Summary
We muismodellen vastgesteld van periventriculaire leukomalacie (PVL), de overheersende hersenletsel bij premature baby's gekenmerkt door periventriculaire witte stof afwijkingen. Hypoxie / ischemie met / zonder systemische infectie zijn de voornaamste oorzaken van PVL. Eenzijdige carotis ligatie en hypoxie blootstelling met / zonder lipopolysaccharide injectie zorgt voor PVL-achtige laesies in de P6 muizen.
Abstract
Beschrijven we een protocol voor het vaststellen van muismodellen van periventriculaire leukomalacie (PVL). PVL is de meest voorkomende vorm van hersenletsel bij premature baby's en de meest voorkomende antecedent van cerebrale parese. PVL wordt gekenmerkt door periventriculaire witte stof schade met prominente oligodendroglia letsel. Hypoxie / ischemie met of zonder systemische infectie / ontsteking zijn de voornaamste oorzaken van PVL. We maken gebruik van P6 muizen modellen van neonatale hersenletsel te maken door de inductie van hypoxie / ischemie met of zonder systemische infectie / ontsteking met een eenzijdige carotis ligatie, gevolgd door blootstelling aan hypoxie, met of zonder injectie van de endotoxine lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemie van myeline basic protein (MBP) of O1 en elektron microscopisch onderzoek blijkt prominent myeline verlies van cerebrale witte stof met extra schade aan de hippocampus en de thalamus. Oprichting van muismodellen van PVL zal aanzienlijk vergemakkelijken de studie van de pathogenese ziekte met behulp van beschikbare transgene muizenstammen, geleiding van geneesmiddelenonderzoek in een relatief high throughput manier om de kandidaat-therapeutische middelen te identificeren, en het testen van stamceltransplantatie met behulp van immunodeficiëntie muizenstammen.
Protocol
Gedetailleerde procedures van het creëren van neonatale hersenletsel bij P6 muizen:
- Postnatale dag 6 (P6) muizen zijn verdoofd met indirecte koeling op ijs tot het punt van ongevoeligheid voor schadelijke stimulatie (diepe anesthesie).
- Na het reinigen van de huid met alcohol, is een middellijn ventrale incisie gemaakt in de voorste nek.
- Onder een microscoop ontleden, is de splitsing van de rechter a. carotis communis benaderd door voorzichtig het terugtrekken van de omohyoid en sternocleidomastoideus spieren.
- De fascia rond de halsslagader schede wordt verwijderd, en de proximale interne tak geïsoleerd van de nabijgelegen nervus vagus en de sympathische ganglia met een haak. De interne halsslagader wordt dan verbrand met behulp van een tip verbranden.
- Na de cauterisatie, wordt de huid incisie gehecht, en het dier wordt warm gehouden tot helemaal wakker en keerde terug naar de dam.
- Een uur na ligatie, is het dier in een afgesloten kamer doordrenkt met stikstof tot een niveau van 6,0% O 2 is bereikt. Het dier wordt vervolgens blootgesteld aan 35 min van hypoxie.
- Na blootstelling aan hypoxie, de muis herstelt van een verwarmingselement (33 ° C) gedurende 30 min en dan is het terug naar de dam. Voor het creëren van hersenletsel met gecombineerde hypoxie / ischemie en infectie / ontsteking, is het dier vervolgens intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,015 ml van lipopolysaccharide (LPS, 1 mg / kg).
- Vier dagen post-hypoxia/ischemia, muizen verdoofd met indirecte koeling op ijs tot het punt van ongevoeligheid aan schadelijke prikkels, dan geperfuseerd met zoutoplossing en daarna 4% paraformaldehyde. Hersenen worden verwijderd en cryoprotected.
Figuur 1. Karakterisering van hersenletsel in de hypoxische / ischemische muismodel met H & E kleuring. Er is focale necrose (pijlen) in de cerebrale witte stof ipsilaterale (A) naar de carotis ligatie, in vergelijking met de contralaterale cerebrale witte stof (B). Ipsilaterale necrose en focale microinfarcts worden waargenomen in de hippocampus (C) en de thalamus (D) in de hersenen met ipsilaterale cerebrale witte stof letsel.
Representatieve resultaten en cijfers:
Muismodellen van PVL met hypoxie / ischemie en / of infectie / ontsteking worden bereikt door eenzijdige carotis ligatie, gevolgd door de blootstelling aan hypoxie en injectie van LPS. We zijn het definiëren van de nieuwe muismodellen als geschikt PVL-modellen. Neuropathologisch onderzoek van coronale secties gekleurd met hematoxyline-en eosine (H & E) door het gehele voorhersenen onthult focale necrose in de centrale witte stof van de cerebrale hemisfeer ipsilaterale aan de carotis ligatie (Fig. 1A), met een relatieve sparen van neuronen in de bovenliggende cerebrale cortex in vergelijking met de contralaterale cerebrale witte stof (Fig. 1B). In het middelpunt necrotische witte stof, is er duidelijke toename van de cellulariteit bestaande uit macrofagen en reactieve astrocyten, zoals kenmerkend is voor de mens centraal PVL. In de contralaterale centrale witte stof zijn de oligodendroglia kernen gerangschikt in fascicular-achtige bundels, deze architectuur is volledig verstoord door de focale necrose aan de ipsilaterale zijde. Van de nota, We zien ook ipsilaterale necrose in de hippocampus (Fig. 1C) en de thalamus (focale microinfarcts) (fig. 1D) in de hersenen met ipsilaterale cerebrale witte stof letsel. Human PVL ook niet voorkomen in volledige afzondering van de bijbehorende grijze stof afwijkingen. Het kenmerk van PVL is de relatieve, hoewel niet volledig, gespaard van de cerebrale cortex bovenliggende de benadeelde witte stof - een functie die we geloven aanwezig is in onze muismodellen.
