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Biology

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

doi: 10.3791/1943 Published: May 6, 2010

Summary

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, "makromolekularen" (~ 4 nm) Auflösung.

Abstract

Während ein Großteil ist bereits über die grundlegenden Stoffwechsel der bakteriellen Zellen bekannt sind, sind viele grundlegende Fragen immer noch unbeantwortet überraschend, darunter zum Beispiel, wie sie zu erzeugen und zu pflegen bestimmten Zelle Formen, zu etablieren Polarität, trennen ihre Genome und dividieren. Um diese Phänomene zu verstehen, sind bildgebende Verfahren erforderlich, die Brücke die Auflösung zwischen Fluoreszenz-Lichtmikroskopie und mit höherer Auflösung Methoden wie Röntgen-Kristallographie und NMR-Spektroskopie.

Electron cryotomography (ECT) ist eine aufstrebende Technologie, die genau dies tut, so dass die Ultrastruktur von Zellen zu sein in einer nahezu nativen Zustand visualisiert, in drei Dimensionen (3D), mit "makromolekularen" Auflösung (~ 4 nm). 1, 2 In ECT, Zellen sind in eine glasartige abgebildet, "frozen-hydratisiert" Zustand in einem Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (CryoTEM) bei niedriger Temperatur (<-180 ° C). Für schlanke Zellen (bis zu ~ 500 nm Dicke 3), sind intakte Zellen stürzen eingefroren in Medien über EM-Gitter in Kryogenen wie Ethan oder Ethan / Propan-Mischungen. Dickere Zellen und Biofilme können auch in einem glasartigen Zustand, indem Sie zuerst "Hochdruck-freezing" und dann abgebildet werden, "Kryo-Schnitte" sie. Eine Reihe von zweidimensionalen Projektion Bilder werden dann durch die Probe gesammelt, wie es ist schrittweise entlang einer oder zwei Achsen gekippt. Eine dreidimensionale Rekonstruktion oder "Tomogramm" kann dann aus den Bildern berechnet werden. Während ECT erfordert teure Geräte, in den letzten Jahren hat es in ein paar Labors verwendet worden, um die Strukturen der verschiedenen externen Anhängsel zu offenbaren, die Strukturen der verschiedenen Zell-Umschläge, die Positionen und Strukturen der Filamente des Zytoskeletts und die Orte und Architekturen von großen makromolekularen Baugruppen wie Flagellen Motoren, Innenfächer und Chemorezeptor Arrays. 1, 2

In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie Bild-Zellen mit ECT, einschließlich der Prozesse der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Tomogramm Rekonstruktion und Interpretation der Ergebnisse durch Segmentierung und in einigen Fällen Korrelation mit der Lichtmikroskopie.

Protocol

I. Vorbereitung der bakteriellen Zellkultur

  1. Wachsen die bakteriellen Zellen in ihrer normalen Medien auf die gewünschte Phase in ein paar ml Flüssigkeit Kultur. Wenn höhere Konzentration erforderlich ist, Spinn-und Resuspension in frischem Medium übernommen werden kann, sondern sich bewusst sein, dass dieser Prozess manchmal bringt strukturelle Veränderungen in den Zellen.
  2. Überprüfen Sie in dem Lichtmikroskop um sicherzustellen, dass die Kultur ist frei von Schadstoffen und zu einem angemessenen Zusammenfluss.
  3. Einige Bakterienzellen können Stick oder sogar wachsen auf den EM-Gitter. Wenn wachsenden Zellen auf Gittern, gold Gitter mit einem Kohlenstoff-Schicht werden häufig verwendet, um die Toxizität für die Zellen zu vermeiden. Sie sollten leuchten für 2 Minuten entladen, sterilisiert unter UV-Licht für 15 Minuten, und legte direkt in die Flüssigkeit Kultur. Adhärenten Zellen wird natürlich mit dem Netz-Stick, und andere können aufgefordert werden, in das Netz durch die Beschichtung haften die Gitter in 0,1% Poly-L-Lysin erste sein. Überprüfen Sie die Netze in dem Lichtmikroskop ersten sicherzustellen, dass die Konzentration von Zellen vor dem Einfrieren geeignet.

