この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。
タンパク質合成は、様々なレベルで制御されている複雑な細胞プロセスです。例えば、グローバルな翻訳は、アミノ酸飢餓や成長因子の撤退などの細胞ストレスの種々の方法によって開始フェーズまたは伸長段階で抑制することができる。また、個々のmRNAの翻訳は、mRNA局在や同種のマイクロRNAの存在によって調整することができる。タンパク質合成の研究は、頻繁に翻訳調節やタンパク質合成に欠陥のメカニズムに光を当てるためにポリリボソーム解析を利用しています。このアッセイでは、mRNA /リボソーム複合体は、真核細胞から単離されている。ショ糖密度勾配は、単一のリボソームまたは一染色体に結合したmRNAからpolyribosomesと呼ばれる複数のリボソームに結合したmRNAを分離します。勾配の分画は、異なるリボソーム集団とそれに関連するmRNAまたはタンパク質の分離と定量化が可能になります。定義された条件の下でmonosomesへpolyribosomesの比率の違いは、翻訳開始または伸長/終了のどちらかに欠陥の可能性を示唆しています。ポリリボソーム画分に存在するmRNAの検討では、個々のmRNAのコホートは、実験条件に変更が翻訳されているかどうかを明らかにすることができます。さらに、リボソームアセンブリも勾配によって分離され、大小のリボソームサブユニットのピークの分析によってモニターすることができる。このビデオでは、我々は、酵母細胞、ショ糖勾配による抽出物の分離や結果の解釈から得られた粗リボソーム抽出物の調製方法を提示する。この手順では、哺乳動物細胞に容易に適応可能である。
ポリリボソームプロファイルから得られる情報は、セルの並進状態に貴重な洞察を提供することができます。さらに、リボソームサブユニット自体のアセンブリの状態は、2を決定することができます。例えば、プロフィール上で右にわずかに肩を持つhalfmersまたは80Sと大きなピークの存在は、結合した40Sが待っている60Sが参加するサブユニットがサブユニットを示しています。伸びのいずれかを追加シクロヘキシミドまたは他のインヒビターの不在下で実験を実行すると、伸びが3に変更されているかどうかを示す流出の速度、分析することができます。分数自体は分数の北部やウェスタンブロッティングによってリボソームサブポピュレーションを持つ特定のmRNAまたはタンパク質の協会のその後の測定用試薬の豊富な情報源です。アクティブリボソームに関連付けられているmRNAの合計プールが関連付けられているマイクロアレイ4または深いシーケンシング解析5を介して決定することができます。蛋白質の関連付けも試薬6を架橋の適当な添加によって安定化させることができる。
哺乳動物細胞からポリリボソーム解析にも安定したポリソームを得るために必要な条件を確立することで見かけの難しさの点で異なるプロトコルとして言及する価値がある。文献に報告されている緩衝液系は、7-10広く可変であるため、溶解バッファーの細胞型に特異的な最適化のための要件があるかもしれません、または、バッファシステムは、作業への高い関心と同じくらい重要ではないことも同様に妥当である新鮮なライセートは、低温で保管。我々の知る限りでは哺乳類のポリソーム形成に影響を与えるパラメータの体系的な評価が報告されていない。
The authors have nothing to disclose.
作者はこのメソッドの最初の基礎のためにジョンウルフォードに感謝、TGKはGM77073によってサポートされているNIH GM057483とAI076245とPRCでサポートされています。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) | |
Fluorinert | Sigma | F9755 | ||
Cycloheximde | Sigma | C-7698 | ||
Heparin | Sigma | H3393 | ||
BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |