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Neuroscience

Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

측면 뇌실 벽은 성인 포유류의 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역을 포함하고 있습니다. 전통적으로이 지역에서 neurogenesis 연구는 histological 분석을위한 고전 sectioning 기술에 의존합니다. 여기서 우리는 다른 접근이 새싹 지역의 종합 엉 - 얼굴보기를 제공 wholemount 기법을 제시한다.

Abstract

측면 심실의 벽 성인 포유류의 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역을 포함하고 있습니다. 이 벽에 subventricular 영역 (SVZ)은 신경 줄기 세포의 행동과 성인 neurogenesis의 규정을 이해하기위한 광범위한 연구의 모델 시스템입니다. 전통적으로,이 연구는 histological 분석을위한 고전 sectioning 기술에 의존합니다. 여기서 우리는 다른 접근이 새싹 지역의 종합 엉 - 얼굴보기를 제공 wholemount 기법을 제시한다. 섹션에 비해 wholemounts는 SVZ 이내에 완료 cytoarchitecture와 세포 관계를 유지하고있다. 이 방법은 최근 성인 신경 줄기 세포 또는 형식 B1 세포는 측면 심실을 안감 차별 ependymal 세포와 혼합 neuroepithelium의 일부입니다 것으로 나타났습니다. 또한이 접근들은 뇌실에서 생성 ependymal 세포와 뇌척수 흐름의 평면 편광을 연구하는 데 사용되었습니다. 성인 신경 줄기 세포가 지역 지정 이기종 인구는 것을 최근에 증거로 wholemount 접근 가능성이 줄기 세포 틈새의 조직과 parcellation을 이해하는 필수적인 도구가 될 것입니다.

Protocol

Ependymal 흐름 분석을위한 형광 Microbeads (단 얼룩 목적 wholemounts을 준비하는 경우 다음 단계가 생략 수)로 채워진 유리 Micropipettes의 I. 준비.

  1. 유리 micropipette 풀러에 Wiretrol 5 UL 유리 모세관을 보호하고 부드러운, 얕은 테이퍼와 피펫을 잡아 히터와 솔레노이드 설정을 조정합니다.
  2. 뽑아 micropipette의 마지막에 긍정적인 공기 압력의 소스를 첨부와 45 ° 각도로 금속 격자 표면에 피펫의 부드럽게 하단 끝이 beveled 팁을 만들 수 있습니다. 긍정적인 공기 압력은 피펫의 안쪽에서 유리 파편을 취소하는 데 도움이됩니다. 에탄올 moistened 조직과 beveled 팁의 끝을 청소하십시오.
  3. 마이크로 미터와 현미경 피펫의 팁을 확인합니다. 끝이 ~ 100 음의 내부 여는 직경과 부드러운 베벨이 있어야합니다. 작은 직경을 사용하지만 종종 형광 구슬로 피펫의 막히는 초래할 수 있습니다.
  4. 미네랄 오일 Backfill 피펫은 이미 내려 졌네 때까지 다음 피펫의 뒤쪽에 그리스 - 과감하게 플런저를 삽입합니다. 수동으로 플런저의 추진으로 피펫 팁을 광유 사전에 초승달 모양.
  5. micromanipulator에 micropipette와 플런저를 확보 후, 조절 가능한 높이와 작은 고정 팔로 micromanipulator의 피펫 홀더 나사.
  6. Frontload 50% 형광 microbead 주식 솔루션, 45 %의 물, 5 % 글리세롤로 구성된 형광 microbead 솔루션으로 피펫. 글리세롤은 wholemount에 예금하면 microbeads은 표면에 싱크대 있도록 솔루션의 밀도를 높이기 위해 추가됩니다.
  7. 바늘이 실수로 고장 및 wholemount 해부 진행되지 않습니다 안전한 장소에 micromanipulator를 놓습니다.