II. Tauchen Sie ein Einfrieren dünne Zellen

Für dünne Bakterienzellen wird die Suspension von intakten Zellen stürzen über eine EM Grid eingefroren. Der Prozess bewahrt die ultra-Struktur der Bakterienzellen und Verdunstung von Wasser in das Hochvakuum des EM später zu verhindern. Es kann entweder mit maßgeschneiderten stürzen Gefriergeräte getan werden, oder wie wir hier zeigen, mit einer handelsüblichen automatischen stürzen Gefrierschrank, FEI Vitrobot MKIII. 4

  1. Glimmentladung der Kohlenstoff beschichtet EM Grid für 2 bis 4 Minuten. Das macht die Oberfläche des Gitters hydrophilen und hilft so, gleichmäßig verteilt die Probe über den gesamten Netz.
  2. Mix 100 &mgr; kolloidalem Gold Lösung (Teilchendurchmesser von 10 nm) mit 25 &mgr; l einer 5% igen konzentrierten BSA-Lösung. Die BSA beschichtet die Goldpartikel und dies verhindert deren Aggregation.
  3. Zentrifugieren Sie die BSA und Goldpartikel Mischung bei 18000g für 15 Minuten. Nach Entfernen des Überstandes wird das verbleibende Gold Pellet mit 20 ul Zell-Lösung gemischt. Die BSA behandelt Goldpartikel nicht mit den Zellen reagieren, aber sie werden als Fiducial Markers für die Rekonstruktion der Schnittbilder erforderlich sein.
  4. Bewerben 4 ul der Zelle und Goldlösung Mischung auf die Glut entladen EM Gitter im Vitrobot bei 100% Luftfeuchtigkeit. Das Gitter wird dann automatisch ausgelöscht von beiden Seiten mit Nr. 1 Filterpapier. Dadurch wird überschüssige Flüssigkeit, so dass nur ein dünner Film von Zellen in ihren Medien bleibt. Das Gitter wird dann schnell in ein flüssiges Gemisch von Ethan und Propan, die auf ca. 77K mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird gestürzt. Während dieses Prozesses wird die Probe so schnell, dass die Bildung von Eiskristallen in dünnen Schichten <1 um verhindert eingefroren.
  5. Entfernen Sie vorsichtig das Gitter aus dem Ethan / Propan-Gemisch und schnell in ein Raster Aufbewahrungsbox, dass unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt wird übertragen.

III. High Pressure Freezing und Cryo Sectioning der Dickere Cells

Bei dickeren Zellen, Hochdruck Einfrieren Eiskristallisation reduziert und die anschließende Kryo Schneiden macht Proben dünn genug für EM Bildgebung. 5, 6, 7 Es gibt viele verschiedene Probenhalter für Hochdruck-Gefrieren, wird Ihre Auswahl auf die Probe ab, die Art der Einfrieren Maschine oder das investigative Anwendung ausgewählt. Hier verwenden wir Bal-Tec HPM 010 Hochdruck-Gefrier-und Kryo-Ultra-Mikrotom Modell UC6/FC6 von Leica Microsystems.

