Summary
이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.
Abstract
단백질 합성은 여러 수준에서 규제되는 복잡한 세포 과정이다. 예를 들어, 글로벌 번역 같은 아미노산 기아 또는 성장 인자의 탈퇴로 세포 스트레스 다양한 의해 개시 단계 또는 신장 단계에서 저해하실 수 있습니다. 또는, 개별 mRNAs의 번역은 mRNA의 현지화 또는 동족 microRNAs의 존재에 의해 조정할 수 있습니다. 단백질 합성의 연구 자주 번역 규칙 또는 단백질 합성에서 결함의 메카니즘에 대해 설명해 주실 polyribosome 분석을 활용합니다. 이 분석에서 mRNA / ribosome 단지는 진핵 세포에서 격리됩니다. 자당 밀도 기울기는 단일 ribosome 또는 monosome에 바운드 mRNAs에서 polyribosomes으로 알려진 여러 변이에 바운드 mRNAs을 분리합니다. 그라디언트의 분류는 고립과 다른 ribosomal 인구와 관련 mRNAs이나 단백질의 부량 수 있습니다. 정의된 조건 monosomes에 polyribosomes의 비율의 차이는 번역 개시 또는 신장 / 종료 중 하나에 결함을 나타내는 수 있습니다. polyribosome 분수에있는 mRNAs의 시험 개별 mRNAs의 일대는 실험 조건 변화를 번역되고 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 또한, ribosome 조립도 기울기로 구분하는 크고 작은 ribosomal subunit의 봉우리 분석하여 모니터링할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 효모 세포, 자당 기울기에 의해 추출물의 분리 및 결과의 해석에서 원유 ribosomal 추출물의 준비를위한 방법을 제시한다. 이 절차는 포유 동물 세포에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 7~47%의 자당의 그라디언트의 준비
- 그라디언트가 지속 될 수 있도록 사용하기 전에 자당의 그라디언트 한 하루를 준비합니다. 7 % 살균하고 4 50mM NH 4 Club 호텔을 포함 47%의 자당 솔루션, 50mM 트리스 - 아세테이트 산도 7.0과 장총 MgCl 2와 저장 ° C 1.
- 6 그라디언트는 다음과 자당의 농도 각각 48 ML을 할 수있는 7퍼센트 47 %의 자당 주식 솔루션을 혼합하십시오. 1mM의 최종 농도 각 자당 솔루션 DTT를 (1M 주식)을 추가합니다.
최종 농도 7 % 자당 47%의 자당 7% 48 ML 0 17% 36 ML 12 ML 27% 24 ML 24 ML 37% 12 ML 36 ML 47% 0 48 ML - 그라디언트를 부어하기 위해 확보하고 Parafilm와 함께 밀봉하여 20 ML의 주사기에 파스퇴르 피펫을 첨부하거나 긴 바늘을 사용합니다. 1 X 3.5 "polyallomer의 초원 심 분리기 튜브의 바닥에 7 % 자당 7 ML을 추가합니다. 다음 0.3 이상의 튜브 하단 파스퇴르 피펫 팁을 배치하고 더 빨리 pipetting 없다하여 7 % 용액에 따라 17 % 자당 솔루션 7 ML을 추가 7 ML 27%의 각 37% 47 %의 자당 솔루션 ML / 초. 반복. 당신은 혼합을 최소화는 ° C 하룻밤 로터, 병과 함께 4. 스토어 그라디언트를 발생했음을 나타내는 레이어 사이의 명확한 라인을 준수해야합니다 그리고 샘플을 수확하는 데 사용됩니다 튜브.
2. 효모 추출물의 준비
- 0.8-1.0의 OD 600 효모 문화의 125 ML 성장. 100 μg / ML의 최종 농도에 문화 cycloheximide를 추가하고 30 흔들어 ° C를 15 분 동안 계속.
- 한편, 80 μg / ML cycloheximide, 200 μg / ML 헤파린, 0.2 % DEPC, 10 MM 트리스 - HCL 산도 7.5, 0.1M NaCl, 30mM MgCl 2가 포함된 용해 버퍼를 준비합니다. 이 시점부터 얼음에있는 모든 보관하십시오.
- 250 ML의 원심 분리기 병에 문화를 붓고 얼음과 함께 입력합니다. 4 5 분 ° C. 8000 XG (SLA - 1500 로터에 7250 RPM)에서 원심 분리기 얼음 차가운 용해 완충액 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 전송 10 ML과 함께 한 번 펠렛 씻으십시오. 4 3 분 ° C.에 대한 5900 XG (SLA - 600TC 로터에 ~ 6,000 RPM)에서 원심 분리기 1.5mL 튜브에 용해 버퍼, 이전 0.5 ML의 펠렛을 Resuspend 및 냉장, 구운 산성 - 세탁 유리 구슬의 0.5 ML를 추가합니다. 와동 각 간격 사이에 30 초에 대한 얼음 튜브를 냉각 사 30 초 간격에 대한 세포. 1.5 ML 튜브에 용해 버퍼의 또 다른 0.5 ML를 추가합니다. 4 10 분 ° C.에 대한 microcentrifuge의 최대 속도 (Eppendorf 5417R의 microcentrifuge에서 14,000 RPM)에서 원심 분리기 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는 전송합니다. OD 260 / OD 280 비율 (아래의 단계 3.1 참조)를 확인하기 위해 별도의 튜브를 10 μl를 제거합니다. -80에서 보관 추출물 ° C.