II. Wholemount 해부 및 고정

  1. 37 L - 15 Leibovitz 미디어 wholemount 절개를 준비하는, 따뜻한 충분한 수량 ° C. 당신은 해부하다 계획이 동물마다 당신은 약 10 ML이 필요합니다. 가위, 톱니 대형 포셉, 부드러운 고급 포셉, Sharpoint 22.5 ° microsurgical 찌른 칼, 해부 접시, 종이 타월, 생물 학적 가방 및 가득한 얼음에 24 잘 접시도 모두가 stereomicroscope에 의해 해부 및 고정을 위해 필요한 물자를 수집 트리톤 X - 100 또는 0.1 %없이 4 % paraformaldehyde. 트리톤 X - 100이 솔루션에 immersing 때 wholemount 표면 전단의 발생을 감소 PFA 솔루션의 표면 장력을 감소하는 데 사용됩니다.
  2. 형광 stereomicroscope 아래에 위치 해부 접시에 따뜻하게 미디어 50-10 ML 하거라. 해부 요리는 다음 철저하게 사용하기 전에 물을 대량으로 요리를 rinsing, 6cm 플라스틱 그릇에 Sylgard 184라는 탄성 폴리머, 용탕 주입하고 진공 하에서 1 주일 폴리머 솔루션 치료법을 주어 준비가되어 있습니다. 보통, 우리는 요리를 1 주일 동안 1 L의 비커에 물에 담그다 보자.
  3. 동물은 경추 전위에 의해 희생되고 머리가 차단됩니다.
    참고 : 원하는 경우, 혈액이 정상적인 생리와 동물을 perfusing 전에 두뇌를 해부하기 위해하여 vasculature에서 삭제됩니다. diaminobenzidine (DAB)로 chromogenic immunostaining을 수행하는 경우 특히 중요합니다.
  4. 정중선 절개는 두개골을 나타내기 위해 두피 따라, 앞쪽이 후부 이루어집니다.
  5. 두개골 4 삭감의 일련의 두개골을 열어 만들어진 하나 상처가 다음 두 인하는 소뇌에 열등하고 두개골 바닥에서 두개골을 분리하고, 최종 상처가 실행 후각 전구에 앞쪽에 두 개의 궤도에 걸쳐 중간 화살 봉합 따라 앞쪽이 후부.
  6. 두개골 펄럭이 부드럽게 철회하고 두뇌가 해부 접시로 추출하여 배치됩니다.
  7. 해부의 나머지 부분은 stereomicroscope하에 수행됩니다. 첫째, 후각 구근은 두뇌에서 거리를 해부하고 있습니다. 당신이 후각 전구를 검사하기 위해 추가하려는 경우, 단순히 하룻밤 4% PFA에 침수하여 문제를 해결하고이 후 sectioning 및 얼룩을 위해 그들을 준비 수도 있습니다.
  8. interhemispheric 균열 (fissure)을 따라 머리를 나눕니다.
  9. coronally 지향 컷은 다음 꼬리 해마 교차 부분에 시각 수 있도록, interhemispheric 균열 (fissure)의 뒷부분 - 대부분의 측면에서 이루어집니다.
  10. 이 위치에있는 측면 뇌실의 내측 벽을 형성 해마는 다음 뇌실의 지느러미 - 측면 벽을 형성 overlying의 피질에서 발표해야합니다. 첫째, 칼은 피질과 해마 dorsally 사이의 작은 심실 공간에 삽입하고, 절단은 해마에 참여하기 위해 멀리 정중선에서 그것이 ventrally 반영 피질에서 이루어집니다. 이 상처를 만든 후, 피질은 천천히 지느러미에서 복부로 이동 측면 뇌실을 나타내기 위해 해마 떨어져 벗겨 수 있습니다. 이 기동은해마가 릴리스된 모서리에 피질의 쐐기를 잘라하여 신속. 이 위치에있는 측면 뇌실의 복부 - 대부분의 정도에 도달하면, 당신도 해마 가입을 다시 medially 시각화 또는 피질이 다시 주위를 래핑 어디 느낌이 시간이 반영됩니다. 또 다른 상처가 완전히 해마 또는 피질이나 측면 뇌실의 측면 벽의 측면 뇌실의 중간 벽을 해제하려면이 위치에 만들 수 있어야합니다.
  11. 그런 다음 널리 측면 뇌실을 열려면, medially 및 anteriorly, 멀리 피질의 해마를 당길 쉬운 것입니다.
  12. 부드럽게 anteriorly 떨어져 중간과 측면 벽을 철회 포셉와 나이프 작은 스트로크를 사용하여 해마를 당길 계속합니다.
  13. 이 철회에 대한 저항이 증가하기 시작하면, 추가 삭감이 필요합니다. 첫째, 측면 뇌실에 노출을 증가하고 특히, 측면 벽과 SVZ은 피질 멀리 해부하다. 대뇌 피질은 정상적으로 코퍼스의 callosum와 VZ / SVZ 사이의 인터페이스를 시각화하여 거리를 해부합니다. 간단히 SVZ 손상을 방지하기 위해 callosal 측면에 머무는이 인터페이스를 따라 했네요.
  14. 멀리 측면 벽에서 retracting 중간 벽을 계속하기 위해서는 두 개 더 삭감이 필요합니다 : 측면 벽, 중간 벽, 그리고 피질 모든 수렴 어디 하나 dorsally 컷, 그리고 하나는 ventrally 컷 어디 측면 벽, 중간 벽 및 시상 수렴. 이러한 상처가 만들어으로 중간 벽에 대한 자세한 부드러운 철회는 측면 뇌실의 앞쪽에 - 대부분의 범위를 열 수 있습니다.
  15. 적절한 조명 절차 전반에 걸쳐 특히 중간과 측면 벽이 anteriorly 분리하는 다음 단계에서 필수적입니다. 측면 뇌실이 앞쪽에 위치에서, 중간 벽 다시 반영 및 측면 벽과 함께 지속됩니다. 두 벽 사이의 캐스트 그림자가 두 벽 사이의 계곡처럼 나타나는이 반사 지점을 공개 그러한 조명을 조정합니다. 이 두 벽을 구분이 계곡에 정확하게 잘라.
  16. 마지막으로, 완전히 ventrally dorsally 모든 걸쳐 피질과 시상을 제거하여 측면 벽을 폭로.
  17. immunostaining에 대한 wholemounts을 준비하는 것은 신중하게 4 야간 고정을위한 트리톤 - X100 또는 0.1 %없이 4퍼센트 PFA 가득한 24 잘 플레이트 ° C.에 절개 요리에서, 최대 wholemount, 뇌실 측면을 전송하는 경우 고정 구분 항원 경우, wholemounts는 시간의 짧은 기간 동안 고정 수 있습니다. 다음 immunostaining wholemounts에서 제 4 항을 참조하십시오.
  18. ependymal 흐름 분석을위한 wholemounts을 준비하는 경우, 신선한, 37 ° C Leibovitz 매체로 가득 깨끗한 해부 접시에 wholemount을 전송하고 다음 섹션을 참조하십시오.