  1. Für Bakterien ist 15mls spinner Kultur OD> 0,5 direkt aus dem 37 ° C Inkubator genommen und zentrifugiert bei 1000rpm für 3 Minuten. Nach dem Entfernen Überstand, Mix 0,5 ml der restlichen Kultur Pellet mit 0,5 ml 20% Dextran Gefrierschutzmittel und dann bei 13000rpm Zentrifuge für 15 Sekunden.
  2. Nach dem Entfernen Überstand, Pipette 0,1 ml der Super-Pellet in heißgesiegelten Mikropipette Spitze, die bereits 0,2 ml 20% Dextran cryoprotecant (40000Mwt) einfügen. Zentrifugieren Sie die Mischung in der Mikropipette Spitze bei 13000 rpm für 30 Sekunden und entfernen Überstand. A 5-10 ul engen Pellet wird an der geschlossenen Spitze gesehen.
  3. Ein "Teflon" beschichtete Messing-Kuppel planchet fertig montiert in der Hochdruck-Gefrier Haltearm erhält die Paste in eine Hälfte-Kuppel und ist mit seinem flachen Partner Brass Hat besiegelt.
  4. Der Arm der Montage wird dann umgehend in die grundierte Hochdruck Gefrierschrank bereit zum Einfrieren eingelegt.
  5. Bei 2100 bar Druck der kombinierten Messing planchet Einheit mit den Zellen wird schnell durch eine Düse mit hohem Druck in flüssigem Stickstoff gekühlt, das Entfernen der Armbaugruppe sofort und Eintauchen in ein Bad aus flüssigem Stickstoff verhindert die Planchette von Erwärmung.
  6. Planchet Einheiten sind unter flüssigem Stickstoff gelagert werden, bis für Kryo-Schnitte erforderlich.
  7. Zur Freilegung der gut eingefroren Kuppel von Zellen für das Schneiden, sind die beiden Messing Planchetten sorgfältig unde getrenntr flüssigem Stickstoff.
  8. Die perfekt eingefroren Kuppel der Zellen ist glasig, frei von Rissen und Eisnukleation Fissuren.
  9. Diese Planchette ist es, eine vorgekühlte -170 ° C überführt und montiert sicher auf dem Kryo-Mikrotom Vize-like chuck.
  10. Das abgekühlte cryomicrotome enthält essentielle cryotools notwendig für das Schneiden, umfassen diese: a low angle Kryo-Diamant-Messer, ein Diamant Abrichtwerkzeug, drücken Plattform, Grid-Storage-Box, ein Anti-Statik-Spray-Einheit und einem Raster Haltevorrichtung.
  11. Für eine erfolgreiche Band Schneiden einer äußeren Kuppel Region ist zunächst so geformt, dass <0,2 mm Platz, der von der Diamant-Werkzeuge zum Beschneiden und eine schnelle Schnittgeschwindigkeit unter Beibehaltung der ~ 200 um Tiefe von gut eingefroren Umfang.
  12. Mit dem Antistatik-Spray auf dem niedrigen Winkel Messer und Kupfer Auflageroste in unmittelbarer Nähe gerichtet, ist der Diamant Messer sorgfältig avancierte zum poliert Block Gesicht vorbereitet zum Schneiden.
  13. Mikrotom-Parameter sind so gewählt, wie eine Schnittdicke Einstellung zwischen 50 bis 350 nm, zusammen mit einer Schnittgeschwindigkeit von ~ 0.4mm/sec und schmalen Schnitt Fenster. Es ist wichtig, die Antistatikspray Umfang und Intensität zu niedriger Luftfeuchtigkeit in der unmittelbaren Umgebung zu kontrollieren.
  14. Als die ersten Abschnitte hergestellt werden, eine feine Wimpern-Applikator wird von Hand oder Mikromanipulator manövriert bis in die frühen Abschnitte Abrutschen der low angle Diamant Messers Schneide Haken.
  15. Während die Band Abschnitte vom Messer gezwungen, sie sind leicht durch eine Wimper Sonde unterstützt und angeleitet durch die Kupfer-Grid-Unterstützung in der Nähe.
  16. Um Stick den Abschnitten, das Netz mit Bändern geladen wird dann fest gedrückt mit einer gekühlten poliertem Silber-Sonde, sind einige Abschnitte so hoch aufgeladenen die neuesten antistatische Geräte können in die Haftung zu unterstützen.
  17. Grid-Boxen sind für die langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gekühlt trocken Verlader gehalten, bis das Mikroskop ist bereit für Netz übertragen.

IV. Untersuchen Sie die Zellen mit Hilfe der Kryo-Licht Mikroskop

Die Bakterienzellen in der Startaufstellung kann abgebildet mit der Kryo-Lichtmikroskop (cryoLM) werden. Das Mikroskop wir hier verwenden, ist ein Brauch Nikon inverse Mikroskop Ti E / B mit extra langem Arbeitsabstand (ELWD) 60x Luft Objektiv. Die Gitter sind in einer Kryo Bühne während der Bildgebung, die eine modifizierte FEI Kryo Bühne für Lichtmikroskop gehalten wird. Mit einem finder Netz, können die Zellen in der Startaufstellung Plätze befinden und die cryoLM Bilder, um die cryoEM Tomogramme korreliert werden.

