回洗浄するDAPIでインキュベートすることにより、この時点で行うことができます。

V.は、共焦点顕微鏡用スライドに免疫染色Wholemountsの取り付け

  1. 厚い組織200から300ミクロンのスライバーと側脳室の唯一の側壁を保持するために、サブ解剖するために必要なwholemountsを免疫染色に続く、高分解能共焦点イメージングのための。根本的線条体からの横方向の壁を分離することで、それがスライド上にマウントすることができますし、平坦な方法でカバースリップでカバー。
  2. 滑らかな細かい鉗子、Sharpoint 22.5 °顕微刺すナイフ、解剖皿、顕微鏡スライドとカバースリップ、0.1 M PBS、およびAquamount封入剤:免疫染色wholemountsと、次の工具および機器と実体顕微鏡に戻ります。
  3. 24ウェルプレートから心室側を上にしないように注意して0.1MのPBSを含む解剖皿にwholemountを転送する。
  4. 最初に、完全に脳梁は、横の壁を満たしているラインに沿って正確に切断することにより後方から前方へwholemountの背側皮質を取り除く。これは、脳梁白質とピンクに見えるSVZとの間のインターフェイスとして認識されます。
  5. その後wholemountの腹側面にわたる長い水平指向のカットを行います。この切断面には、STができます、その上にプラットフォームを提供します解剖の次のステップ中にwholemountをabilize。
  6. 上向きにwholemountの背側表面には、側壁に沿ってへ後の前方からSVZの厚さを可視化することができるようになります。このビューが見られるように根本的線条体とSVZを可能にする皮質の初期除去することによって可能になったことに注意してください。 SVZは、心室の表面から線条体に至る組織の薄いバンドとして識別されます。線条体は、白質のコードで潜入している間SVZは、均一なピンク色の外観を持っています。 SVZが前方に厚くなると後方に徐々に薄くなることに注意してください。
  7. あなたがSVZと線条体のインタフェースを識別したら、慎重に背から腹にナイフを進め、側壁の前方、ほとんどの面でこのインターフェイスで切削開始。正確にこれを行うには、2つのピンとして使用してピンセットでwholemountを安定化させる。また、少し刃が横方向の壁を越え背から腹に進む視覚化するwholemountをオンにして鉗子を使用することができます。この解離の鍵は、非常に平坦であることが組織の結果スライバーためのものです。これは、横方向の壁を越えへ後の前方からSVZをオフにスライスとして、あなたが作るカットの向きが常に心室表面に平行なままでなければならないことを意味します。
  8. より後方にそれを覚えて、SVZは薄くなる。むしろこの時点でのみSVZを遮断するために解剖を間引くよりも、それはあなたが後方に進むように、解剖されている組織の厚さが同じままであることが重要です。これは、後でマウントされる組織の裂片が平らであることを保証します。
  9. 完全に根本的線条体からの横方向の壁を分離した後、慎重に心室壁の一部ではないこのスライバから他のすべての周囲の組織を削除します。
  10. その後、下記に鉗子を使用してから、このスライバーをピックアップし、顕微鏡のスライドの中央に配置します。 wholemountに直接aquamountの数滴を適用し、ゆっくりと組織の表面に気泡を導入しないようにしようと、この上の中心カバースリップを配置。スライドの重量はそのaquamount分散する均等に確保され、側壁面の洗練された平坦化が生成されます。 aquamountの使用量とカバースリップのサイズは、解剖されている組織の年齢に依存する。胎児と出生後早期の組織のために、我々はaquamountの1滴と22"× 30"カバースリップを好む。共焦点レーザはカバースリップと組織表面との間でaquamount在住の薄層を貫通して少なくできるようになるので、重いカバースリップは、組織が不安定になることがありますし、より多くのaquamountは、画像品質に干渉します。後で生後および成体組織のために、我々はaquamount 4滴と24"× 60"カバースリップを使用してください。
  11. スライドはその後° Cイメージングの前に1-2日間カバースリップが解決できるように4でスライド帳にフラット格納されています。