III. 형광등 Microbeads를 사용하여 Ependymal 흐름 분석

  1. 이 곤충 핀, 시상에 하나 wholemount의 앞쪽에 - 지느러미 구석에 하나를 사용하여 깨끗한 해부 접시에 wholemount를 무력화.
  2. stereomicroscope 옆에있는 micromanipulator을 잡고 정지 팔의 기초를 놓습니다. 조정 팔 높이가 maximally 해부 접시에 대해 바늘을 깨는 피하기 위해 고가 있는지 확인하십시오.
  3. 조심스럽게 바늘의 외부 끝에 존재하는 microbeads를 청소 ependorf 튜브 미디어에있는 바늘의 팁을 찍어. 이들은 거리 청소하지 않으면, 그들은 이후 바늘 위치하는 동안 실수로 wholemout 표면에 예치하고 영화의 전반적인 품질을 줄일 수 있습니다.
  4. 측면 벽 등의 표면을 통해 바늘 끝을 위치와 매체에 바늘 팁을 가져 팔을 낮추십시오. 단지 옆 벽면 위에 때까지 바늘이 낮아해야합니다.
  5. 위치에 바늘로 확대를 조정하고 원하는 필드를 충당하기 위해 stereomicroscope에 중점을두고 있습니다. 당신이 ependymal 흐름의 녹음을 만들 수있다면, 이번에 이미지를 획득 시작합니다.
  6. wholemount의 표면에 microbead 솔루션 ~ 5 NL를 꺼냅니다. 일단 구슬의 초기 볼러스가 ependymal 흐름에 의해 표면에서 삭제되었습니다 비드 분출 추가 순찰을 수행할 수 있습니다.