  1. Laden Netze in Kartuschen auf Kryo-Station. Die Patronen sind speziell aus unserem Standard-EM-Kartusche für den FEI TF30H-Polara geändert. Das Gitter ist unten durch Kupfer-Clip-Ringe statt. Die Patrone ist dann in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff für die Übertragung gehalten.
  2. Kühlen Sie die Kryo Bühne auf der Temperatur flüssigen Stickstoffs (-190 ° C).
  3. Legen Sie die Patrone in den Kryo-Bühne und bewegen das Netz in das Sichtfenster. Die Bühne kann bis zu zwei benutzerdefinierte modifizierten Patronen.
  4. Senken Sie die Kondensorlinse und fokussieren die 60x Objektiv auf Raster.
  5. Finden Sie die Zellen und nehmen Bilder. Für korreliert LM und EM-Studie wird das Gitter um den Bereich der Zellen durchsucht, für die Lokalisierung der Zellen später in EM.
  6. Nach der Bebilderung des Gitters, setzen Sie die Patrone wieder in die Röhre und halten den Schlauch in flüssigem Stickstoff bis zu seiner in EM abgebildet werden.

V. Sammeln Tilt Series in der Cryo TEM

Um ein 3D-Tomogramm der Bakterienzelle, sind eine Reihe von Projektionsbilder genommen, während die Probe schrittweise entlang einer oder zwei Achsen in der Kryo-TEM gekippt. Angesichts der Neigungswinkel und andere experimentelle Einstellungen, gibt es verschiedene Software zur automatischen Erfassung der Neigung Serie. Wir verwenden für unsere Leginon Kryo TEM die FEI TF30H-Polara ist. Es ermöglicht die automatische Aufnahme Kippserie der vorgewählten Zellen. 8

  1. Legen Sie die Patronen in die Multi-Auswahl Halter (MSH) auf die vorgekühlte Kryo-Station. Die MSH kann bis zu 6 Patronen.
  2. Schließen Sie die MSH die TF30H-Polara, pick one Kartusche und setzen Sie sie in der EM-Spalte.
  3. Starten Leginon-Client auf dem EM-Computer und Leginon Hauptprogramm auf der anderen Workstation.
  4. Richten Sie Presets (Bild Bedingungen) für einen Leginon Sitzung. Die wichtigsten Parameter sind die Vergrößerung, die unter Fokus-Wert, das Elektron Dosis und der Neigungswinkel für Kipp-Serie, einschließlich Startwinkel, Endwinkel und Schritten.
  5. Pick-Ziele auf Bildern ausgehend von der niedrigsten Vergrößerung und schickt sie zum nächsten Schritt mit höherer Vergrößerung.
  6. Queue, alle Ziele für Kipp-Serie Sammlung und legt sie alle auf die letzte "Tomographie" Schritt.
  7. Der Prozess der Datenerhebung kann über das Web-Tool von einem lokalen Arbeitsplatz überwacht werden.
  8. Nach der experimentellen Datenerhebung erfolgt, untenLaden Sie die fertig Kipp-Serie auf eine lokale Arbeitsstation für den Wiederaufbau.

VI. Biosafety Überlegungen

Die meisten der biologischen Proben mit denen wir arbeiten sind nicht pathogen und wurden aus dem Boden, Leitungswasser oder den Darm der Insekten isoliert worden. Grundlegende aseptischen Bedingungen ist ausreichend für die Behandlung dieser Proben. Arbeiten mit Krankheitserregern erfordert die Implementierung von zusätzlichen Sicherheits-Schritte, aber für extreme Gefahren, einige Labors haben ganze Kryo-EM-Mikroskope im BSL-3-Labors installiert. Im Folgenden sind einige der Möglichkeiten, wie wir das Risiko im Umgang mit Krankheitserregern in unserem Labor reduziert haben.

