Summary
この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。
Abstract
タンパク質合成は、様々なレベルで制御されている複雑な細胞プロセスです。例えば、グローバルな翻訳は、アミノ酸飢餓や成長因子の撤退などの細胞ストレスの種々の方法によって開始フェーズまたは伸長段階で抑制することができる。また、個々のmRNAの翻訳は、mRNA局在や同種のマイクロRNAの存在によって調整することができる。タンパク質合成の研究は、頻繁に翻訳調節やタンパク質合成に欠陥のメカニズムに光を当てるためにポリリボソーム解析を利用しています。このアッセイでは、mRNA /リボソーム複合体は、真核細胞から単離されている。ショ糖密度勾配は、単一のリボソームまたは一染色体に結合したmRNAからpolyribosomesと呼ばれる複数のリボソームに結合したmRNAを分離します。勾配の分画は、異なるリボソーム集団とそれに関連するmRNAまたはタンパク質の分離と定量化が可能になります。定義された条件の下でmonosomesへpolyribosomesの比率の違いは、翻訳開始または伸長/終了のどちらかに欠陥の可能性を示唆しています。ポリリボソーム画分に存在するmRNAの検討では、個々のmRNAのコホートは、実験条件に変更が翻訳されているかどうかを明らかにすることができます。さらに、リボソームアセンブリも勾配によって分離され、大小のリボソームサブユニットのピークの分析によってモニターすることができる。このビデオでは、我々は、酵母細胞、ショ糖勾配による抽出物の分離や結果の解釈から得られた粗リボソーム抽出物の調製方法を提示する。この手順では、哺乳動物細胞に容易に適応可能である。
Protocol
1。 7から47パーセントの蔗糖勾配の準備
- 勾配が連続になることを可能にするために使用する前に一日蔗糖勾配を準備します。 7％滅菌作成し、4で50mmのNH 4 Clを含む47％ショ糖溶液、50mMトリス-酢酸のpHは7.0と12mmのMgCl 2と店舗℃で1。
- 6勾配は、以下のショ糖濃度の各48 mLを作るために7％、47％ショ糖ストック溶液を混合するため。 1mMの最終濃度がそれぞれのショ糖溶液にDTTを（1M株式）を追加します。
最終濃度 7％のスクロース 47％ショ糖 7パーセント 48 mLの 0 17パーセント 36 mLの 12mlの 27パーセント 24 mlの 24 mlの 37パーセント 12mlの 36 mLの 47パーセント 0 48 mLの - 勾配を注ぐためには、確保してパラフィルムで封で20 mLシリンジにパスツールピペットを添付したり、長い針を使用してください。 1 × 3.5"ポリアロマー超遠心チューブの底に7％のショ糖の7 mLのを追加します。次は、チューブの底近くにパスツールピペットの先端を配置しても高速な0.3よりをピペッティングしないで7％のソリューションの下に17％ショ糖溶液の7 mLを加えml /秒。7 mLの27％の各々と繰り返し、37％および47％ショ糖溶液。あなたはレイヤーの間に明確な線を守るべき、最低限の混合はボトル、ローターと一緒に℃で一晩4℃。ストアの勾配が発生したことを示すとサンプルを収集するために使用されるチューブ。
2。酵母エキスの調製
- 0.8から1.0のOD 600に酵母培養液125 mLを成長する。 100μg/ mlの終濃度に培養液にシクロヘキシミドを追加し、30で振とう℃で15分間続ける。
- 一方、80μg/ mLのシクロヘキシミド、200μg/ mLのヘパリン、0.2％DEPC、および10mMのトリス-塩酸pH7.5、0.1MのNaCl、30mMのMgCl 2を含む溶解緩衝液を準備。この時点から氷の上にすべてをしてください。
- 250mLの遠心ボトルに文化を注ぎ、氷を詰めます。 4℃で5分間8000 × gで（SLA - 1500ローターで7250 rpm）で遠心する氷冷溶解緩衝液と15 mLポリプロピレンチューブに転送10mLで一回ペレットを洗浄します。 4℃で3分間℃で5900 × gで（SLA - 600TCローターで〜6,000 rpm）で遠心する、溶解バッファー0.5 mlにペレットを1.5mlチューブへの転送やチルド、焼きたての酸洗浄ガラスビーズ0.5 mLを加える。渦four 30秒間隔のための細胞、各インターバルの間に30秒間氷上でチューブを冷却する。 1.5 mlチューブに、溶解緩衝液の別の0.5 mLを追加します。で10分間4℃で遠心の最高速度（エッペンドルフ5417Rの遠心で14,000 rpm）で遠心する新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移す。 OD 260 / OD 280の比率を決定するために別のチューブに10μlを削除する（下のステップ3.1を参照）。 -80℃ストアエキス℃の
