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Biology

真核Polyribosome剖面分析

doi: 10.3791/1948 Published: June 15, 2010

Summary

本文介绍了协议的真核细胞的核糖体翻译的提取。一旦提取,核糖体是由蔗糖梯度分馏分离到monosomes和多聚核糖体,允许不同的核糖体的人群进行分析。因此,这种方法是研究翻译调控的黄金标准。

Abstract

蛋白质合成是一个复杂的细胞的过程,是多层次的监管。例如,全球翻译,可以抑制在开始阶段,或由多种氨基酸饥饿或生长因子撤出的细胞,如强调伸长阶段。另外,个别的mRNA的翻译,可调节mRNA的本地化或同源的microRNA存在。蛋白质合成的研究经常使用polyribosome的分析,阐明翻译调控机制或蛋白质合成的缺陷。在这个实验中,mRNA /核糖体的复合物是由真核细胞中分离出。蔗糖密度梯度分离势必被称为绑定到一个单一的核糖体或monosome的mRNA的多聚核糖体的多个核糖体mRNA的。分馏梯度允许不同的核糖体的人口及其相关的mRNA或蛋白质分离和量化。多聚核糖体的比例在规定条件下的差异,以monosomes可以在任的翻译起始或伸长/终止的缺陷指示。目前的mRNA在polyribosome分数的考试可以揭示是否对个人的mRNA队列被翻译与实验条件的变化。此外,核糖体的组装可以监测分析小核糖体大亚基梯度分离峰。在这段视频中,我们目前的原油从酵母细胞中,蔗糖梯度的提取分离和对结果的解释的核糖体中提取的准备方法。此过程是哺乳动物细胞容易适应。

Protocol

1。 7-47%蔗糖梯度制备

  1. 准备蔗糖梯度有一天,在使用之前,让渐变成为连续。无菌7%和47%的蔗糖溶液,含50mm 的NH 4 CL,50毫米的Tris -醋酸的pH 7.0和12mm MgCl 2的和储存在4 ° C 1。
  2. 6梯度组合的7%和47%蔗糖的股票解决方案,使48毫升以下的蔗糖浓度。数码地面电视(1M股票)添加到每个蔗糖溶液至终浓度为1mm。
    终浓度 7%的蔗糖 47%的蔗糖
    7% 48毫升 0
    17% 36毫升 12毫升
    27% 24毫升 24毫升
    37% 12毫升 36毫升
    47% 0 48毫升
  3. 为了倒梯度,巴斯德吸管附加保障,并用封口膜密封,20毫升注射器或使用长针。 7%的蔗糖添加7毫升1 × 3.5“polyallomer超速离心机试管底部,然后添加7毫升17%,7%的解决方案下的蔗糖溶液,放置巴斯德吸管试管的底部附近的一角,超过0.3吹打没有更快毫升/秒7毫升的27%,37%和47%的蔗糖溶液的重复,您应遵守线条清晰,层与层之间,最小的混合。商店梯度发生在4 ° C过夜连同转子,瓶将用于收获样品管。

2。酵母提取物的制备

  1. 增长酵母培养125毫升0.8-1.0外径600。添加酮的文化到终浓度为100微克/毫升,并继续摇动30 ° 15分钟的彗星。
  2. 同时,准备裂解液中含有80微克/毫升放线菌酮,200微克/ ml肝素,0.2%DEPC,和10毫米的Tris - HCl pH值7.5,0.1M的氯化钠,氯化镁30MM 2。保持冰从这个角度上的一切。
  3. 倒入一个250毫升离心瓶的文化,并填补了冰。在8000 XG(7250 RPM在SLA - 1500转子)离心5分钟在4 ° C洗涤沉淀一次用10毫升的冰冷的裂解液转移至15 mL聚丙烯管。在5900 XG(〜6000 RPM)在一个SLA - 600TC转子离心3分钟,在4 ° C重悬在0.5 mL裂解缓冲液,转移中的颗粒1.5ml离心管,加入0.5毫升冷冻,烘烤,酸洗玻璃珠。涡4个30秒的间隔,在冰上冷却管,相互之间间隔为30秒的细胞。添加到另一个裂解液0.5毫升1.5毫升管。在微量的Eppendorf 5417R离心(14,000 RPM)的最大速度离心10分钟在4 ° C上清转移到一个新的1.5 ml离心管。取出10μL到一个单独的管,以确定的OD 260 / OD 280比值(见下文步骤3.1)。商店提取物在-80 ° C