代表的な結果

Wholemountアプローチは成人SVZの胚の活性にいくつかの重要な洞察を提供している。 SVZの若い神経細胞の移行のチェーンのネットワークは、最初の側脳室の側壁のwholemounts後に観察されたポリシアル酸神経細胞接着分子(PSA - NCAM)1に対する抗体で免疫染色を行った。移行する神経芽細胞のこれらの鎖は、またdoublecortin抗体( 図1)でwholemountsを免疫染色した後に見ることができます。驚くべきことに、チェーンのネットワークは、細胞の2つの一般的な流れ、上の背側に実行しているとの接着点を中心に腹側に実行されているものと、紋切り型のパターンを持っています。 SVZのWholemountsも、 図2におけるKi67染色で見られるように、この地域における前駆細胞の増殖活性の包括的なビューを提供します。興味深いことに、最近の二つの研究では、分割しSVZの細胞と局所血管系2,3( 図2)との間の密接な相互作用を示唆している。

ハイパワー共焦点顕微鏡下で検査する場合、wholemountsが提供する専用バス顔のビューは、脳室系の内側を覆う細胞の先端面のユニークな視点を可能にします。このアンフェイスの視点は、最近、SVZのタイプのB1細胞、成体神経幹細胞は、非分裂、分化上衣細胞4との混合神経上皮の一部であることを明らかにした。心尖部型のB1細胞の接触の表面側脳室と風車の構成( 図3、矢印はB1頂面を示す)における上衣細胞の大頂面に囲まれています。また、上衣細胞の頂端表面の精密検査は、その基礎体の並進位置および回転方向は、その平面極性5の指標であることを明らかにした。上衣細胞基底BO金型は、頂端表面上のパッチにまとまっている。このパッチは、CSFの流れ(並進極性)を基準にして川下"方向に先端面の中心からずれている、このパッチ内に、それぞれの基礎体温はその長軸周りに回転であるように基底の足、基底のアクセサリー体、流れの方向の点(回転極性)。近隣上衣細胞が同じ方向に配向その基礎の体を持っている。重要なのは、上衣フローアッセイのvideomicrographsが直接側壁の特定の領域の流れを比較するために使用することができますその地域における上衣細胞基底体( 図4)の方向へ。

より高い電力のイメージングと、成体脳における最大の胚地域のパノラマの視点を提供することに加えて、wholemountsはSVZにおける個々の細胞の形態のより完全で詳細な分析を可能にする。 wholemountsで免疫染色GFAPのハイパワー共焦点イメージングがそのタイプのB1細胞を明らかにした、彼らの短い心室接触先端突起を加えて、血管( 5)4と接触して長い基礎プロセスを持っている。基礎プロセスは、心室壁のほとんどが並列実行されるため、この細胞構築は冠状のセクションで既に高く評価されていなかった。シリアルセクショニングは、したがって、細胞の完全な形態を再構築する、またはSVZにおける他の細胞型との関係を理解することは出来なくなりますので、小さな断片に個々のセルをカットします。 wholemountアプローチは、低消費電力顕微鏡と高出力の顕微鏡による個々の細胞の完全な視点でパノラマビューを提供することで、両方の、古典的な切片の技術に比べていくつかの利点があります。この手法は、この成人の脳胚帯の将来の研究を補完する重要な要素であり続けるだろう。

図1
図1。SVZにおける渡り鳥神経チェーンのネットワーク。タイル張りの共焦点画像は、SVZを通して移行する神経芽細胞をラベルするdoublecortin、に対する抗体で染色された側壁wholemountを再構築。アスタリスク(*)で示されるマイグレーションの二つの一般的な流れ、上の背側に実行しているとの接着点を中心に腹側に実行しているが、あります。矢印は、前()と背側(D)の方向を示している。スケールバー= 1 mmである。

図2
図2。SVZにおける血管と細胞分裂の関係。この側壁wholemountは赤の血管系にラベルを付けるために、緑色の分裂細胞を標識するために、Ki67に対する抗体で免疫染色、およびマウス免疫グロブリンに対する抗体れました。このwholemountを染色する前に生理食塩水で灌流されていないため、内在性マウスIgG分子は、血管内に残ると二次抗マウス抗体によって染色されています。最近の研究では、分割しSVZの前駆体(緑)が血管に近接(赤){シェン、2008#6523} {Tavazoie、2008#6522}に置かれていることを示唆している。矢印は、前()と背側(D)の方向を示している。スケールバー= 1 mmである。

