Summary
الأسلوب الحالي يسمح ناظم البرد استنساخه sectioning قطعة صغيرة من الأنسجة ، ويصعب إدارتها ، مثل الخزعات وشرائح الدماغ. علينا الاستفادة من مرحلة التجميد الألومنيوم بسيطة لتسهيل التعامل مع الأنسجة وناظم البرد القياسية لانتاج المقاطع بشكل روتيني 5-10 ميكرون المسلسل من شرائح 400 ميكرون سميكة الدماغ.
Abstract
العديد من التحقيقات في علم الأعصاب ، وكذلك التخصصات الأخرى ، وتشمل دراسة صغيرة ، وبعد قطع العيانية أو أجزاء من الأنسجة التي تم الحفاظ عليها ، إزالة طازجة ، أو رفعه لكنها أبقت قابلة للحياة ، كما هو الحال في الأعمال التحضيرية شريحة من أنسجة المخ. ويمكن لدراسات لاحقة المجهرية لهذه المواد يمكن أن يكون تحديا ، حيث أن عينات الأنسجة قد يكون من الصعب التعامل معها. تظاهر هنا هو وسيلة للحصول على مقاطع رقيقة من نسيج ناظم البرد بسماكة التي قد تتراوح 0،2-5،0 مم. نقطع بشكل روتيني 400 ميكرون سميكة شرائح الدماغ Vibratome متسلسل إلى أقسام ميكرون ناظم البرد الاكليلية 5-10. وعادة ما تكون شرائح استخدم لأول مرة للتجارب الكهربية وتتطلب ثم تحليل مجهري للالتهندس الخلوي في المنطقة التي لوحظت من التسجيلات. لقد وضعنا جهاز بسيط هو أن يسمح للرقابة واعداد المواقع واستنساخه من شريحة الأنسجة. هذا الجهاز يتكون من اسطوانة 5 سم في الطول التي يبلغ قطرها 1.2 سم ، والتي هي بمثابة مرحلة تجميد للشريحة. حلقة الشرائح بشكل مريح على جدران الاسطوانة توفير حول السماح لشريحة تكون مغمورة في النسيج المركب تجميد (على سبيل المثال ، أكتوبر). ثم يتم تجميدها بسرعة مع هذا الثلج الجاف المسحوق والرقاقة يمكن أن يؤدي بسهولة لموقف sectioning ناظم البرد. يمكن أن تكون رقيقة أقسام أذاب محمولة على الشرائح المغلفة للسماح تنفيذ المزيد من الدراسات ، مثل أساليب التلوين المختلفة ، والتهجين في الموقع ، أو المناعية ، كما يتضح هنا.
Protocol
- إعداد قالب من الشريط لمنصة أكتوبر
- ملء القالب مع أكتوبر تجميد داخل ناظم البرد أو باستخدام الثلج الجاف سحقهم.
- إزالة الشريط من حول منصة أكتوبر المجمدة.
- محاذاة علامات على تجميد وتشاك المرحلة ناظم البرد في تصاعد وقفل تشوك.
- المقطع من خلال منصة أكتوبر حتى سطح مسطح.
- إزالة أكتوبر منصة الظهور على خشبة المسرح ومكان تجميد ناظم البرد.
- مكان عينة الأنسجة (cryopreserved سابقا مع الجلسرين 30 ٪ سكروز أو في برنامج تلفزيوني) في أكتوبر
- تعد العمود الدائرى مع تجميد إسقاط حوالي 5 مم فوق رأس العمود جيدا لتشكيل أكتوبر
- الموقف بعناية عينات الأنسجة على سطح مركز العمود تجميد وإضافة ببطء حتى أكتوبر جيدا هو شغلها.
- تحيط تجميد العمود مع الثلج الجاف سحقهم. وينبغي تجميد الأنسجة وأكتوبر تماما في غضون ثوان 20-60.
- كما يزيد من درجة الحرارة في التحضير ، يمكن إزالة الطوق الخارجي ، بينما لا تزال مجمدة العينة.
- الشريحة العينة جانبية تجميد العمود ووضعه في ناظم البرد.
- انخفاض مكان على سطح أكتوبر من منصة أكتوبر وموقف عينة (نسيج أسفل) الضغط الشركة. سوف تجميد العينات بسرعة على منصة أكتوبر
- تشوك آمن على خشبة المسرح مع تصاعد ناظم البرد علامات الانحياز.
- من خلال المقطع أكتوبر سطحية في عينة الأنسجة.
- ذوبان جبل المقاطع رقيقة على الشرائح الزجاجية وتخزينها أو المجمدة في درجة حرارة الغرفة.
- لا يمكن أن يؤديها Immunoreactions للأنسجة التي شنت على الشرائح الزجاجية.
- غير مجمعة كاشف على الشريحة ، ويمكن تحريكها بلطف ، ويمكن تغطيتها اذا حساسة للضوء.
- يتم تنفيذ المراحل اللاحقة بسهولة من رد فعل من جانب الشريحة عكس في وعاء النفايات ، فتل الشريحة ، ثم تطبيق الكاشف المقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يقدم الباحثون مع موجزة وسهلة لمتابعة الخطوط العريضة لكيفية الحصول على المقاطع ناظم البرد رقيقة من القطع الصغيرة الأنسجة ، ويصعب إدارتها ، مثل الخزعات وشرائح الدماغ لمزيد من الدراسات التي يتعين القيام بها ، مثل طرق التلوين المختلفة ، في الموقع التهجين ، أو المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