IV. Immunostaining Wholemounts

  1. immunostaining에 대한 해부 Wholemounts 4 ° C.에서 또는 0.1 % 트리톤 - X100없이 4% PFA에서 야간 집중 - 고정되어 있습니다 트리톤 - X100의 사용이 치료를 용납 항원에 대한 선호하지만, 얼룩 품질이 세제가 감소되는 경우에서 빠지지 수 있습니다.
  2. 다음 아침, PFA는 24 잘 접시에서 aspirated되고 wholemounts는 또는 0.1 % 트리톤 - X100없이 0.1 M PBS 5 분마다 3 번 씻어 있습니다. 전처럼 트리톤 - X100의 사용이 프로토콜의 모든 세척을 위해 선호하지만, 필요하지 않습니다. 이 프로토콜 통해 전체를 통해 솔루션을 교환마운트는 잘 측면에서 솔루션의주의 열망이 필요합니다. 그런 다음, 잘가 wholemount에 글쎄, 직접의 측면에 걸쳐 솔루션을 세척 그러한 직각 전송 피펫을 사용하여 솔루션을 리필합니다. 항상 최대 직면하고있는 wholemount의 뇌실 측면을 유지하는데주의를 기울여야. 솔루션 활발한 pipetting는 종종 wholemount 플립 것입니다. 우리는 건조로부터 조직을 방지하기 위해 한 번에 한 wholemount 이상의 솔루션을 교환하는 것을 선호합니다.
  3. PFA를 세척 후, wholemounts은 트리톤 - X100 여부와 상관없이 0.1 M PBS에서 10 % 정상 염소 또는 당나귀 혈청을 포함 차단 용액에 실온에서 1 시간 동안 incubated 수 있습니다. 귀하의 얼룩을위한 트리톤 - X100를 사용하는 경우, 당신은 차단 솔루션 2 % 또는 0.5 % 트리톤 - X100 하나를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 같은 SVZ에있는 그 항원으로 조직에 깊이 침투 항체를 필요로 항원에 대한 얼룩 때 2 % 증가 트리톤 - X100을 사용합니다. 그러나, ependymal 세포의 꼭대기의 표면에서 발견 항원으로 측면 벽의 표면에 가까이 위치하고 항원에 대한 얼룩 때, 우리는 0.5 % 트리톤 Triton - X100을 사용합니다. 또한, 트라이 튼 - X100은 휴대 표면 또는 세제로 제거하거나 변경 다른 항원을 위해 남아있을 수 있습니다.
  4. 다음, 차단 솔루션을 제거하고 동일한 차단 솔루션에 희석 일차 항체를 추가하고 4 24 또는 48 시간 동안 품어 ° C.를 잠복기의 선택은 0.5 % 또는 2퍼센트 트리톤의 선택과 유사한 항원에 따라 달라집니다. 에 대한 wholemount의 표면에있는 항원, 24 시간 배양 충분. 그러나, 깊은, 등 SVZ 같이있는 항원에 대해, 48 시간 배양 기간이 더 나은 결과를 제공합니다.
    예를 들어, 측면 뇌실 벽을 라이닝 세포의 꼭대기의 표면 및 기초 시체를 연구, 세포막을 라벨, β - catenin에 항체와 얼룩, 및 γ - tubulin, 기초 단체 레이블을합니다. 0.1 M PBS 10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 - X100을 포함에서 마우스 반대 β - catenin 항체 (1:500)와 토끼 방지 γ - tubulin 항체 (1:1000)를 희석. ° C 24 시간 동안 4 알을 품다.
    성인 신경 줄기 세포 또는 형식 B1 세포를 얼룩이, GFAP 항체와 측면 벽에 얼룩. 0.1 M PBS 10 % 정상 염소 혈청과 2퍼센트 트리톤 - X100을 포함에서 마우스 반대 GFAP 항체 (1:500)을 희석. 4 ° C 48 시간 품어.
  5. 차 항체는 PBS에서 또는 0.1 % 트리톤 - X100없이이 빠른 rinses에 의해 처음 씻어 수 있습니다. 다음 이십분 실온에서 각각 3 추가 씻는다 할.
  6. 차 항체에 사용된 것과 같은 차단 솔루션 차 항체를 희석하여 4 일차 항체에 관해서는 시간의 같은 기간 동안 부화 wholemounts에 추가 ° C.
    예를 들어, β - catenin과 γ - tubulin을위한 염색법에 대한 (1:400, 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 항체 (1:400, 안티 - β - catenin 마우스를 인식)와 알렉사 플루어 594 염소 방지 토끼 항체를 희석 0.1 M PBS 10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 - X100을 포함에 토끼 반 γ - tubulin)을 인식합니다. ° C 24 시간 동안 4 알을 품다.
    GFAP의 immunostaining 경우 : 희석 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 항체 0.1 M PBS 10 % 정상 염소 혈청과 2% 트리톤 - X100을 포함에 (1:400, 마우스 방지 GFAP를 인식). 4 ° C 48 시간 품어.
  7. 이차 항체는 일차 항체에 대해 수행한 동일한 세척을 사용하여 wholemount을 씻어 있습니다.
  8. 원하는 경우, 원자력 카운터 - 얼룩 30 실온에서 분 후 PBS에 한 번 세탁을 위해 PBS에 희석 DAPI의 잠복기가이 시점에서 수행할 수 있습니다.