3。从哺乳动物细胞提取物的制备

  1. 对于贴壁细胞,生长在100毫米的菜〜70%汇合。您将需要一个100毫米,每11毫升梯度菜(典型的产量是20 OD 260单位) 。金额较大或较小的梯度大小线性的规模。对于非贴壁细胞,约1 × 10 7细胞都需要每11毫升梯度。
  2. 裂解之前,添加100μg/ mL的放线菌酮。在37 ° C下15分钟。传输板冰,在冰冷的PBS冲洗细胞两次。将来所有的步骤必须进行在0-4 ° C。
  3. 的PBS吸删除所有痕迹(让板漏角度的冰床),并添加1 mL裂解缓冲液,刮去,并转移到预冷1.5 mL试管。裂解液成分,将需要的细胞类型和生长条件进行了优化。一个很好的起点缓冲区将20毫米的HEPES - KOH,pH值7.4,15毫米氯化镁2,氯化钾200毫米,1%海卫X - 100(V / V),100微克/毫升放线菌酮,2毫米的数码地面电视服务,和1 mg / ml肝素。的关键变量,镁和氯化钾,以及列入或排除非离子型洗涤剂,以提高提取的骨架或膜约束polysom​​es的浓度。通过两次通过27号注射器针头或5-10 dounce同质化的招用B型杵裂解细胞。应预冷前使用的注射器或匀浆。
  4. 冷冻离心5分钟旋转14000 XG。将新鲜的裂解蔗糖梯度(哺乳动物细胞裂解缺乏Triton X - 100和肝素的缓冲,但在1.2和1.3所述,否则)或闪光灯以备后用液氮冻结。
  5. 4。渐变离心效果

    1. 在冰上解冻polyribosome裂解液。保留10μL样品中加入1毫升水,并用分光光度计读取OD 260 / OD 280的比例确定核酸裂解液浓度。从酵母培养成长为描述一个典型的产量是50外径为单位。
    2. 使用吸管尖端放在对管梯度表面附近的墙壁,轻轻层25 外径 260梯度顶部裂解单位。对于一个35 mL的梯度500μL裂解液通常是加载。可用于裂解缓冲液,以保证所有的梯度与同等体积加载。较低的数额的物质会产生更好的分辨率。使用镊子,小心地降低到一个水平转头桶的梯度。
    3. 梯度离心4小时100000 XG在Surespin 630转子(23,000 RPM)在4 ° C。该协议可以适用于更小的体积的梯度。

