Summary
Mevcut yöntem, biyopsileri ve beyin dilimleri gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, kesit tekrarlanabilir Kriyostat sağlar. Biz basit bir alüminyum donma aşamasında doku taşıma ve rutin olarak 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri 5-10 mikron seri bölümleri üretmek için bir standart Kriyostat kolaylaştırmak için kullanır.
Abstract
Nörobilim yanı sıra diğer disiplinlerden birçok araştırmalar, küçük eğitim dahil, henüz korunmuş doku makroskopik parçalar veya bölümleri, taze beyin dokusu dilim hazırlıkları gibi, kaldırılır veya eksize ama canlı tutulur. Doku örnekleri ele almak zor olabilir, bu malzeme sonraki mikroskobik çalışmaları, zor olabilir. Burada gösterilen aralığı 0,2-5,0 mm kalınlığı ile ince bir doku Kriyostat bölümleri elde etmek için bir yöntemdir. Biz rutin olarak 5-10 mikron koronal Kriyostat bölüme seri 400 mikron kalınlığında Vibratome beyin dilimleri kesti. Dilimleri genellikle ilk elektrofizyoloji deneyleri için kullanılan ve daha sonra kayıtları gözlendi bölgenin hücre mimarisini mikroskopik analizi gerektirir. Biz kontrollü ve tekrarlanabilir hazırlanması ve doku dilim konumlama sağlayan basit bir aygıt inşa ettik. Bu cihaz, 1.2 cm çapında, donma dilim için bir aşama olarak görür uzun bir silindir 5 cm oluşur. Bir halka doku (örneğin, OCT) donma bileşik dalmış izin dilim etrafında silindir sağlayarak duvarları üzerinde rahatça kayar. Bu daha sonra ezilmiş kuru buz ile hızlı dondurulmuş ve ortaya çıkan gofret Kriyostat kesit için kolay pozisyon olabilir. İnce bölümler olabilir çözülme monte ileri çalışmalar, burada gösterildiği gibi, in situ hibridizasyon veya immünohistokimya gibi çeşitli boyama yöntemleri olarak gerçekleştirilebilir için izin kaplı Slaytlarınıza.
Protocol
- Ekim platformu için teypten kalıp hazırlayın.
- OCT ile kalıp doldurun. Kriyostat içinde veya ezilmiş kuru buz ile dondurun.
- Dondurulmuş Ekim platformu etrafında bandı çıkarın.
- Donma ayna ve Kriyostat montaj aşamasında Chuck kilitlemek ve işaretleri hizalayın.
- Yüzeyine kadar OCT platformu üzerinden Bölüm düzdür.
- Kriyostat dondurma sahnede yeniden su yüzüne çıktı Ekim platformu ve yer çıkarın.
- OCT Yeri doku örneği (daha önce PBS içinde% 30 gliserol veya sükroz ile Kriyoprezerve).
- Ekim için de oluşturan sütun üstünden yaklaşık 5 mm dış halka yansıtarak dondurma sütun hazırlayın.
- Dikkatle donma sütun yüzeyi merkezi üzerine pozisyon doku örneği ve iyi doludur kadar yavaşça Ekim eklemek.
- Ezilmiş kuru buz ile dondurma sütun Surround. Doku ve OCT 20-60 saniye içinde tamamen dondurmak gerekir.
- Örnek dondurulmuş kalırken, sıcaklık hazırlık arttıkça, dış bilezik çıkarılmalıdır.
- Dondurma sütun yanlara ve Kriyostat yer kapalı örnek kaydırın.
- Ekim platformu ve sabit basınç uygulayarak pozisyonda numune (doku aşağı) yüzey OCT Yeri bırakın. Numune Ekim platformu üzerine çabuk donar.
- Güvenli Chuck üzerine Kriyostat hizalanmış işaretleri ile birlikte sahne montaj.
- Ekim yoluyla doku örneği yüzeysel Bölümü.
- Cam slaytlar üzerine ince bölümler monte çözülme ve dondurulmuş ya da oda sıcaklığında saklamak.
- Immunoreactions cam slaytlar üzerine monte doku için yapılabilir.
- Reaktif, havuzlu slayt üzerine hafifçe ajite olabilir ve eğer ışığa duyarlı karşılanabilir.
- Reaksiyon daha sonraki aşamalarda kolayca slayt esneklik, atık yuvasına tersini slayt tarafından yapılan ve daha sonra bir sonraki reaktif uygulayarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol ile araştırmacılar sağlayan bir özlü, kolay takip yapılacak ileri çalışmalar için biyopsileri ve beyin dilimleri gibi gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, ince Kriyostat bölümleri nasıl elde etmek için ana hatları in situ hibridizasyon veya immünohistokimya çeşitli boyama yöntemleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
