Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.
Abstract
Eiwitsynthese is een complexe cellulaire proces dat geregeld is op vele niveaus. Zo kan bijvoorbeeld de wereldwijde vertaling worden geremd bij de start fase of de rek fase door een verscheidenheid van cellulaire stress, zoals aminozuur verhongering of groeifactor terugtrekking. Als alternatief kunnen vertalen van individuele mRNA's worden geregeld door mRNA lokalisatie of de aanwezigheid van verwante microRNA's. Studies van de eiwitsynthese vaak gebruik maken van polyribosome analyse om licht te werpen op de mechanismen van de vertaling regelgeving of defecten in de eiwitsynthese. In deze test worden mRNA / ribosoom complexen geïsoleerd van eukaryotische cellen. Een sucrose dichtheidsgradiënt scheidt mRNA's gebonden aan meerdere ribosomen bekend als polyribosomes van mRNA's gebonden aan een enkele of een ribosoom monosome. Fractionering van de hellingen laat isolatie en kwantificering van de verschillende ribosomale bevolking en de bijbehorende mRNA's of eiwitten. Verschillen in de verhouding van polyribosomes om monosomes onder bepaalde voorwaarden kan een indicatie zijn van gebreken in een vertaling op inleiding of op rek / beëindiging. Onderzoek van de mRNA's aanwezig in de polyribosome fracties kan uitwijzen of de cohort van de individuele mRNA's die verandert met de experimentele condities vertaald. Daarnaast kunnen ribosoom montage worden gecontroleerd door analyse van de kleine en grote ribosomale subeenheid pieken, die ook worden gescheiden door het verloop. In deze video, presenteren we een werkwijze voor de bereiding van ruwe ribosomale extracten van gistcellen, scheiding van het extract door sucrose gradiënt en interpretatie van de resultaten. Deze procedure is eenvoudig aan te passen aan zoogdiercellen.
Protocol
1. De voorbereiding van 7-47% sucrose gradiënten
- Bereid sucrose gradiënten een dag voor gebruik, zodat hellingen te worden continu. Maak steriel 7% en 47% sucrose oplossingen die 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris-acetaat pH 7,0 en 12mm MgCl 2 en bewaren bij 4 ° C 1.
- Voor 6 gradiënten mix van de 7% en 47% sucrose stockoplossingen tot 48 ml van elk van de volgende sucrose concentraties te maken. Voeg DTT (1M voorraad) aan elke sucrose oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
Uiteindelijke concentratie 7% sucrose 47% sucrose 7% 48 ml 0 17% 36 ml 12 ml 27% 24 ml 24 ml 37% 12 ml 36 ml 47% 0 48 ml - Met het oog op de hellingen gieten, bevestig een Pasteur pipet om een 20 ml spuit door zich te verzekeren en afdichten met Parafilm of gebruik een lange naald. Voeg 7 mL van 7% sucrose naar de bodem van een 1 x 3,5 "polyallomer ultracentrifuge buis. Voeg vervolgens 7 ml van 17% sucrose oplossing onder de 7%-oplossing door het plaatsen van het Pasteur pipetpunt de buurt onderkant van de buis en pipetteren niet sneller dan 0,3 ml / sec. herhalen met 7 ml elk van de 27%, 37% en 47% sucrose oplossingen. Je moet in acht duidelijke lijnen tussen de lagen, waaruit blijkt dat een minimale vermenging heeft. Store hellingen deden zich voor bij 4 ° C gedurende de nacht, samen met de rotoren, flessen en buizen die zullen worden gebruikt om monsters te oogsten.
2. Voorbereiding van de gistextract
- Grow 125 ml gistcultuur aan een OD 600 van 0.8-1.0. Voeg cycloheximide aan de cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en blijven schudden bij 30 ° C gedurende 15 minuten.
- Ondertussen bereiden lysis buffer met 80 ug / ml cycloheximide, 200 ug / ml heparine, 0,2% DEPC, en 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30mm MgCl 2. Houden alles op ijs vanaf dit moment.
- Giet de cultuur in een 250 ml centrifuge fles en vul deze met ijs. Centrifugeer bij 8.000 xg (7250 rpm in een SLA-1500 rotor) gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zodra Was de pellet met 10 ml ijskoude lysis buffer en over te dragen aan 15 ml polypropyleen buizen. Centrifugeer bij 5900 xg (~ 6000 rpm in een SLA-600TC rotor) gedurende 3 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 0,5 ml lysis buffer, transfer naar 1,5 ml tube en voeg 0,5 ml gekoeld, gebakken met zuur gewassen glazen kralen. Vortex de cellen voor vier 30 sec, het koelen van de buis op ijs gedurende 30 seconden tussen elk interval. Voeg nog een 0,5 ml lysis buffer in de 1,5 mL buis. Centrifugeer op maximale snelheid in een microcentrifuge (14.000 rpm in een Eppendorf 5417R microcentrifuge) gedurende 10 min bij 4 ° C. Overdracht supernatant naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Verwijder de 10 pi om een aparte buis om de OD 260 / OD 280 ratio (zie stap 3.1) te bepalen. Bewaar extracten bij -80 ° C.
