Summary
Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.
Abstract
Protein sentezi, birçok düzeyde düzenlenir karmaşık bir hücresel süreçtir. Örneğin, küresel çeviri, amino asit, açlık ya da büyüme faktörü çekilmesi gibi hücresel stresler çeşitli başlatma aşamasında veya uzama fazı inhibe olabilir. Alternatif olarak, bireysel mRNA'ların çeviri mRNA lokalizasyonu veya cognate microRNA varlığı ile düzenlenir. Protein sentezi çalışmaları sık sık çeviri düzenleme ya da protein sentezi hatalarına mekanizmalarına ışık tutacak polyribosome analiz kullanmaktadır. Bu testte, mRNA / ribozom kompleksleri ökaryotik hücreler izole edilir. Bir sakaroz yoğunluk gradiyenti tek bir ribozom veya monosome bağlı mRNA'ların polyribosomes olarak bilinen çok sayıda ribozom bağlı mRNA'ların ayırır. Gradyanlar Fraksiyonu farklı ribozomal nüfus ve ilişkili mRNA'ların veya protein ölçümü ve izolasyon sağlar. Tanımlanmış koşullar altında monosomes polyribosomes oranı farklılıklar çeviri başlangıcı ya da uzama / sonlandırma ya hatalarına göstergesi olabilir. Polyribosome kesirler mRNA'ların Sınav bireysel mRNA'ların kohort deneysel koşullar değişiklik tercüme olmadığını ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, ribozom montaj Eðim ayrılmış küçük ve büyük ribozomal altbirim doruklarına analizi ile izlenebilir. Bu video, maya hücreleri, sukroz gradient özü ayırma ve sonuçların yorumlanması ham ribozomal özler hazırlanması için bir yöntem mevcut. Bu prosedür, memeli hücreleri kolayca uyarlanabilir.
Protocol
1. % 7-47 sakkaroz degradelerin hazırlanması
- Gradyanlar sürekli olmasına izin kullanmadan önce sakaroz gradyanlar bir gün hazırlayın. % 7 steril ve 4, 50mm NH 4 Cl içeren% 47 sakaroz çözümleri, 50mm Tris-asetat pH 7.0 ve 12mm MgCl 2 ve mağaza ° C 1 .
- 6 gradyanlar aşağıdaki sakaroz konsantrasyonu her 48 ml için% 7 ve% 47 sukroz stok çözelti karışımı için. 1mm bir nihai konsantrasyonu her sakaroz çözeltisini DTT (1M stok) ekleyin.
Final Konsantrasyon 7% sakaroz 47% sakaroz % 7 48 ml 0 % 17 36 ml 12 mL % 27 24 ml 24 ml % 37 12 mL 36 ml % 47 0 48 ml - Gradyanlar dökmek için, 20 ml şırınga Parafilm ile güvence altına alınması ve sızdırmazlık Pasteur pipeti eklemek veya uzun bir iğne kullanınız. 1 x 3.5 "polyallomer ultrasantrifüjdeki tüp alt% 7 sakaroz 7 mL ekleyin. Sonraki 7 mL, 0.3 'ün, tüpün alt kısmına yakın Pasteur pipet yerleştirerek ve herhangi bir hızlı pipetleme altında% 17% 7 çözüm sakaroz çözeltisini eklemek 7 mL% 27,% 37 ve% 47 sukroz çözümleri ile ml / sn. tekrarlayın. karıştırma minimum 4 ° C gecede rotorlar, şişe ile birlikte. Mağaza gradyanlar meydana geldiğini belirterek, katmanları arasında net çizgiler dikkat etmelisiniz örnekleri hasat için kullanılacak tüpleri.
2. Maya özü hazırlanması
- 0.8-1.0 bir OD 600 125 ml maya kültürü büyütün. Nihai konsantrasyonu 100 mg / ml kültür Siklohekzimidsiz ekleyin ve 30 sallayarak ° C'de 15 dakika süreyle devam.
- Bu arada, 80 mikrogram / ml sikloheksimid, 200 mg / ml heparin,% 0.2 DEPC, ve 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1M NaCl, 30mm MgCl 2 içeren lizis tamponu hazırlamak. Bu noktadan itibaren buz her şeyi tutun.