3。哺乳動物細胞からの抽出物の調製
- 接着細胞の場合は、〜70％コンフルエントに100 mmディッシュで育つ。あなたは11 mlの勾配ごとに100 mmディッシュ（典型的な収率は〜20 OD 260単位です）が必要となります。大きくしたり小さく勾配の大きさのために直線的に量を拡大縮小します。非接着細胞の場合、約1 × 10 7細胞を11 mlの勾配ごとに必要とされる。
- 溶解の前に、100μg/ mLとするシクロヘキシミドを加える。 37℃で15分間インキュベートする。氷にプレートを移し、氷冷PBSで細胞を2回すすいでください。将来のすべてのステップは0〜4℃で実施されなければならない（MUST）
- 吸引によるPBSの痕跡をすべて削除する（プレートは氷の傾斜ベッドの上で排出させる）と1 mlの溶解バッファーを追加し、あらかじめ冷却した1.5mlチューブにスクレープして転送。溶解バッファーの成分は、細胞の種類や成長条件を最適化することが必要になります。良い出発バッファーは20mMのHEPES - KOH、pH7.4の15 mMのMgCl 2、200mMのKClを、1％トリトンX - 100（V / V）、100μg/ mlのシクロヘキシミド、2mMのDTT、および1 mg /になりますmLのヘパリン。主要な変数は、細胞骨格や膜結合ポリソームの抽出を向上させるためにマグネシウムと塩化カリウムの濃度だけでなく、非イオン性界面活性剤の包含または除外です。二回27ゲージの注射針を通過したり、タイプB乳棒を使用してダウンスの均質化の5-10ストロークによって細胞を溶解する。注射器やホモジナイザーは使用前にあらかじめ冷却してください。
- 冷蔵微量遠心機で5分間、14,000 xgでスピン。後で使用するために液体窒素でのショ糖密度勾配（哺乳動物細胞のためにこれをトリトンX - 100およびヘパリンが、それ以外は1.2と1.3で説明されているように欠けている溶解バッファーで構成されている）やフラッシュ凍結に新鮮なライセートを転送する。 4。勾配の遠心分離
- 氷の上にポリリボソームライセートを解凍。水1mLに予約されて10μLのサンプルを追加し、分光光度計でOD 260 / OD 280の比率を読み取ることによって、溶解物中の核酸の濃度を決定する。説明されているように成長酵母培養液からの典型的な収率は50 OD単位です。
- 勾配の上に層ライセートの25 OD 260ユニットを静かに、勾配の表面近傍の管の壁に置かれたチップを用いてピペットを使用する。用溶解液の35 mLの勾配を500μlは一般的にロードされます。溶解バッファーは、すべての勾配が等しいボリュームがロードされるように使うことができます。材料の下の量は、より良い分解能が得られます。鉗子を使用して、慎重にスイングロータのバケットに勾配を下げる。
- 4℃で4時間、100,000 × gで（Surespin 630ローターで23000 rpm）で勾配を遠心℃にこのプロトコルは、より小さい容積の勾配に適合させることができる。
- 前の4時間のスピンの完了まで約30分には、モデル184チューブのピアサーに針を取り付けます。オンラインイスコモデルUA - 5の吸光度/蛍光モニターにペンを取り付けます。前の分析試料に到達するために安定したベースラインを可能にするために吸光度をモニターの電源を入れます。ポリソームプロファイルの電子買収を簡単にチャートレコーダにDI - 148Uのデータ収集ユニット（DATAQインスツルメンツ）を取り付けることにより得ることができます。プロファイルは、リアルタイムで収集し、付属WinDaqのソフトウェアを使用して、後で注釈のために保存することができます。
- フロリナート逆流、迅速な設定を使用しての50mLのシリンジポンプを埋める。現在に気泡がないことを確認してください。注射器からチューブのピアサーにホースを接続し、簡単に、気泡のホースをクリアするために順方向に3mL /分でフロリナートの流れをオンにします。
- サンプルを収集するフローセルの最後にホースの下に分画を集めるがオフ実行する場合はチューブの廃棄物のビーカーまたはシリーズを置きます。