図3
図3。外側の壁に心室接触細胞の頂端表面。 wholemountのハイパワー共焦点画像は緑色で細胞膜を標識するために、β-カテニンを免疫染色し、赤色で基礎体にラベルを付けるためにγ-チューブリン、、これらの上皮細胞の平面構成を明らかにする。タイプB1細胞、成体神経幹細胞は、矢印で示される単一基礎体温と小さな先端面を、持っている。これらの細胞の先端面は、風車の構成で上衣細胞の大規模な先端面に囲まれています。上衣細胞は頂端表面上での複数の基底の体の位置によって示される平面極性を持っている。近隣の上衣細胞は脳脊髄液の流れ{Mirzadeh、2010#6573}の方向に対応する先端面の同じ側(この地域では左方向下向きと)上に設定されている基礎体温のクラスタを、持っている。スケールバー=10μmである。

図4
図4。上衣フローアッセイ。上衣フローアッセイ中に撮影動画から100シーケンシャルフレームをマージすることによって作成された合成画像。蛍光マイクロビーズは、背側と接着面積の後方に堆積モンロー孔に向かって、二つの指向ストリーム、上の1つおよび付着下のいずれかで上衣繊毛によって推進された。この指向の流れは、上衣細胞の機能的な平面極性を明らかにする。各フローラインは、時間内の連続する点で、単一のビーズの位置を示しています。スケールバー= 0.5 mmである。


図5。GFAP +タイプのB1細胞は血管のエンドフィートと長い基底繊維を持っている。側壁wholemountから撮影した高パワー共焦点スタックの最大投影は、SVZアストロサイトにラベルを付けるためにGFAP抗体で免疫染色。この染色は、ラベル成体神経幹細胞を、またはタイプのB1細胞、心室表面の頂結末を持って、そしてここに示されているように、長いGFAP +血管(矢印)で終了する基底繊維。二次抗体は、血管内に内因性のマウスIgGを認識するマウス抗GFAP抗体を可視化するために使用されるので、血管がここに染色されています。スケールバー= 50μmの。

Discussion

心室と脳室帯の神経発生のほとんどの研究は、これらの地域におけるミクロ解剖学と細胞の関係を調べるために古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、抗有糸分裂の治療6次のSVZの幹細胞集団の再生を研究するために使用された最初のSVZ 1で生成された神経芽細胞の遊走チェーンのネットワークを分析するために使用する別の方法を、、説明、および最近では正確な頂を研究するために使用と成体SVZの神経幹細胞2,3,4の基底細胞間の相互作用。興味深いことに、この手法は、成人SVZの神経幹細胞、またはタイプのB1細胞は、差別化された非分裂上衣細胞と混合した神経上皮の一部であることを明らかにした。 EN -顔のwholemountsを用いたイメージングでは、この混合神経上皮が上衣細胞の4大頂面に囲まタイプのB1細胞の頂端部のエンディングで構成される風車のアーキテクチャを持っていることを示しています。このエン顔分析は、血管ニッチに連絡心室表面における心尖部終末と基底のプロセスを持つ細胞で構成されるような胚と成体脳における神経幹細胞の系統の我々の理解を明確にしています。これらの知見は、古典的な切片の技術を使用して、ほぼ不可能だったろう。また、心室接触先端突起を介して神経幹細胞の識別を容易にWholemounts。これらの幹細胞が発見されたために、より特異的なマーカーとして、wholemountsは、神経幹細胞の振る舞い​​を識別し、分析の不可欠な部分となります。