- 250 ml santrifüj şişeye kültür dökün ve buz ile doldurun. 5 dakika 4 ° C için 8.000 xg (SLA-1500 rotor 7250 rpm) Santrifüj Pelet buz lizis tamponu ve 15 ml polipropilen tüplere transfer 10 ml ile bir kez yıkayın. 3 dakika 4 ° C 5900 xg (SLA-600TC rotor ~ 6,000 rpm) Santrifüj 1.5mL tüp lizis tamponu, transfer 0,5 mL pelletini tekrar ve soğutulmuş, pişmiş asitle yıkanmış cam boncuklar 0.5 mL ekleyin. Vorteks, 30 sn arasında her aralık buz tüpü soğutma dört 30 sn aralıklarla hücreleri. Lizis tamponu başka bir 0.5 ml 1.5 ml tüp içine ekleyin. Santrifüj bir mikrosantrifüj maksimum hızı (bir Eppendorf 5417R mikrosantrifüj 14.000 rpm) 10 dk 4 ° C Supernatant yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. OD 260 / OD 280 oranı (bkz. aşağıda adım 3.1) belirlemek için ayrı bir tüp 10 ul çıkarın. -80 Mağaza özleri ° C
3. Memeli hücrelerinde alıntılar hazırlanması
- Yapışık hücreler için ~% 70 izdiham 100 mm tabak içinde büyür. 11 ml degrade başına bir 100 mm çanak (tipik verim ~ 20 OD 260 adet) ihtiyacınız olacak. Doğrusal degrade boyutları daha büyük veya daha küçük miktarda Ölçeği. Yapışmaz hücreleri için, 11 ml degrade başına yaklaşık 1 x 10 7 hücreleri ihtiyaç vardır.
- Lizis için, önce 100 mcg / mL Siklohekzimidsiz ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Buz plakaları aktarın ve hücreleri buz PBS içinde iki kez yıkayın. Gelecekteki tüm adımları 0-4 ° C'de yapılan ZORUNLU
- Aspirasyon PBS tüm izlerini silmek (plakalar buz açılı yatakta süzdürülür) ve 1 ml lizis tamponu, kazıma ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer ekleyin. Lizis tampon parçaları, hücre tipi ve büyüme koşulları için optimize edilmiş olması gerekir. Iyi bir başlangıç tampon 20 mM Hepes KOH, pH 7.4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl,% 1 Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml sikloheksimid, 2 mM DTT, 1 mg / ml heparin. Temel değişkenler, magnezyum ve potasyum klorür gibi dahil edilmesi veya çıkarılması sitoskeletal veya membran bağlı polysomes artırmak için non-iyonik deterjan dışlanma konsantrasyonları. 27 gauge şırınga iğnesinin iki kez geçerek ya da B Tipi havaneli kullanarak Dounce homojenizasyon 5-10 darbeleri hücreleri Lyse. Şırınga veya Homojenizatör kullanmadan önce ön soğutulmuş olmalıdır.
- 5 dakika buzdolabında mikrosantrifüj 14.000 xg'de dönerler. Sukroz gradient (memeli hücreleri için bu Triton X-100 ve heparin eksik lizis tamponu yapılır ama başka türlü, 1.2 ve 1.3 'de açıklandığı gibi) ya da daha sonra kullanılmak üzere sıvı azot flaş dondurma taze lizat aktarın. 4. Gradyanlar santrifüj
- Buz üzerinde polyribosome lizatları çözülme. Ayrılmış 10 mcL örnek 1 ml su ekleyerek ve bir spektrofotometre ile OD 260 / OD 280 oranı okuma lizat nükleik asit konsantrasyonu belirleyin. Açıklandığı gibi yetişen bir maya kültürü tipik verim 50 OD adettir.
- Degrade yüzeyine yakın tüp duvar, hafifçe degrade üstüne lizat 25 OD 260 adet tabaka karşı yerleştirilen ucu ile bir pipet kullanarak. Için lizatı 35 mL degrade 500 ul genellikle yüklenir. Lizis tamponu tüm gradyanlar eşit hacimde yüklü sağlamak için kullanılabilir. Düşük miktarda malzeme daha iyi çözünürlük verir. Forseps kullanarak, sallanan bir kova rotor kova içine dikkatlice düşük gradyanlar.
- Xg 100.000 (Surespin 630 rotor 23.000 rpm), 4 saat 4 gradyanlar Santrifüj ° C Bu protokol, küçük hacimli gradyanlar için adapte edilebilir.
- Yaklaşık 30 dakika önce tamamlanması için 4 saat spin Model 184 tüp delici iğne takın. Online Isco Model kalem takın UA-5 Absorbans / Floresan Monitör. Absorbans Güç istikrarlı bir temel analiz örnekleri önce ulaşılması izin izlemek için. Polysome profil Elektronik satın alma grafik kaydedici DI-148U veri toplama ünitesi (DATAQ Araçlar) takarak kolayca elde edilebilir. Profiller daha sonra gerçek zamanlı olarak toplanan ve beraberindeki WinDaq yazılım kullanarak daha sonra ek açıklama için kaydedilmiş olabilir.
- Fluorinert ters akış, hızlı ayarını kullanarak 50ml şırınga pompası doldurun. Hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Şırıngadan tüp delici hortumunu bağlayın ve kısaca, herhangi bir hava kabarcığı hortumu temizlemek için 3 ml / dk ileri yönde Fluorinert akışını açmak.
- Örnek toplamak için akış hücresi sonunda hortumun altında kesirler toplama çalıştırırsanız, tüpler atık beher veya seri yerleştirin.