3. De voorbereiding van uittreksels uit zoogdiercellen
- Voor hechtende cellen, groeien in 100 mm schotel naar ~ 70% confluentie. U moet een 100 mm gerecht per 11 ml helling (typisch opbrengst is ~ 20 OD 260 eenheden). Lineair schaal het bedrag voor grotere of kleinere gradiënt maten. Voor niet-hechtende cellen, zijn ongeveer 1 x 10 7 cellen die nodig zijn per 11 ml verloop.
- Voorafgaand aan de lysis, toe te voegen cycloheximide tot 100 ug / ml. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Overdracht platen ijs en tweemaal spoelen cellen in ijskoude PBS. Alle toekomstige stappen moeten worden uitgevoerd bij 0-4 ° C.
- Verwijder alle sporen van PBS door aspiratie (laten platen aanslag op een schuine bed van ijs) en voeg 1 ml lysis buffer, schraap en transfer naar het pre-gekoelde 1,5 mL buis. Lysis buffer componenten zal moeten worden geoptimaliseerd om het celtype en de groei omstandigheden. Een goed uitgangspunt buffer zou 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl2, 200 mM KCl, 1% Triton worden X-100 (v / v), 100 ug / ml cycloheximide, 2 mM DTT, en 1 mg / ml heparine. De belangrijkste variabelen zijn de concentraties van magnesium en kalium chloride, alsook de opname of uitsluiting van niet-ionische detergenten de extractie van het cytoskelet of membraan-gebonden polysomen te verbeteren. Lyse cellen door het passeren tot en met 27 gauge naald twee of met 5-10 slagen van dounce homogenisering gebruik van Type B stamper. De spuit of homogeniseerapparaat moet vooraf gekoeld voorafgaand aan gebruik.
- Spin bij 14.000 xg gedurende 5 min in de koelkast microcentrifuge. Overdracht verse lysaat aan de sucrose gradiënt (voor zoogdiercellen deze is opgebouwd in lysis buffer ontbreekt Triton X-100 en heparine, maar verder, zoals beschreven in 1.2 en 1.3) of Flash bevriezen in vloeibare stikstof voor later gebruik. 4. Centrifugeren van gradiënten
- Dooi polyribosome lysaten op ijs. Bepaal de concentratie van nucleïnezuur in het lysaat door het toevoegen van de gereserveerde 10 ui monster tot 1 ml water en het lezen van de OD 260 / OD 280 verhouding met een spectrofotometer. Typische opbrengst van een gistcultuur gegroeid, zoals beschreven is 50 OD-eenheden.
- Met behulp van een pipet met de punt geplaatst tegen de wand van de buis in de buurt van het oppervlak van het verloop, zacht laagje 25 OD 260 eenheden van het lysaat op de top van het verloop. Voor een 35 ml gradiënt 500 pi van lysaat is typisch geladen. Lysis buffer kan worden gebruikt om te verzekeren alle gradiënten worden geladen met een gelijk volume. Lagere hoeveelheden materiaal tot betere resolutie. Met behulp van een tang voorzichtig lager de gradiënten in emmers van een swingende emmer rotor.
- Centrifugeer de hellingen op 100.000 xg (23.000 rpm in een Surespin 630 rotor) voor 4 uur bij 4 ° C. Dit protocol kan worden aangepast voor kleinere volume hellingen.
- Ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de voltooiing van de 4 uur draaien bevestig de naald aan de Model 184 buis piercer. Bevestig de pen om de online Isco Model UA-5 Absorbance / Fluorescentie Monitor. Macht op de absorptie-monitor, zodat een stabiele basislijn voorafgaand aan de analyse van monsters worden bereikt. Elektronische overname van de polysome profiel kan gemakkelijk worden verkregen door het aanbrengen van een DI-148U data-acquisitie-eenheid (DATAQ Instruments) naar de recorder. Profielen kunnen dan worden verzameld in real time en opgeslagen voor later gebruik van de bijbehorende annotatie WinDaq software.
- Vul de spuit pomp met 50 ml van Fluorinert het gebruik van de reverse flow, een snelle setting. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Sluit de slang van de spuit aan de buis piercer en kort op de stroom van Fluorinert u bij 3 ml / min in voorwaartse richting om de slang vrij van eventuele luchtbellen.
- Plaats een afvalstof beker of een reeks van buizen als het verzamelen van fracties onder de slang aan het einde van de stroom cel te proeven verzamelen vandoor.