V.은 공촛점 현미경을 위해 슬라이드에 Immunostained Wholemounts 장착

  1. 고해상도 공촛점 이미징 들어, 200-300 음 두꺼운 조직 놓여있로 측면 뇌실만을 측면 벽을 유지하기 위해 하위 해부하는 데 필요한 wholemounts을 immunostaining 다음. 기본 striatum에서 측면 벽을 분리하는 것은 그것이 슬라이드에 장착 및 평면 방식으로 coverslip으로 덮여 수 있습니다.
  2. 부드러운 고급 포셉, Sharpoint 22.5 ° microsurgical 찌른 칼, 해부 접시, 현미경 슬라이드 및 coverslips, 0.1 M PBS, 그리고 Aquamount 장착 매체 : immunostained wholemounts 다음과 같은 도구와 장비 stereomicroscope으로 돌아갑니다.
  3. 24 잘 판에서 뇌실 측면을 유지하기 위해주의되는 0.1 M PBS를 포함하는 해부 접시에 wholemount를 전송합니다.
  4. 첫째, 완전히 코퍼스의 callosum의 측면 벽을 충족 라인을 따라 정확하게 절단하여 앞쪽이 후부에서 wholemount의 지느러미 피질을 제거합니다. 이것은 callosal 흰색 물질과 분홍색 - 나타나는 SVZ 사이의 인터페이스로 인식되고 있습니다.
  5. 다음 wholemount의 복부 측면에 걸쳐 긴 가로 지향 절단합니다. 이 상처의 표면은 일 수있는에있는 플랫폼을 제공합니다해부의 다음 단계 동안 wholemount을 abilize.
  6. 최대 직면하고있는 wholemount의 등의 표면, 당신은 측면 벽을 따라 사후에 앞쪽에에서 SVZ의 두께를 시각화 수있을 것입니다. 이보기는 기본 striatum 및 SVZ 볼 수 있도록 피질의 초기 제거에 의해 가능하게되었다합니다. SVZ은 심실 표면에서 striatum에 걸친 조직의 얇은 밴드로 식별됩니다. striatum이 흰색 물질의 코드에 의해 침투하는 동안 SVZ는 단일 분홍색 모양을하고 있습니다. SVZ가 anteriorly 두껍와 후부로 점차적으로 얇은되고 있습니다.
  7. 일단 SVZ과 striatum의 인터페이스를 식별 가지고 신중하게, 측면 벽의 앞쪽에 - 대부분의 측면에서이 인터페이스에서 절단 등의에서 복부에 칼을 발전 시작합니다. 정확하게이 작업을 수행하는 두 개의 핀을 사용하여 집게로 wholemount 안정화. 당신은 또한 약간 지느러미의 측면 벽 전체 복부로 발전 칼날을 시각화하기 위해 wholemount을 돌리는 당신의 집게를 사용할 수 있습니다. 조직의 결과로 놓여있는 매우 평평해야이 절개의 열쇠입니다. 이것은 측면 벽에 걸쳐 사후에 앞쪽에에서 SVZ를 슬라이스로, 당신이 만드는 인하의 방향은 항상 심실 표면에 평행하게 유지해야한다는 것을 의미합니다.
  8. 더 뒤로 그 기억 SVZ가 얇아집니다. 오히려이 시점에서 단지 SVZ을 차단하기 위해 절개를 점점 없어 지는데보다 당신이 뒤로 사전으로 해부되는 조직의 두께가 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 이후 탑재 것입니다 조직의 은색이 평평한지 확인합니다.
  9. 완전히 기본 striatum에서 측면 벽을 분리 후, 조심스럽게 심실 벽의 일부가 아닌이 은색에서 다른 모든 주변 조직을 제거합니다.
  10. 그런 다음 아래 집게를 사용하여에서이 은색을 선택하고 현미경 슬라이드의 중심에 위치. 직접 wholemount에 aquamount 몇 방울을 적용하고 부드럽게 조직의 표면에 거품을 소개 않으려고,이 이상의 중심 coverslip을 넣으십시오. 슬라이드의 무게는 그 aquamount 분광 균등하게 보장되며 측면 벽 표면의 세련된 평평화를 생성합니다. aquamount의 양은 사용 coverslip의 크기를 해부되는 조직의 나이에 따라 달라집니다. 배아와 초기 출생 후의 조직을 위해, 우리는 aquamount 1 중퇴하고 22 "X 30"coverslip을 선호합니다. 공촛점 레이저는 coverslip 및 조직 표면 사이 aquamount 거주의 얇은 레이어를 침투 덜 수있을 것입니다 있기 때문에 무거운 coverslips은 조직을 왜곡 수 있고 더 많은 aquamount은 이미지 품질에 영향을 것입니다. 나중에 출생 후의 성인 조직을 위해, 우리는 aquamount 4 방울, 24 "X 60"coverslip을 사용합니다.
  11. 슬라이드는 다음 ° C 이미징 전에 1~2일에 대한 coverslips가 정착하도록 4에서 슬라이드 책을 평면 저장됩니다.

대표 결과

Wholemount 접근은 성인 SVZ의 새싹 활동에 몇 가지 주요 통찰력을 제공하고 있습니다. SVZ 젊은 뉴런을 마이 그 레이션의 체인의 네트워크가 처음 polysialylated 신경 세포 유착 분자 (PSA - NCAM) 1 항체와 immunostained 있던 측면 뇌실의 측면 벽 wholemounts 후 관찰되었다. 마이 그 레이션 neuroblasts 이러한 체인도 doublecortin 항체 (그림 1) wholemounts를 immunostaining 후 볼 수 있습니다. 현저하게, 체인의 네트워크는 세포의 두 일반적인 스트림을 통해 dorsally 실행 하나 부착 지점 주변 ventrally 실행 하나, 틀에 박힌 패턴이 있습니다. SVZ의 Wholemounts 또한 그림 2에서 Ki67 얼룩과 함께 볼 수 있듯이,이 지역에서 progenitors의 proliferative 활동의 포괄적인 전망을 제공합니다. 흥미롭게도 두 최근 연구 나누어 SVZ 세포와 지역 vasculature 2,3 (그림 2) 사이의 밀접한 상호 작용을하는 것이 좋습니다.

