Summary
Denna metod gör det möjligt reproducerbara kryostat sektionering av små, svåra att hantera, vävnad bitar, t ex biopsier och skivor hjärnan. Vi använder ett enkelt steg aluminium frysning för att underlätta hanteringen av vävnad och en standard kryostat att rutinmässigt producera 5-10 micron seriella delar från 400 mikron tjocka hjärnan skivor.
Abstract
Många undersökningar inom neurovetenskap, liksom andra discipliner, involvera studera små, men ändå makroskopiska bitar eller delar av vävnad som har bevarats, nyligen bort, eller exciderad men höll livskraftiga som i bit beredningar av hjärnvävnad. Efterföljande mikroskopiska studier av detta material kan vara en utmaning, eftersom vävnadsprover kan vara svårt att hantera. Visade här är en metod för att få tunna kryostatsnitt av vävnad med en tjocklek som kan variera från 0,2 till 5,0 mm. Vi skär rutinmässigt 400 mikron tjocka skivor Vibratome hjärnan seriellt till 5-10 mikron coronal kryostatsnitt. De skivor som vanligtvis först används för elektrofysiologi experiment och sedan kräver mikroskopisk analys av cytoarchitecture i regionen där inspelningarna observerades. Vi har konstruerat en enkel anordning som möjliggör kontrollerade och reproducerbara förberedelse och placering av vävnad skiva. Denna enhet består av en cylinder 5 cm i längd med en diameter på 1,2 cm, vilket fungerar som en frysning steg för segmentet. En ring glider tätt över cylindern ger väggarna runt segmentet gör att vävnaden att vara nedsänkt i frysning förening (t.ex. oktober). Detta är sedan snabbt fryses med krossad torris och den resulterande rån kan vara läge lätt för kryostat snittning. Tunna sektioner kan tina-monteras på bestruket diabilder att tillåta ytterligare studier som skall utföras, såsom olika färgning metoder, in situ hybridisering, eller immunohistokemi, vilket visas här.
Protocol
- Förbered mögel från tejp för oktober plattform.
- Fyll formen med oktober Frysning inom kryostat eller genom att använda krossad torris.
- Ta bort tejpen runt frysta oktober plattform.
- Passa märken på frysning chuck och kryostat montering scen och lås i Chuck.
- Sektion genom oktober plattformen tills ytan är platt.
- Ta bort återuppstod oktober plattform och plats på kryostat frysning scenen.
- Placera vävnadsprov (tidigare frysförvarade med 30% glycerol eller sackaros i PBS) i oktober
- Förbered frysning kolumn med ytterring utskjutande ca 5 mm ovanför toppen av kolonnen bildar bra för oktober
- Sätt försiktigt vävnadsprov på mitten av frysning kolumn ytan och långsamt lägga oktober tills väl är fylld.
- Surround frysning kolumn med krossad torris. Vävnad och oktober bör helt frysning inom 20-60 sekunder.
- Som förberedelse ökar i temperatur kan den yttre ringen tas bort medan provet är fryst.
- Skjut urval av frysning kolumn åt sidan och placera i kryostat.
- Placera droppe oktober på ytan av oktober plattform och ställning prov (vävnad ned) tillämpar fast tryck. Exemplar kommer snabbt frysa på oktober plattform.
- Säkra chuck på kryostat montering scenen med justerade märken.
- Sektion genom oktober ytliga till vävnadsprov.
- Tina montera tunna sektioner på glasskivor och lagra frysta eller i rumstemperatur.
- Immunreaktioner kan utföras för vävnad monterad på glas diabilder.
- Reagens sammanställda på bild kan vara lätt upprörd, och kan omfattas om ljuskänsliga.
- Senare skeden av reaktionen är enkelt genom att vända glida in avfall kärl, fuktspridande bilden, och sedan tillämpa nästa reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här ger forskare med en kortfattad och lätt att följa konturerna av hur man kan få tunna kryostatsnitt av små, svåra att hantera, vävnad bitar, t ex biopsier och skivor hjärnan för vidare studier som ska utföras, t.ex. olika färgning metoder, in situ hybridisering, eller immunohistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M.
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