- Verwijder voorzichtig de polyallomer centrifugebuizen met de sucrose gradiënt van centrifuge rotor en plaats ze op ijs (pre-vorm de putten in het ijs met een lege buis te storen hellingen te vermijden).
- Voor het analyseren van cel extracten, plaatst u de helling buis op de buis piercer. Sluit de bovenkant van de buis naar de uitlaat en veilig. Verhoog de onderkant podium om de centrifugebuis, zodat de naald doorboort de bodem van de buis. Zodra de naald stak door de bodem van de centrifugebuis, begin de stroom van Fluorinert in voorwaartse richting op 6mL/min.
- Zodra de Fluorinert is begonnen stroomt in de buis, toezicht op de beweging van de naald op de online absorptie monitor. Zodra de naald begint te bewegen, op de kaart beweging wenden tot een snelheid van 60. De monitor registreert de OD 254 te beginnen met het gratis materiaal, gevolgd door 40S ribosomale subunit detectie en blijft tot en met polyribosome complexen. Als u het verzamelen van fracties voor RNA of eiwit-analyse, zijn meestal 0,2 min fracties genomen (1 ml). Voor RNA-analyse, moet fracties direct worden verzameld in buisjes die TRIzol (Invitrogen), fenol of SDS / proteinase K, afhankelijk van de voorkeur van de winning.
- Wanneer het einde van de polyribosome profiel is bereikt, schakelt u de stroom van Fluorinert aan de centrifugebuis en stop de grafiek beweging van de absorptie / fluorescentie monitor.
- Trek de Fluorinert van de centrifugebuis in de spuit door vanaf de stroming in de tegengestelde richting in een snel tempo en zorg ervoor niet te sucrose te trekken uit de buis in de spuit. Schroef de centrifugebuis uit de tube piercer, hoe lager de naald, en verwijder de buis.
- Herhaal stap 5.5 tot 5.8 voor elke sucrose gradiënt.
- Als alle sucrose gradiënten zijn geanalyseerd, de Fluorinert terug trekken uit de slang in de spuit. Verwijder elk onderdeel van fractionator (buis piercer en flow cel) met inbegrip van de afvoerslang aan de bovenkant en spoel goed met water.
5. Het verzamelen van gegevens en fracties
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Vertegenwoordiger spoor van ribosoom extract bereid uit giststam BY4741 (mat een his3 Δ een leu2 Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) in de aanwezigheid van cycloheximide. De ribosomale extract werd gefractioneerd met behulp van een 7 47% sucrose gradiënt en geanalyseerd met behulp van een pomp spuit apparaat aangesloten op een UV-detector. Pieken met polyribosomes en 80S, 60S en 40S ribosomen zijn aangegeven.
Discussion
De informatie verkregen uit de polyribosome profiel kan waardevolle inzichten in de translationele status van de cel. Daarnaast kan de status van de assemblage van ribosomale subunits zelf worden bepaald 2. Voor bijvoorbeeld de aanwezigheid van halfmers of 80S en grotere pieken met een lichte schouder aan de rechterkant van het profiel geeft een gebonden 40S subunit wachten 60S subunit toetreden. Het uitvoeren van het experiment in de afwezigheid van enige toegevoegde cycloheximide of een andere remmer van rek maakt voor de analyse van de snelheid van weglopen, die aangeeft of rek is 3 veranderd. De fracties zelf zijn een rijke bron van reagentia voor de verdere bepaling van de vereniging van een specifieke mRNA of eiwit met ribosomaal subpopulaties door Northern of Western blotting van de fracties. De totale pool van mRNA's geassocieerd met actieve ribosomen kan worden bepaald via een bijbehorende microarray 4 of diepe sequencing analyse 5. Het eiwit verenigingen kan ook worden gestabiliseerd door de juiste toevoeging van een cross linking reagens 6.
Polyribosome analyse van zoogdiercellen Vermeldenswaard is ook als een duidelijk protocol ten aanzien van de schijnbare moeilijkheden bij de vaststelling van de voorwaarden om een stabiele polysomen te verkrijgen. De buffer systemen in de literatuur gerapporteerd worden op grote schaal variabel 7-10, dus kan er een eis voor cel-type specifieke optimalisatie van de lysis buffer zijn, of is het ook aannemelijk dat de buffer systeem niet zo belangrijk is als graag aandacht aan het werken met verse lysaten bewaard bij lage temperaturen. Om onze kennis van een systematische evaluatie van de parameters die zoogdieren polysome vorming is niet gemeld.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag John Woolford erkennen voor de eerste basis van deze methode, wordt TGK ondersteund door NIH GM057483 en AI076245 en China wordt ondersteund door GM77073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
- Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C. Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
- Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking. Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).
- Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon. Rna. 6, 1573-1584 (2000).
- Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. Analysis of mRNA formation and function. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).
- Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs. Genes Cells. 6, 121-129 (2001).
- Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation. J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).