  1. Die Pathogenität von einer Probe kann abgeschwächt werden entweder chemisch oder gentechnisch. Viele Labors tun Kryo-EM von Viren haben sie mit chemischen Fixiermittel vor Sprung Einfrieren inaktiviert. Als Alternative können wichtige Mutationen eingeführt, machen die Proben nicht-infektiösen, darunter zum Beispiel inaktivierende Punktmutationen in bestimmten Enzymen oder Ausschlagen Rezeptoren werden.
  2. Persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille getragen werden.
  3. Gefährliche Proben können in einem Biosicherheitswerkbank (BSC) behandelt werden. Bakterienkulturen können gewachsen, konzentriert zu sein, und sogar auf EM-Gitter in der BSC stürzen eingefroren. Wir haben eine kleinere, manuelle Sprung-freezing-Gerät, das in unsere BSC passt für diesen Zweck. Wenn die größere Konsistenz durch automatische Sprung-und Gefriergeräte angeboten wird benötigt, können sie entweder in die BSC eingeführt werden, oder, einfacher, in einigen Fällen haben wir die Schreibunterlagen unserer Vitrobot mit Alufolie gesichert, um eine Verunreinigung des Geräts zu verhindern. Beim Arbeiten mit einer BSC, da viele der Werkzeuge und Materialien wie möglich gehen in die oder aus dem Schrank sollte mit 70% Ethanol desinfiziert werden. Bei der Vorbereitung unserer Netze, verwenden wir kleine Mengen von einer bakteriellen oder viralen Kultur (in der Regel 4 ul), von denen die meisten durch das Whatman-Papier abgetupft wird. Das Löschpapier, Pipettenspitzen, und die verbleibenden Kultur sind als biologisch entsorgt. Alle Werkzeuge und exponierten Flächen werden mit verdünnter Chlorbleiche, 95% Ethanol und dann mit Wasser zu desinfizieren.
  4. Sobald das Gitter eingefroren sind, sind sie bei Temperaturen des flüssigen Stickstoffs im gesamten Storage-und Datenmanagement Sammlung. Es hat sich gezeigt, dass Zellen überleben können, Einfrieren und Auftauen dann, wenn, so dass wir sie weiterhin als gefährlich im gesamten Storage-und Datenmanagement-Sammlung zu behandeln. Am Ende der Datenerhebung sind Kartuschen mit gefrorenen Netze aus dem Kryo-TEM entfernt und fiel direkt in 70% igem Alkohol. Obwohl dies selten ist darauf hinzuweisen, dass manchmal Gitter sind "fallen gelassen" innerhalb der Säule, und die Folgen eines solchen Ereignisses ist für jeden gefährlichen Probe in Betracht gezogen werden. Die meisten von dem Mikroskop bei Raumtemperatur, so dass die Probe auf einem Raster fallen würden wahrscheinlich innerhalb der Säule auftauen und sich vollständig in die Ultrahochvakuum der EM ausgetrocknet. Dies würde natürlich zu inaktivieren einige biologische Proben, aber vielleicht nicht robust Viren und die vertrockneten Reste der Probe könnte als Aerosole, wenn das Mikroskop Spalte nächste ist für den Dienst geöffnet freigegeben werden.

VII. Tomogramm Wiederaufbau

Die Schichtaufnahmen des Bakterienzellen werden durch Software rekonstruiert. Es gibt verschiedene Software für diesen Job. Wir verwenden Raptor für automatische Rekonstruktion und Screening-Tomogramme. 9 Wie automatisierten Kippserie Ausrichtung und anschließende Rekonstruktion ist eine nicht-triviale Aufgabe, Raptor derzeit nicht über eine Erfolgsquote von 100%. Im Falle von Raptor Ausfall oder die Notwendigkeit für eine qualitativ hochwertige Rekonstruktion verwenden wir manuelle Bildausrichtung und Rekonstruktion mit eTomo in der IMOD Tomographie-Software-Suite. 10, 11