고전력 공촛점 현미경 하에서 검사하는 경우, wholemounts에서 제공하는 엉 - 얼굴보기는 심실 시스템을 라이닝 세포의 꼭대기의 표면의 독특한 시각을 수 있습니다. 이 엉 - 얼굴 관점은 최근 SVZ 타입 B1 세포, 성인 신경 줄기 세포가 아닌 나누어 차별화된 세포 ependymal 4 혼합 neuroepithelium의 일부입니다 것으로 나타났습니다. 혀끝의 유형 B1 세포 연락처 측면 뇌실의 표면이 바람개비 구성에서 ependymal 세포의 대형 혀끝의 표면에 둘러싸여 있습니다 (그림 3, 화살표 B1 혀끝의 표면을 나타냅니다.) 또한, ependymal 세포의 꼭대기의 표면 가까이 검사는 translational 위치 및 그들의 기초 신체의 회전 방향이 자신의 평면 극성 5 지표는 것을 밝혔다. Ependymal 세포 기저 보사망은 혀끝의 표면에 패치에 클러스터된 수 있습니다. 이 패치는 CSF의 흐름 (translational 극성)와 관련하여 하류 "방향으로 혀끝의 표면의 중심에서 전이되며이 패치 이내, 각 기초 몸은 긴 축에 대한 회전 같은 것을 기초 발, 기초의 액세서리 시체는 흐름의 방향 (회전 극성)에 가리 킵니다. 주변 ependymal 세포는 동일한 방향으로 지향 그들의 기초의 시체를합니다. 중요한 것은, ependymal 흐름 분석의 videomicrographs 직접 측면 벽의 특정 지역의 흐름을 비교하는 데 사용할 수 있습니다 해당 지역에 ependymal 세포 기초 단체 (그림 4)의 방향으로.

높은 전력 이미징과 성인 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역의 파노라마 시각을 제공하는 것 외에도, wholemounts는 SVZ에서 개별 세포 morphologies보다 완벽하고 상세한 분석을 수 있습니다. wholemounts에서 GFAP의 immunostaining 높은 전력 공촛점 영상이 공개되었다는 유형 B1 세포, 이외에 자신의 짧은 뇌실 - 문의 혀끝의 과정, 혈관 (그림 5) 4와 연락 긴 기초 과정 있습니다. 기초 과정 심실 벽에 주로 병렬 실행하기 때문에 cytoarchitecture는 코로나 섹션 이전에 평가되지 않았다. 시리얼 sectioning 따라서 그것이 거의 불가능 세포의 완전한 형태를 재구성하거나 SVZ 다른 세포 유형의 관계를 이해하고, 작은 조각으로 각각의 세포를 상처. wholemount 접근 방식은 낮은 전력 현미경과 높은 전력 현미경 개별 세포의 전체 관점에서 탁 트인 전망을 제공하는 모두에 고전 sectioning 기술을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 이 기술은 성인 뇌의 새싹 영역의 미래를 연구하는 중요한 보완 될 것입니다.

그림 1
그림 1. SVZ에 철새의 연결 체인의 네트워크. 타일​​ 공촛점 이미지 SVZ를 통해 마이 그 레이션 neuroblasts를 레이블 doublecortin에 항체 물들일되었다 측면 벽면 wholemount를 재구성. 별표 (*)로 표시 마이 그 레이션의 두 일반적인 스트림을 통해 dorsally 실행 하나 부착 지점 주변 ventrally 실행 하나있다. 화살표는 앞의 (a)와 지느러미 (D) 방향을 나타냅니다. 스케일 바 = 1mm.

그림 2
그림 2. SVZ의 vasculature과 분열 세포 간의 관계. 이 측면 벽 wholemount은 빨간색으로 vasculature 레이블을하기 위해 마우스 면역 글로불린에 대한 나누어 녹색 세포와 항체를 라벨, Ki67에 대한 항체와 immunostained했다. 이 wholemount하기 전에 얼룩을 식염수에 perfused 아니었기 때문이지, 내생 마우스 IgG 분자는 혈관 내에 남아 및 보조 안티 - 마우스 항체로 물들어있다. 최근 작품은 나누어 SVZ의 엽 성의 전구 물질 (녹색)가 혈관에 근접 (적색) {셴 2008 # 6523 {} Tavazoie 2008 # 6522}에 있습니다 나타냅니다. 화살표는 앞의 (a)와 지느러미 (D) 방향을 나타냅니다. 스케일 바 = 1mm.