3. 포유 동물 세포에서 추출물의 준비
- 자기편 세포 들어, ~ 70 % 합류로 100mm 요리 성장. 당신은 11 ML 기울기 당 하나의 100mm 요리 (전형적인 수율은 ~ 20 OD 260 단위입니다)이 필요합니다. 크거나 작은 기울기 크기에 대한 선형 금액을 크기. 비 점착 성의 세포의 경우, 약 1 X 10 7 세포는 11 ML 기울기마다 필요합니다.
- 이전 용해에, 100 μg / ML에 cycloheximide를 추가합니다. 37 ° C 15 분 알을 품다. 얼음 접시를 전송하고 얼음 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어. 모든 미래의 단계 0-4 ° C.에서 진행 반드시
- 흡인에 의해 PBS의 모든 흔적을 제거 (접시는 얼음의 직각 침대에 유출하자) 1 ML의 용해 버퍼, 긁어 및 Pre - 차게 1.5 ML 튜브로 전송을 추가합니다. 용해 버퍼 구성 요소는 세포 유형과 성장 조건 최적화해야합니다. 좋은 시작 버퍼는 20 MM HEPES - 코, 산도 7.4, 15 MM MgCl 2, 200 MM KCl, 1 % 트리톤 될 X - 100 (V / V), 100 μg / ML cycloheximide, 2 MM DTT, 그리고 / 1 MG ML의 헤파린. 주요 변수는 마그네슘과 칼륨 염화물뿐만 아니라 cytoskeletal 또는 막 바운드 polysomes의 추출을 향상시키기 위해 포함 시키거나 비 이온 세제의 배제의 농도입니다. 두 번 27 게이지 주사 바늘을 통과 또는 B 타입 유봉을 사용하여 다운스의 균질의 50-10 스트로크에 의해 세포를 Lyse. 주사기 또는 균질 화기는 사용하기 전에 미리 차게해야합니다.
- 냉장 microcentrifuge로 5 분 14,000 XG에 스핀. 자당 기울기 (포유 동물 세포에 대해 이것이 X - 100과 헤파린 튼 부족 용해 버퍼에서 만들지만 별도로 1.2와 1.3에 설명된) 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소의 플래시 프리즈 신선한 lysate를 전송합니다. 4. 그라디언트의 원심 분리
- 얼음 polyribosome lysates를 녹여. 물 1 ML에 예약된 10 μL 샘플을 추가하고 분광 광도계로 OD 260 / OD 280 비율을 읽어 lysate에서 핵산의 농도를 결정합니다. 설명한대로 성장 효모 문화 일반적인 수확량은 50 OD 단위입니다.
- 그라디언트의 표면 근처 튜브의 벽, 부드럽게 레이어 그라디언트 위에 lysate 25 OD 260 단위에 대한 배치 끝에있는 피펫을 사용합니다. 에 대한 lysate의 35 ML 기울기 500 μl는 일반적으로로드됩니다. 용해 버퍼는 모든 그라디언트가 동일한 볼륨 로드된 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 재료의 낮은 금액은 더 나은 해상도를 얻을 수 있습니다. 포셉 사용하여 신중하게 스윙 버킷 로터의 버킷에 그라디언트를 낮춥니다.
- 4 4 시간 100,000 XG (Surespin 630 로터에 23,000 RPM)에서 그라디언트를 원심 ° C. 이 프로토콜은 작은 볼륨 그라디언트에 대해 적용할 수 있습니다.
- 전에 4 시간의 스핀의 완료 약 30 분 모델 184 튜브 찌르는에 바늘을 부착합니다. 온라인 Isco 모델에 펜을 부착 UA - 5 흡광도 / 형광 모니터. 흡광도에 전원이 안정 기준이 사전 분석 샘플에 접근할 수 있도록 모니터링합니다. polysome 프로파일 전자 인수 쉽게 차트 레코더 DI - 148U 데이터 수집 장치 (DATAQ 계측기)를 부착하여 얻을 수 있습니다. 프로필은 다음 실시간으로 수집 및 동반 WinDaq 소프트웨어를 사용하여 나중에 해설을 위해 저장할 수 있습니다.
- Fluorinert 역류, 빠른 설정을 사용 50mL와 주사기 펌프를 채우십시오. 현재에는 기포가 없는지 확인합니다. 주사기에서 튜브 찌르는에 호스를 연결하고 간략하게 어떤 공기 방울의 호스를 취소하고 앞으로 방향 3 ML / 분 Fluorinert의 흐름을 켭니다.
- 샘플을 수집하는 흐름 세포의 끝에 호스에 따라 분수를 수집 도망하면 튜브의 폐기물 비커 또는 시리즈를 놓습니다.