    5。收集的数据和分数

    1. 大约30分钟前完成4小时旋转针型号184管穿孔。将笔到网上ISCO型号UA - 5吸光度/荧光显示器。对吸光度的电源监控,以便分析样品前,要达到一个稳定的基准。电子收购的polysom​​e轮廓,可以很容易地获得通过附加一个DI - 148U的数据采集单元(DATAQ仪器)图表记录。配置文件可以实时收集和保存以供日​​后使用附带的WinDaq软件的注释。
    2. 填充Fluorinert使用的逆向流动,迅速设置50毫升的注射泵。确保有没有气泡。从注射器管穿孔的软管连接,并暂时关闭3毫升/分钟的前进方向,以清除任何气泡软管Fluorinert流。
    3. 放置一个废物管或烧杯系列如果收集馏分流动池下软管收集样品运行。
    4. 小心取出polyallomer离心管中,含有蔗糖梯度离心转子,放在冰(前形成与冰空管的井,以避免干扰梯度)。
    5. 为了分析细胞提取物,梯度管,管穿孔。管上方连接到电源插座和安全。提高阶段性底部的离心管,使针头穿透试管底部。一旦针头通过离心管底部的突出的前进方向,开始在6mL/min流Fluorinert。
    6. 一旦Fluorinert已经开始流入管,监察运动的针上在线吸光度监测。一旦针开始移动,在图表上的运动,以60的速度设定。监视器将记录与40S核糖体亚基检测,并继续通过polyribosome络合物自由材料的外径254起。如果你正在收集RNA或蛋白质分析的分数,通常是0.2分的分数是(1毫升)。 RNA分析,分数应该是直接收集到含有Trizol试剂(Invitrogen公司),苯酚或SDS /蛋白酶K管上的首选方法提取而定。
    7. 当年底的polyribosome轮廓已经达成,关闭流Fluorinert离心管和停止的吸光度/荧光显示器中的图表运动。
    8. 缩回到注射器Fluorinert开始在相反的方向流动快速,请务必不要从蔗糖进入注射器管率从离心管。拧开管穿孔的离心管中,低针,取出管。
    9. 重复步骤5.8 5.5每个蔗糖梯度。
    10. 当所有的蔗糖梯度进行了分析,收回Fluorinert从软管进入注射器。删除每个分馏部分,包括在上方废物软管(管穿孔和流动池),并用清水冲洗干净。

    6。代表性的成果

    图1
    图1代表核糖体中提取的痕迹的酵母菌株BY4741中存在的放线菌酮(HIS3ΔLEU2Δ0 met15ΔΔ0 0 URA3)的准备。核糖体的提取物被分割利用7 47%的蔗糖梯度和分析,使用一台泵注射器仪器连接到紫外探测器。含有多聚核糖体80S,60S和40S核糖体的峰表示。

Discussion

从polyribosome配置文件中获得的信息,可以进入翻译状态的细胞提供有价值的见解。此外,可确定自己的核糖体亚基组装的状态2 。例如halfmers或80S和较大的山峰有轻微的肩膀上个人资料的权利的存在表明绑定的40S亚基等待60S亚基加入。执行在没有任何附加的放线菌酮或其他伸长抑制剂实验可以分析的流失率,这表明与否的伸长率改变3。的分数本身是为一个特定的基因或蛋白质与核糖体的亚群,北方或西方的分数印迹协会随后决定的试剂的丰富来源。可确定的积极核糖体mRNA的总池通过相关的芯片 4或深度测序分析 5 。也可以稳定蛋白质协会由适当的另外一个交叉连接试剂6。

从哺乳动物细胞的Polyribosome分析也值得一提的,在不同的协议在建立所需的条件,以获得稳定的polysom​​es明显的困难。文献报道的缓冲区系统广泛变量7-10,从而有可能为细胞裂解液的具体优化的要求,或者是同样合理的缓冲系统,是不是只要与热切关注的重要新鲜裂解液在低温下保存。据我们所知,系统评价的影响哺乳动物polysom​​e形成的参数尚未见报道。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者要感谢约翰沃尔伍德这种方法的初步基础,TGK是支持由美国国立卫生研究院GM057483和AI076245和中国GM77073支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
polyallomer ultracentrifuge tube Beckman Coulter Inc. 326823 1 x 3.5 in. (25x89mm)
Fluorinert Sigma-Aldrich F9755
Cycloheximde Sigma-Aldrich C-7698
Heparin Sigma-Aldrich H3393
BY4741 Open Biosystems YSC1048 Other strains work equally well

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References

  1. Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C. Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).
  2. Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).
  3. Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).
  4. Serikawa, K. A. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).
  5. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
  6. Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking. Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).
  7. Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon. Rna. 6, 1573-1584 (2000).
  8. Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. Analysis of mRNA formation and function. Richter, J. D. Academic Press. 305-321 (1997).
  9. Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs. Genes Cells. 6, 121-129 (2001).
  10. Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation. J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).
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Esposito, A. M., Mateyak, M., He, D., Lewis, M., Sasikumar, A. N., Hutton, J., Copeland, P. R., Kinzy, T. G. Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis. J. Vis. Exp. (40), e1948, doi:10.3791/1948 (2010).More

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