그림 3
그림 3. 측면 벽에 뇌실 - 문의 세포의 꼭대기의 표면. wholemount 높은 전력 공촛점 이미지는 녹색의 세포 세포막을 라벨, β - catenin에 대한 immunostained, 그리고 빨간색 기초 시체를 라벨에 γ - tubulin,이 상피 세포의 평면 조직을 보여줍니다. 유형 B1 세포, 성인 신경 줄기 세포가 화살표로 표시 하나의 기초 본문과 함께 작은 혀끝의 표면을 보유하고 있습니다. 이러한 세포의 꼭대기의 표면은 바람개비 구성 ependymal 세포의 큰 혀끝의 표면에 둘러싸여 있습니다. Ependymal 세포는 혀끝의 표면에 자신의 여러 기초 단체의 위치에 표시된 평면 극성 있습니다. 주변 세포는 ependymal CSF 흐름 {Mirzadeh 2010 # 6573} 방향에 해당하는 혀끝의 표면의 동일한 측면 (이 지역의 왼편쪽에 아래와)에있는 자신의 기초 신체 클러스터를했습니다. 스케일 바 = 10 μm의.

그림 4
그림 4. ependymal 흐름 분석. 합성 이미지는 ependymal 흐름 분석하는 동안 찍은 영화에서 100 순차 프레임을 병합하여 만들었습니다. 형광등 microbeads은 몬로의 구멍을 향해, ​​지느러미와 유착 지역 후부 두 지향 스트림을 통해 하나 접착력에 따라 하나의 ependymal 속눈썹에 의해 추진되었다 입금. 이 지향 흐름 ependymal 세포의 기능 평면 극성을 보여줍니다. 각 흐름 라인은 시간에 연속 지점에서 하나의 구슬의 위치를​​ 묘사. 스케일 바 = 0.5 mm.


그림 5. GFAP + 유형 B1의 세포가 혈관에 최종 발 긴 기저 섬유 있습니다. 측면 벽 wholemount에서 가져온 고전력 공촛점 스택의 최대 투사는 SVZ의 astrocytes 레이블을 GFAP 항체와 immunostained. 이 얼룩은 라벨 성인 신경 줄기 세포를, 또는 입력 B1 세포, 심실 표면에 혀끝의 결말을 가지고 있고, 여기에 표시된 긴 GFAP + 혈관 (화살표)에 끝납니다 기저 섬유. 보조 항체 마우스 방지 GFAP 항체가 vasculature 내에 내생 마우스 IgG를 인식 시각화하는 데 사용하기 때문에 혈관이 여기에 물들어 있습니다. 스케일 바 = 50 μm의.

Discussion

심실과 subventricular 영역에서 neurogenesis 대부분의 연구 microanatomy 이러한 지역에서 휴대 관계를 조사하는 클래식 sectioning 기술에 의존합니다. 여기 우리는 다음 방지 mitotic 처리 6, 그리고 가장 최근에 정확한 혀끝의 연구를하는 데 사용되는 다음과 같은 SVZ의 시조 인구의 재생을 연구하는 데 먼저 SVZ 1 생성 neuroblasts의 철새 체인의 네트워크를 분석하는 데 사용되는 대체 기술, 설명 성인 SVZ 신경 줄기 세포 2,3,4의 기저 세포 - 세포 상호 작용. 흥미롭게도,이 기술은 성인 SVZ의 신경 줄기 세포 또는 형식 B1 세포가 차별이 아닌 나누어 ependymal 전지와 혼합 neuroepithelium의 일부입니다 것으로 나타났습니다. wholemounts를 사용 엉 - 얼굴 영상이 혼합 neuroepithelium는 ependymal 세포 4 대형 혀끝의 표면에 둘러싸여 타입 B1 세포의 꼭대기의 엔딩 구성된 바람개비 아키텍처를 가지고 나타났습니다. 이 엉 - 얼굴 분석 혈관 틈새 문의 뇌실 표면에 혀끝의 엔딩과 기초 프로세스 세포의 구성으로 배아와 성인 두뇌의 신경 줄기 세포의 혈통에 대한 우리의 이해를 명확히하고 있습니다. 이러한 연구 결과는 고전 sectioning 기술을 사용하여 거의 불가능했을. Wholemounts들은 또한 뇌실 - 문의 혀끝의 과정을 통해 신경 줄기 세포의 식별을 용이하게합니다. 이러한 줄기 세포에 대한 더 구체적인 마커가 발견됨에 wholemounts는 신경 줄기 세포의 행동을 식별하고 분석의 중요한 부분이 될 것입니다.