  1. Laden Sie jede einzelne Kippserie aus dem lokalen Leginon Webserver. Speichern Sie sie in einem Verzeichnis, wo sie leicht lokalisiert werden können.
  2. Manuelles Überprüfen Sie die Kippserie mit IMOD ist 3dmod Betrachter und entsorgen Sie diese, wenn Leginon ausgefallen Tracking das Ziel oder die Herstellung eines nützlichen Kippserie.
  3. Wir betreiben Raptor über den Linux-Maschinen im Labor verteilt über Peach (a Pearl-basiertes System, um Aufgaben über ein Netzwerk zu verteilen). Wir geben die Größe unserer Fiducial Markers, dh die kolloidalen Goldpartikel, die Anzahl der Marker für den Wiederaufbau verwendet werden, die Pixel-Größe, die gewünschte Dicke des Wiederaufbaus, die Binning-Faktor und eine Reihe von grundlegenden Einstellungen (z. B. Eingang, Ausgangspfade und Output-Format) auf der Kommandozeile und lassen Sie ihn laufen, in der Regel 20min bis 2h für eine 122-image-Datensatz (2k durch 2k). Wenn mit der Rekonstruktion Ergebnis zufrieden sind, können Sie die folgenden Schritte in diesem Abschnitt übersprungen werden.
  4. Wenn die manuelle Rekonstruktion benötigt wird, Umbenennen von Dateien aus. "MRC" in ". St" und laden Sie individuelle Kippserie in die eTomo GUI in der IMOD Tomographie suite.
  5. Geben Sie Kippserie Achstyp (Single-oder Dual-Achse), und geben Sie die Passermarken-Größe in sa verwendetmple Vorbereitung. Scan des Datei-Headers auf Pixelgröße zu bestimmen, und gehen Sie durch Klick auf "Create Com scripts".
  6. Befolgen Sie die Schritte der einzelnen Register in den eTomo GUI zur Tomogramm vom Kippserie rekonstruieren. Inspizieren und überprüfen das Ergebnis nach jedem Schritt, und wenn sie nicht erfüllt, können wir immer wieder auf jeder vorherigen Schritt und Wiederaufbereitung von dort aus. "Pre-processing" wird auf vorbereitende Verarbeitung und Entfernen von ungewöhnlich hoher Intensität Pixel X-Strahlen verursacht. "Grob Ausrichtung" erzeugt eine Neigung Serie, wobei jede nachfolgende Projektionsbild in der Neigung Serie zum vorherigen durch Kreuzkorrelation ausgerichtet. Wir definieren die Goldperlen als Passermarken in "Fiducial Modell Generation" zu verwenden, und das Programm verfolgt die Fiducial Markers in jedes Projektionsbild und baut "Fine Alignment". "Tomogramm Positionierung" ermöglicht das Abschneiden der Tomogramm in Z. "Final Aligned Stack" erzeugt wird durch lineare Interpolation, und Funktionen wie CTF-Korrektur, Gold-Eraser-und 2D-Filterung kann optional eingesetzt werden. Das Tomogramm ist in "Generate Tomogramm" durch gewichtete Rückprojektion im Fourier-Raum berechnet. "Post-Processing" ermöglicht Zuschneiden der Tomogramm der XY-region of interest und Skalierung der Kontrast im Bereich der Strukturen von Interesse, und "Clean Up" löscht die temporären Dateien und gibt den Speicherplatz.

VIII. Die Lagerung der Tomogramme in Database

Wir verwenden eine webbasierte Inhouse-Datenbank zu organisieren, zu speichern, suchen und verteilen die tomographischen Daten. Für jede Neigung Serie können wir erfassen Probe Einzelheiten Mikroskop Sammlung Parameter, roh Kippserie sowie die damit verbundenen 3D-Rekonstruktion und weitere Verarbeitung von Dateien. Die wichtigsten Browser zeigt eine Miniaturansicht und ein featured "YouTube" wie Film für jedes Tomogramm, und die Einträge können per Download Frequenz, Schöpfer, Art der Probe oder Datum sortiert werden. Benutzer können die Datenbank durch Eingabe von Stichwörtern oder Besonderheiten suchen. Derzeit sind mehr als 4.500 tomographischen Kippserie in der Datenbank hinterlegt, die nahezu 60 Arten von Arten / Proben, mit einer Gesamtfläche von mehr als 11.000 zugehörigen Dateien.

