Summary
Le présent procédé permet cryostat reproductibles sectionnement de petits morceaux de tissu, difficile à gérer, comme les biopsies et les tranches de cerveau. Nous utilisons une étape de congélation en aluminium simple pour faciliter la manipulation des tissus et un cryostat standard pour produire en routine des sections 50 à 10 microns de série à partir de 400 microns tranches épaisses du cerveau.
Abstract
De nombreuses enquêtes en neurosciences, ainsi que d'autres disciplines, visent à étudier les petits, mais des morceaux macroscopiques ou des morceaux de tissu qui ont été préservés, fraîchement prélevées, ou excisée mais a gardé viables, comme dans les préparations tranche de tissu cérébral. Après des études au microscope de ce matériau peut être difficile, car les échantillons de tissus peuvent être difficiles à manipuler. Démontrée ici est une méthode pour obtenir des coupes de tissu mince avec une épaisseur qui peut aller de 0,2 à 5.0 mm. Nous avons régulièrement coupé 400 microns d'épaisseur des tranches de cerveau Vibratome série en sections 50-10 microns cryostat coronale. Les tranches sont généralement d'abord utilisé pour des expériences d'électrophysiologie et nécessitent une analyse microscopique de la cytoarchitecture de la région à partir de laquelle les enregistrements ont été observées. Nous avons construit un dispositif simple qui permet de préparer contrôlées et reproductibles et le positionnement de la tranche de tissu. Ce dispositif est constitué d'un cylindre 5 cm de longueur avec un diamètre de 1,2 cm, qui sert comme une étape de congélation pour la tranche. Un anneau glisse parfaitement sur les parois du cylindre fournissant environ la tranche permettant au tissu d'être immergé dans le composé de congélation (par exemple, OCT). Il est ensuite rapidement congelé à la glace sèche écrasée et la plaquette en résulte peut être facilement de position pour la coupe cryostat. Les lames minces peuvent être montés sur des dégel des lames recouvertes de permettre à d'autres études à réaliser, telles que des méthodes de coloration différents, l'hybridation in situ, ou l'immunohistochimie, comme démontré ici.
Protocol
- Préparer la moisissure à partir de bandes pour la plateforme octobre
- Remplir le moule avec octobre Gel dans les cryostat ou en utilisant la glace pilée et sec.
- Retirer le ruban à travers octobre plate-forme gelée.
- Aligner des marques sur le gel et le stade de Chuck cryostat de montage et de verrouillage dans le mandrin.
- Coupe à travers la plate-forme octobre jusqu'en surface est plane.
- Retirer refait surface plate PTOM et lieu sur la scène de congélation cryostat.
- Échantillon de tissu Lieu (préalablement cryoconservées avec le glycérol 30% ou de saccharose dans du PBS) en octobre
- Préparer colonne de gel avec bague extérieure projetant d'environ 5 mm au-dessus haut de la colonne formant ainsi des octobre
- Soigneusement position de l'échantillon de tissu sur le centre de la surface de la colonne de congélation et ajoutez lentement jusqu'en octobre est bien rempli.
- Surround colonne de gel de la glace sèche écrasée. Tissus et les PTOM devraient geler complètement dans les 20-60 secondes.
- Comme l'augmentation de la température de la préparation, l'anneau extérieur peut être retiré tandis que l'échantillon reste gelé.
- Faites glisser l'échantillon hors gel et le côté colonne de place dans un cryostat.
- Baisse de la Place de l'OCT à la surface de la plateforme OCT et spécimen de la position (tissu vers le bas) appliquant une pression ferme. Spécimen congeler rapidement sur la plateforme octobre
- Fixez mandrin sur cryostat de montage scène avec des marques alignées.
- Section travers octobre superficielle à l'échantillon de tissu.
- Dégel montage des lames minces sur des lames de verre et de conserver congelés ou à température ambiante.
- Immunoréactions peut être effectuée pour les tissus montés sur lames de verre.
- Le réactif est mis en commun sur la glissière, peut être doucement agité, et peut être couvert si sensible à la lumière.
- Les étapes ultérieures de la réaction sont facilement réalisées par glisser inversion dans le réceptacle des déchets, évacuant la diapositive, puis en appliquant le réactif suivant.
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Discussion
Le protocole présenté ici fournit aux chercheurs une présentation concise, facile à suivre aperçu de la façon d'obtenir des coupes cryostat mince de petits morceaux de tissu, difficile à gérer, comme les biopsies et les tranches de cerveau pour poursuivre des études à réaliser, tels que différentes méthodes de coloration, l'hybridation in situ, ou immunohistochimie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