- 慎重に遠心ローターからショ糖勾配を含むポリアロマー遠心分離管を削除し、（不穏な勾配を避けるために、空のチューブと氷の井戸を事前に形成する）氷の上に置きます。
- 細胞抽出物を分析するために、管の穿孔に勾配管を配置。コンセントにチューブの上部を接続し、固定します。針がチューブの底を貫通するように遠心分離管に底のステージを上げる。針は、遠心分離管の底部から突出されると、6mL/minで順方向にフロリナートの流れを開始する。
- フロリナートはチューブに流入開始すると、オンラインの吸光度をモニター上の針の動きを監視する。針が動き始めると、60の速度設定にチャートの動きをオンにします。モニターは、40Sリボソームサブユニットの検出およびポリリボソーム複合体まで続くが続くフリー材料で始まるOD 254を記録します。あなたがRNAやタンパク質の解析のための分画を収集している場合、通常0.2分の画分を（1mL）を取られる。 RNA解析のために、画分を抽出する好ましい方法に応じて、トリゾール（Invitrogen社製）、フェノールまたはSDS / Proteinase Kを含むチューブに直接収集する必要があります。
- ポリリボソームプロファイルの末尾に達したときに、遠心分離管にフロリナートの流れをオフにして、吸光度/蛍光モニターのチャートの動きを止める。
- 注射器にチューブからショ糖を描画しないように確実に速い速度で逆方向の流れを開始することにより、シリンジへの遠心管からフロリナートを引っ込めます。チューブのピアサーから緩めて遠心管には、針を下げ、そしてチューブを取り外します。
- 繰り返して、各スクロース勾配5.8を介して5.5を繰り返します。
- すべての蔗糖勾配が分析されているときは、注射器に戻ってホースからフロリナートを引っ込める。上部にある廃棄物のホースを含む分留塔の各部分を（管の穿孔とフローセル）を外し、水でよくすすいでください。
5。データ及び分画のコレクション
6。代表的な結果
図1。リボソーム抽出の代表的なトレースがシクロヘキシミドの存在下で酵母株BY4741（ マットHIS3Δ1 LEU2Δ0 met15Δ0 URA3Δ0）から調製した。リボソームエキスは7 47％のショ糖勾配を利用して分画し、UV検出器に接続されたポンプのシリンジ装置を用いて分析した。 polyribosomesと80S、60Sと40Sリボソームを含むピークが示されている。
Discussion
ポリリボソームプロファイルから得られる情報は、セルの並進状態に貴重な洞察を提供することができます。さらに、リボソームサブユニット自体のアセンブリの状態は、2を決定することができます。例えば、プロフィール上で右にわずかに肩を持つhalfmersまたは80Sと大きなピークの存在は、結合した40Sが待っている60Sが参加するサブユニットがサブユニットを示しています。伸びのいずれかを追加シクロヘキシミドまたは他のインヒビターの不在下で実験を実行すると、伸びが3に変更されているかどうかを示す流出の速度、分析することができます。分数自体は分数の北部やウェスタンブロッティングによってリボソームサブポピュレーションを持つ特定のmRNAまたはタンパク質の協会のその後の測定用試薬の豊富な情報源です。アクティブリボソームに関連付けられているmRNAの合計プールが関連付けられているマイクロアレイ4または深いシーケンシング解析5を介して決定することができます。蛋白質の関連付けも試薬6を架橋の適当な添加によって安定化させることができる。
哺乳動物細胞からポリリボソーム解析にも安定したポリソームを得るために必要な条件を確立することで見かけの難しさの点で異なるプロトコルとして言及する価値がある。文献に報告されている緩衝液系は、7-10広く可変であるため、溶解バッファーの細胞型に特異的な最適化のための要件があるかもしれません、または、バッファシステムは、作業への高い関心と同じくらい重要ではないことも同様に妥当である新鮮なライセートは、低温で保管。我々の知る限りでは哺乳類のポリソーム形成に影響を与えるパラメータの体系的な評価が報告されていない。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
作者はこのメソッドの最初の基礎のためにジョンウルフォードに感謝、TGKはGM77073によってサポートされているNIH GM057483とAI076245とPRCでサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
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