IX. Analyse und Segmentierung der Tomogramme

  1. Die konstruktiven Details der Tomogramme können eingesehen und analysiert werden durch verschiedene Software mit Bildverarbeitungs-Tools, zB 3dmod Betrachter IMOD mit ZAP, XYZ und Slicer Fenster.
  2. Der nächste Schritt ist, um eine Segmentierung des 3D-Bildes (Tomogramm) zu schaffen. Eine Segmentierung ordnet jedem Voxel (Volumen-Pixel) des 3D-Bildes ein Etikett beschreiben, auf die Region oder Material das Voxel gehört, z. B. eine Membran oder ein Zytoskelett. Wir verwenden Software-Tools wie 3dmod in IMOD und Amira (Visage Imaging).
  3. Obwohl einige Software-Tools automatische Segmentierung Module (zB Schwelle Segmentierung) bieten sie oft nur für Bilder mit hohem Kontrast zu arbeiten. Die 3D-Bilder von low-dose Elektronen cryotomography abgeleitet haben eine so geringe Unterschied, dass in den meisten Fällen können wir Sie manuell eine Beschriftung jedes Voxel haben.
  4. Die Segmentierung wird in einer separaten Datei gespeichert. Es kann benutzt werden, um eine Oberfläche, bei dem jede Region mit einer anderen Farbe dargestellt wird und angesehen in 3D zu erzeugen.
  5. Die Tomogramme können für weitere Analysen verwendet werden. Zum Beispiel können Template-Matching und die anschließende Berechnung ergeben statistische Informationen der makromolekularen Komplex wie Ribosomen. Subvolume Ausrichtung und Mittelung zeigt Strukturen in einen höheren Kontrast und zeigt feinere Details.

X. Filme machen basierend auf Schichtaufnahmen

Wir machen Filme für jedes Projekt zusammenzufassen und zu einem visuellen Rundgang durch unsere tomographischen Aufnahmen zu geben.

  1. Machen Sie ein Skript von den in den Daten, die wir gerne zeigen und wie Sie diese Funktionen machen würde. Zum Beispiel, in einem typischen Film eines whole-cell-Tomographie-Projekt, beginnen wir, indem eine repräsentative Kippserie Daten und folgen Sie dann mit einem Stück-für-Stück Ansicht der rekonstruierten Tomogramm. Als nächstes zeigen wir eine Segmentierung der wichtigsten Makromoleküle in der Zelle, z. B. ein Flagellen-Motor oder ein Chemorezeptor Komplex oder eine cytosolische Filament. Schließlich schließen wir mit einem Modell zeigt eine idealisierte Interpretation der Makromoleküle wir studieren.
  2. Graphics Darstellung Software wie Amira oder Chimera werden verwendet, um die einzelnen Standbilder des Films zu machen. Wir montieren in der Regel von Filmen aus kürzere Clips, um Änderungen an einzelnen Clips erleichtern.
  3. Verwenden kommerziellen Film-Editing-Software wie Adobe Premiere, die Standbilder in Movieclips, und dann die Videoclips in den endgültigen Film zusammenzusetzen.
  4. Wir haben begonnen, einen Audio-Track, dass der Film erzählt hinzuzufügen. Die Erzählung wirkt wie ein "Film-Legende" und erlaubt dem Publikum auf die Daten präsentiert während des Films zu konzentrieren.

XI. Animation

VisuellStorytelling vermittelt Wissen, ohne dass der komplexe Vokabular der spezifischen Bereichen der Wissenschaft. Schwierige Begriffe werden einfach, wenn durch visuelle Demonstration begleitet. Die Praxis der Darstellung biologischer Ideen mit Karikaturen ist nicht neu. Allerdings nur in den letzten zehn Jahren haben die ausgefeilte Werkzeuge der professionellen 3D-Content-Erstellung gebracht worden, um die Aufgabe der Konstruktion wissenschaftlicher Animationen tragen. Inzwischen gibt es Dutzende von Forschern aktiv übersetzen biologischen Systemen in dynamische 3D-Animationen. Viele schöne Animationen basieren auf präsentierte http://MolecularMovies.org . Diese Site beherbergt auch Tutorials und vertreibt ein freies Toolkit für die Manipulation von Molekülstrukturen in Autodesk Maya. Die Open-Source-3D-Content-Suite Blender, enthält mehrere user-generated PDB Importeure.