- 조심스럽게 원심 회전 날개에서 자당 기울기를 포함하는 polyallomer의 원심 튜브를 제거하고 (교란 그라디언트를 피하기 위해 빈 튜브와 함께 얼음에있는 우물을 미리 양식) 얼음에 그들을 놓으십시오.
- 세포 추출물을 분석하려면, 튜브 찌르는에 그라디언트 튜브를 놓습니다. 콘센트에 튜브의 상단을 연결 및 보안. 바늘이 튜브의 바닥을 피어 있도록 원심 튜브에 아래의 단계를 올립니다. 바늘이 원심 분리기 튜브의 아래쪽으로 돌출되면, 6mL/min에서 앞으로 방향으로 Fluorinert의 흐름을 시작한다.
- Fluorinert가 튜브로 흐르는 시작되면, 온라인 흡광도 모니터에 바늘의 움직임을 모니터링합니다. 일단 바늘 60의 속도 설정으로 차트의 움직임을 설정, 이동하기 시작합니다. 모니터는 40 ribosomal subunit 감지 및 polyribosome 단지까지 계속이어서 자유 자재로 시작 OD 254를 기록합니다. 이 RNA 또는 단백질 분석을위한 분수를 수집하는 경우, 일반적으로 0.2 분 분수 (1 ML) 촬영입니다. RNA의 분석을 위해, 분수가 추출의 기본 방법에 따라 Trizol (Invitrogen), 페놀 또는 SDS / proteinase K를 포함하는 튜브에 직접 수집해야합니다.
- polyribosome 프로필의 끝에 도달했습니다 때, 원심 튜브에 Fluorinert의 흐름을 해제하고 흡광도 / 형광 모니터의 차트 운동을 중지합니다.
- 주사기에 튜브에서 자당을 그릴하지 않도록하고 빠른 속도로 반대 방향으로 흐름을 시작하여 주사기로 원심 튜브에서 Fluorinert을 철회. 튜브 찌르는에서 돌려서 원심 관은 바늘을 낮게하고, 튜브를 제거합니다.
- 반복 각 자당 기울기에 대해 5.8을 통해 5.5 단계를 반복합니다.
- 모든 자당의 그라디언트가 분석되었습니다되면, 주사기로 다시 호스에서 Fluorinert을 철회. 상단에있는 폐기물 호스 포함하여 fractionator의 각 부분을 (튜브 찌르는 및 흐름 세포)를 제거하고 물로 잘 씻어.
5. 데이터 및 분수의 수집
6. 대표 결과
그림 1. ribosome 추출 대표 추적은 cycloheximide의 존재에 효모 변형 BY4741 (매트 his3 Δ Δ 1 leu2 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0)에서 준비했습니다. ribosomal 추출물 7 47%의 자당 기울기를 이용 fractionated되었고 UV 검출기에 연결된 펌프 주사기 장치를 사용하여 분석했다. polyribosomes와 80, 60 및 40 변이를 포함하는 봉우리가 표시됩니다.
Discussion
polyribosome 프로필에서 얻은 정보는 세포의 translational 상태에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, ribosomal subunits 자체의 조립 상태가 2 결정하실 수 있습니다. 예를 들어 halfmers 또는 80 년대와 프로필에 오른쪽으로 약간 어깨와 큰 봉우리의 존재는 바운드 40가 가입 60을 기다리는 subunit subunit 나타냅니다. 어떠한 추가 cycloheximide이나 신장의 다른 억제제의 부재에서 실험을 수행하는 것은 신장이 3 변경할지 여부를 나타냅니다 도망의 속도의 분석을 위해 수 있습니다. 분수 자체는 북부 또는 서양 분수의 모래 바닥으로 ribosomal subpopulations있는 특정 mRNA 또는 단백질의 협회의 후속 결정을위한 시약의 풍부한 원천입니다. 적극적인 변이와 연관된 mRNAs의 총 수영장은 관련 microarray 4 깊은 시퀀싱 분석을 통해 결정 5하실 수 있습니다. 단백질 협회는 또한 시약 6 연결하는 십자가의 적절한 이외의 안정 수 있습니다.
포유 동물 세포에서 Polyribosome 분석도 안정 polysomes를 얻을하는 데 필요한 조건을 확립에 명백한 문제의 관점에서 서로 다른 프로토콜로 언급할 가치가있다. 문헌에 보고된 버퍼 시스템은, 7-10 널리 변동 때문에 용해 버퍼의 셀 타입 특정 최적화에 대한 요구 사항이있을 수도 있고, 그것은 버퍼 시스템 작업에 예민한 관심을만큼 중요하지 않습니다 것을 동등하게 그럴듯 신선한 lysates은 낮은 온도에서 보관. 우리의 지식 포유 동물 polysome 형성에 영향을 미치는 매개 변수의 체계적인 평가는보고되지 않았습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 방법의 초기 기반에 대한 존 울포드을 인정하고 싶습니다, TGK는 NIH GM057483와 AI076245 지원하고 PRC는 GM77073에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
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