側脳室の壁のWholemountsも上衣細胞の平面極性を研究するための理想的な視点を提供しています。上衣細胞は、協調的にCSFを推進するために機能する心室の内側を覆うmulticiliated細胞である。 wholemount手法では、全体の上衣上皮はen -顔を露出していると後部との背腹境界に染色し、その前から総合的に検討することができます。さらに、急性解剖、ライブwholemountsで実行上衣フローアッセイは、確実に上衣繊毛によって生成された平面偏光の流れを示しています。 wholemountアプローチを使用して最近の仕事は、この上衣平面極性5の細胞の決定要因を明らかにした。興味深いことに、wholemount研究はまた、上衣、生成されたCSFのフローは、SVZ 7の若い神経細胞の遊走を導くchemorepellentsの勾配を確立することを示唆している。当初は渡り鳥神経チェーンのネットワークを識別Wholemountアプローチはそのためチェーンの移行を調節する機構についての洞察を提供し続けている。

wholemountイメージングによるVZとSVZの分析は、両方とも今後の研究と既存研究の我々の理解を明確にする方法のための新しいアプローチが追加されます。例えば、最近の研究では、成人SVZにおける神経幹細胞が脳室8と接触してCD133 + / CD24 -細胞であることが示唆された。セクションでそれらの免疫染色に基づいて、これらの著者らは、これらの細胞はmulticiliated上衣細胞の亜集団であることを主張した。しかし、全体上衣上皮のより包括的なビューを与えるwholemountアプローチを、使用して私たちの研究で、我々はそのすべての上衣細胞はCD24とのみ心室接触CD133は+ / B1型のサブセットCD24 -であった細胞が見つかりました細胞4。さらに、wholemountテクニックは成人の脳9の神経幹細胞の最近記載されたモザイクの組織を調べ、今後の研究に有用であることを約束。いくつかの研究は、成体脳における神経幹細胞は均一な集団ではないことが示されているが、地域的に指定されており、通常は嗅球の介在ニューロンの特定のサブタイプを生成する。これらの研究は、神経幹細胞の異なる亜集団が特定の転写因子の発現10,11,12,13,14および/ ​​またはの背腹と前後のエクステントに沿ってそれらの局所的配置のいずれかによって区別される可能性があることを提案した側壁9,15,16。成体神経幹細胞の地域指定のサブポピュレーションのより多くの分子マーカーが同定されているとして、wholemountイメージングは​​、心室壁に沿ってこれらの異なる前駆細胞ドメインのparcelationの包括的なビューを提供する必要があります。

ここで提示wholemount解剖と画像化技術は、胚の心室壁を分析するために使用されることがあります。胚の外側の壁の解離についても同様に、ステップバイステップで、実行されます。難易度のわずかな違いがありますが、胚の心室は解剖が容易に比較的大きいですが、組織は、操作をより困難に柔らかいです。特に、側脳室の同様の暴露は、エンブリーで使用することができます。OSは、皮質神経発生を研究するために心室の皮質壁を細かく分析する。最近の証拠は、非対称中心体の継承は、皮質神経発生17中に心室の表面に放射状グリアを維持することを示唆している。放射状グリア頂面の専用バスの顔画像は、これらの分裂細胞内の中心体が非対称的にどのように継承されるかについての洞察を提供することがあります。

特にほとんどの技術、正確な器用さを伴うものと同様に、支配は練習が必要です。より良い結果への鍵となる解剖のいくつかの要素が、しかし、があります:1)照明は、影を作成するサンプルの照明を調整することのような鉗子を使用して)そうでなければ、2は比較的均質である組織の解剖中に貴重なコントラストを提供します。このテクニックの2つの昆虫ピン鉗子を一緒に挟んだり、組織をピックアップするために使用されることはありませんが、)、穏​​やかな収縮のバランス03を切断し、ナイフを切断いけないしながら組織を安定させるために継続的に再調整することができる機動性のピンとして使用されるのみカットするだけでなく、この解剖の大半は実際には断続切削で穏やかな収縮を介して実行されていることを思い出して、内側と外側の壁を分離するために穏やかな撤回を提供するために使用される。

Acknowledgments

NIHの助成金HD - 32116、財団、ジョンボウズ幹細胞の基金、文部科学省、厚生労働省、及びHFSPの支援サンドラファミリーでサポートされて働く。 ZMはカルロスBaldoceda財団とUCSF Krevansフェローシップでサポート。 AA - B。ヘザーとメラニーは、寄附をクシャクシャに保持しています。

References

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脳室下帯恩顔:Wholemount染色と上衣の流れ
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Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

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