- Sukroz gradient santrifüj rotor içeren polyallomer santrifüj tüplerine dikkatlice çıkarın ve buz üzerinde (rahatsız edici bir renk geçişlerini önlemek için boş bir tüp ile buz kuyu öncesi form) koyun.
- Hücre özleri analiz etmek, tüp delici degrade tüpü yerleştirin. Tüpün üst prizine bağlayın ve güvenli. Iğne tüpün alt deler ve böylece alt aşamasında santrifüj tüpüne kaldırın. Sonra iğne santrifüj tüpüne dibinden dışarı fırlamıştı, 6mL/min ileri yönde Fluorinert akışı başlar.
- Fluorinert tüp içine akan başladıktan sonra, online absorbans monitör iğne hareketini izlemek. İğnenin taşımak için 60 bir hız ayarı grafik hareketi açmak başlar. 40S ribozomal altbirim polyribosome kompleksleri boyunca devam algılama ve takip serbest malzeme ile başlayan monitör OD 254 kayıt edecektir. RNA veya protein analizi için kesirler toplama ise, tipik olarak 0.2 dakika kesirler (1 ml) alınır. RNA analizi için, kesirler ekstraksiyon tercih edilen yöntem bağlı olarak, doğrudan Trizol (Invitrogen), Fenol veya SDS / proteinaz K içeren tüp içine toplanan olmalıdır.
- Polyribosome profil sonuna ulaşıldığında, Fluorinert, akış santrifüj tüpüne kapatın ve absorbans / floresan monitör grafik hareketi durdurmak.
- Şırıngaya tüp sakaroz çekmek için emin olmak için hızlı bir oranında ters yönde akışını başında şırıngaya santrifüj tüpüne Fluorinert geri çekin. Santrifüj tüpüne sökün tüp delici iğne, alt ve tüp kaldırmak.
- Her sukroz gradient için 5.8 üzerinden 5.5 adımları tekrarlayın.
- Tüm sakaroz gradyanlar analiz edilmiştir, enjektörün içine geri hortum Fluorinert geri çekmek. Parçalama, üst kısmında bulunan atık hortum dahil olmak üzere her bir parçası (tüp delici ve akış hücresi) çıkarın ve su ile iyice durulayın.
5. Veri ve kesirler Toplanması
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 Siklohekzimidsiz varlığı maya suşu BY4741 (mat his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ Δ 0 0 ura3) hazırlanan ribozom özü Temsilcisi iz. Ribozomal özü 7% 47 sukroz gradient kullanan fraksiyone ve UV detektörü bağlı bir pompa şırınga aparatı kullanılarak analiz edildi. Polyribosomes ve 80S, 60S ve 40S ribozom içeren Peaks gösterilir.
Discussion
Polyribosome profilden elde edilen bilgiler, hücre translasyonel durumu içine değerli bilgiler sağlayabilir. Buna ek olarak, ribozomal alt birimden kendilerini montaj durumu 2 tespit edilebilir. Örneğin halfmers veya 80S ve profil üzerinde sağa doğru hafif bir omuz daha büyük zirveleri varlığı bağlı 40S katılmadan 60S bekleyen subunit subunit gösterir. Sahne eklenen Siklohekzimidsiz veya diğer uzama inhibitörü yokluğunda deneme uzama 3 değiştirilmiş olup olmadığını gösterir kaçıp oranı, analiz sağlar. Kesirler kendilerini reaktiflerin kesirler, Kuzey ya da Batı blot ribozomal alt popülasyonlar belirli bir mRNA veya protein dernek sonraki belirlenmesi için zengin bir kaynak. Aktif ribozom ile ilişkili mRNA'ların toplam havuzu ilişkili bir mikroarray 4 ya da derin bir sıralama analizi 5 üzerinden tespit edilebilir . Protein dernekleri de uygun reaktif 6 bağlayan bir haç ilave edilerek stabilize olabilir.
Memeli hücrelerinde Polyribosome analizi de istikrarlı polysomes almak için gerekli koşulları belirleyen en belirgin zorluklar açısından farklı bir protokol olarak söz değer. Literatürde bildirilen tampon sistemler, 7-10 yaygın olarak değişken böylece lizis tamponu hücre türüne özgü optimizasyonu için bir gereklilik olabilir, ya da tampon sistemi ile çalışmak için istekli dikkat kadar önemli olmadığını eşit makul taze lizatları düşük sıcaklıklarda tutulur. Bildiğimiz kadarıyla memeli polysome oluşumunu etkileyen parametreler sistematik bir değerlendirme rapor edilmemiştir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, bu yöntemin ilk olarak John Woolford kabul etmek istiyorum, TGK GM057483 ve AI076245 NIH tarafından desteklenen ve ÇHC GM77073 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
- Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C. Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
- Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking. Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).
- Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon. Rna. 6, 1573-1584 (2000).
- Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. Analysis of mRNA formation and function. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).
- Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs. Genes Cells. 6, 121-129 (2001).
- Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation. J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).