Das Verfahren zur Herstellung einer 3D-Animation in der Regel in drei Schritten:

  1. Modeling: Wir verwenden Grafiken Darstellung Software auf Oberflächen in Formate, die in Maya importiert werden können exportiert werden. Diese Flächen sind entweder Segmentierungen aus rekonstruierten Schichtaufnahmen, zum Beispiel, Membranen, Granulat oder Fäden oder Darstellungen der molekularen Oberflächen. Tomogramm Segmentierungen sind in Amira durchgeführt; molekularen Oberflächen sind in Chimera oder VMD generiert. Atomic Darstellungen von Molekülen direkt in Maya von PDB-Dateien importiert werden. Nachdem die Modelle in Maya sind, können sie verändert, vervielfältigt werden, und positioniert als angemessen.
  2. Animieren: Animationen werden traditionell von Hand gebaut, mit der Künstlerin von Hand verlegt sich bewegende Objekte und die Aufnahme einer Reihe von Key-Frames. Neue Fortschritte in der 3D-Grafik-Software erlauben nun die Dynamik zu prozedural generiert werden, über das eingebaute Module und Scripting-APIs.
  3. Rendering: Procedural Dynamik kann überzeugende Animationen der dynamischen biologischen Prozessen, wie z. B. strukturelle self-assembly bieten. Doch aufgrund der Schwierigkeit der realistischen Simulation von biologischen Systemen, sind die meisten 3D-Animationen noch gebaut mit traditionellen Keyframe-Techniken. Sobald die Dynamik in Ordnung sind, können visuelle Anmerkungen, Texturen und Lichteffekte hinzugefügt werden. Schließlich ist die Kamera Weg gewählt und das fertige Animation in einen Film gemacht.

Discussion

Wir zeigen in diesem Video Artikel, wie Sie ECT von Bakterienzellen zu tun. Begrenzt durch Raum und Zeit, wir zeigen nur die allgemeine Protokoll. Mehr Details finden Sie in Zeitungen, im Internet oder andere Informationen von den Herstellern der Geräte und Software-Entwicklern zur Verfügung gestellt und von ECT Forschungsgruppen gefunden werden. Abhängig von den verschiedenen Bakterienarten untersucht, die verwendete Ausrüstung und die strukturellen Interesse in den Zellen, müssen das Protokoll und die experimentellen Parameter getestet und optimiert werden.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health Grants R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 und P01 GM066521 zu GJJ sowie die Howard Hughes Medical Institute, die Beckman Institute am Caltech und Geschenke an Caltech aus den unterstützten Gordon und Betty Moore Foundation und Agouron Institute. MSL wird durch NIH 2R37-A1041239-06A1 an Pamela S. Björkman unterstützt. Leica Microsystems Inc. freundlicherweise zur Verfügung gestellt Videoinhalte von Gefrier-Sammlung. Die repräsentativen Ergebnisse der Treponema primitia wurden gesammelt und von Gavin E. Murphy verarbeitet und veröffentlicht in Molecular Microbiology mit dem Titel "Novel Feinstrukturen der Treponema primitia und ihre Auswirkungen auf die Motilität". (Murphy, G. et al., Mol. Gen. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 0.1% solution
MKIII Vitrobot FEI
Gold colloid solution Sigma-Aldrich G1527-25ml 10 nm
Bovine serum Albumin Invitrogen P2489 10%
Nr 1 Filter paper Whatman, GE Healthcare 1001 055
Dextran Sigma-Aldrich 31389 15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6 Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45 Diatome
Static line II ioniser Diatome
CX100 Dry shipper Taylor-Wharton
MSH loading station Gatan
Ti E/B inverted microscope Nikon Instruments Custom
Cryo LM stage FEI Custom
TF30-polara FEI With UltraCam from Gatan
Amira Visage Imaging

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References

  1. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  2. Li, Z., Jensen, G. J. Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure. Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).
  3. Frank, J. Three-dimensional imaging of biological complexity. J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).
  4. Iancu, C. V. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285-294 (2001).
  6. Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator. J. Microsc. 224, 129-134 (2006).
  7. Pierson, J. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. J. Struct. Biol. 169, (2009).
  8. Suloway, C. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).
  9. Fernando, A. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
  10. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  11. Mastronarde, D. N. Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution. J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).
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Cite this Article

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).More

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).

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