측면 뇌실 벽의 Wholemounts도 ependymal 세포의 평면 극성을 공부하고 이상적인 관점을 제공합니다. Ependymal 세포는 조정 방식으로 CSF를 추진하기 위해 함수 심실을 안감 multiciliated 세포 수 있습니다. wholemount 기술과 함께, 전체 ependymal 상피는 엉 - 얼굴을 노출하고 사후하고 복부 등의 경계에 스테인드하고 앞쪽에에서 종합적으로 연구하실 수 있습니다. 또한, ependymal 흐름 assays가 심하게 해부에 수행, 라이브 wholemounts는 견고 ependymal 속눈썹에 의해 생성되는 평면 편광 흐름을 보여줍니다. wholemount 접근법을 사용하는 최근의 작품이 ependymal 평면 극성 5 determinants 세포를 발견했다. 흥미롭게도, wholemount 연구는 ependymal 생성된 CSF의 흐름 SVZ 7 젊은 뉴런의 마이 그 레이션 가이드 chemorepellents의 그라디언트를 설립 것을 제안했습니다. 처음에는 철새의 연결 고리의 네트워크를 확인 Wholemount 접근 따라서 체인 마이 그 레이션을 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 계속됩니다.

wholemount 영상으로 VZ과 SVZ 분석 모두 미래 연구와 기존 연구에 대한 우리의 이해를 명확히하는 방법에 대한 새로운 접근법을 추가합니다. 예를 들어, 최근 연구는 성인 SVZ에서 신경 줄기 세포는 뇌실 8 접촉 CD133 + / CD24 - 세포다고 제안했습니다. 섹션에서 immunostaining을 바탕으로,이 작가는 이러한 세포가 multiciliated ependymal 세포의 subpopulation다고 주장했다. 그러나, 전체 ependymal 상피의보다 포괄적인 전망을 제공 wholemount 접근법을 사용하여 우리의 연구에서, 우리는 발견 모든 ependymal 세포 표현 CD24 및 유일한 뇌실 - 접촉 타입 B1의 일부는 + / CD24 -되었습니다 CD133되었습니다 세포를 세포 4. 또한, wholemount 기술은 성인 뇌의 9 신경 줄기 세포의 최근 설명 모자이크 조직 검사 향후 연구에 도움이 될 것을 약속드립니다. 몇몇 연구는 성인 두뇌의 신경 줄기 세포가 균질 인구 아니라는 것을 보여주지만, 지역 지정 및 일반적으로 후각 망울의 interneurons의 특정 subtypes을 생산합니다. 이러한 연구는 신경 줄기 세포의 다른 subpopulations이 특정 전사 요인 10,11,12,13,14 및 / 표현하거나의 지느러미 - 복부와 앞쪽에 - 사후 extents 함께 자신의 지역 로컬 라이제이션을 통해 구분할 수있다 것을 제안 측면 벽 9,15,16. 성인 신경 줄기 세포의 지역 지정 subpopulations 더 많은 분자 마커가 발견됨에 wholemount 영상은 심실 벽을 따라 각 시조 도메인의 parcelation 종합 전망을 제공해야합니다.

wholemount 해부 여기에 제시 이미징 기술은 또한 배아에있는 심실 벽을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 배아 측면 벽의 해부는 같은 방식으로, 단계별, 수행됩니다. 난이도에서만 약간의 차이가있다; 배아 심실은 절개가 쉽게 비교적 큰지만, 조직은 조작이 더 어렵게 부드럽고입니다. 특히, 측면 뇌실과 비슷한 노출 엠브리에서 사용할 수OS는 대뇌 피질의 neurogenesis을 공부하는 뇌실의 대뇌 피질의 장벽을 해부하다 수 있습니다. 최근 증거들은 비대칭 centrosome 상속 피질 neurogenesis 17시 심실 표면에서 요골 glia을 유지 제안합니다. 요골 glial 혀끝의 표면 엉 - 얼굴 영상이 나누어 세포 내에서 centrosomes가 불균형 상속하는 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

특히 대부분의 기술, 정확한 손재주는 관련된 사람과 마찬가지로 숙달 연습이 필요합니다. 더 나은 결과를 핵심 해부 몇 요소, 그러나,있다 : 1) 조명은 그림자를 만들 수있는 샘플의 조명을 조절하면 같은 포셉를 사용하여) 그렇지 않으면, 2 비교적 균질는 조직의 절개하는 동안 귀중한 콘트라스트를 제공합니다 이 기법에서 두 곤충 핀 포셉 함께 비틀거나 조직을 데리러 사용하지 않습니다하지만), 부드러운 철회의 균형을 3 절단하고 칼을 절단하지 말아야하는 동안 조직을 안정화시키기 위해 지속적으로 재조정 수있는 기동성 핀으로 사용됩니다 단 줄일뿐만 아니라이 절개의 대다수가 실제로에만 간헐적으로 절단과 부드러운 철회를 통해 수행되는 기억, 중간과 측면 벽을 분리하기 위해 부드러운 철회를 제공하는 데 사용됩니다.

Acknowledgments

NIH 그랜트 HD - 32116, 재단, 존 보스 줄기 세포 기금, MEXT, MHLW 및 HFSP를 지원하는 샌들러 가족 지원 작업. ZM는 카를로스 Baldoceda 재단과 UCSF Krevans 원정대에 의해 지원. AA - B. 헤더와 멜라니는 둘러 싸인 의자를 혼란 보유하고 있습니다.

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Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름
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Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

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