Figuur 2. Scoren schaal van 0-5 voor het evalueren van witte stof letsel door MBP of O1 in muismodellen van periventriculaire leukomalacie.
Onze muismodellen tonen kenmerken van PVL op zowel de fenotypische en moleculaire niveaus. Wij hebben gebruik gemaakt immunocytochemische detectie van myeline basic protein (MBP) of O1-antigeen om letsel te evalueren, hebben een standaard schaal van 0 tot 5 om de witte stof letsel (afb. 2) score, en hebben gekenmerkt de witte stof pathologie (Fig . 3). Meer recent heeft een niet-vooringenomen stereological test geïmplementeerd ter vervanging van de eerste semi-kwantitatieve methode. In aanvulling, om te testen op correlatieve effecten van de witte stof letsel op functionele uitkomsten, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd gedragstesten voor de motorische functie. We hebben aangetoond dat de muizen opvallende motorische stoornissen vertonen in P10-21 na hypoxie / ischemie plus LPS op P6. We hebben criteria scoren met een schaal van 0-4 tot contralaterale ledematen disfunctie definiëren gewond muizen op P10-21. Meestal kan normale muizen scamper tot een 30 ° helling (score van 4) en klim een 45 ° helling zonder glijden (score van 3). Gewonde muizen hebben een lagere scores in correlatie met de mate van witte stof letsel.
Figuur 3. Karakterisering van witte stof schade door MBP of O1 vlekken en myeline structuur door elektronenmicroscoop (EM). MBP en O1 vlekken vertonen myeline verlies van cerebrale witte stof ipsilateraal aan de ligatie, in vergelijking met contralaterale witte stof. EM onderzoek blijkt gemyeliniseerde axonen in cerebrale witte stof contralateraal van de ligatie en gedegenereerde weefsel in ipsilaterale witte stof.
We verwachten dat de oprichting van de nieuwe muismodellen van PVL zal ons toelaten om specifieke mechanismen van PVL-achtige letsel studie naar de onvolgroeide hersenen. We zullen pathogenese het gebruik van transgene muizenstammen de rol van individuele moleculen van belang te onderzoeken en doelstellingen van neuroprotectie te evalueren.
Discussion
Schade aan de zich ontwikkelende hersenen leidt tot een verwoestende neurologische gevolgen. Opvallend is dat de patroon van de perinatale hersenletsel is sterk leeftijdsafhankelijk. Op termijn baby's, het raakt vooral cerebrale cortex met karakteristieke neuronaal verlies. Echter, bij prematuren, selectief het cerebrale witte stof met prominente letsel aan de ontwikkeling van oligodendrocyten beïnvloedt, een aandoening genaamd periventriculaire leukomalacie (PVL). De omvang van het probleem van hersenletsel in het te vroeg geboren baby is buitengewoon. Vroeggeboorte en verbeterde neonatale intensive care hebben ertoe geleid dat bijna 90% van het overleven van de 13 miljoen premature baby's wereldwijd (ongeveer 56.000 in de Verenigde Staten) geboren jaarlijks met een geboortegewicht onder 1500 gram, dat wil zeggen, een zeer laag-geboortegewicht baby's. Ongeveer 10% van de overlevenden vervolgens tentoonstelling cerebrale parese en ongeveer 50% heeft cognitieve en gedragsmatige stoornissen. PVL is de belangrijkste hersenen pathologie ten grondslag liggen aan cerebral palsy bij premature baby's. Er is geen specifieke behandeling voor PVL bestaat thans, mede doordat de pathogenese is nog niet goed begrepen 1,2.
Hoewel de etiologie van PVL is multifactorieel, perinatale hypoxie / ischemie met maternale intra-uteriene infectie wordt gedacht aan een primaire oorzaak van PVL worden. Een hypoxische / ischemische model van PVL in de rat bij P7 is eerder vastgestelde 3. Dit model is uniek omdat het lijkt op PVL bij premature baby's. Het kenmerk van dit model is selectieve witte stof pathologie, in tegenstelling tot het merendeel van de takt modellen die worden gekenmerkt door grijze stof infarct. Moet echter de beperkingen van de hypoxische-ischemische model in de rat niet het hoofd worden gezien. Ten eerste, de etiologie van PVL is vaak multifactorieel. Naast de hypoxie / ischemie, maternale-foetale infectie / ontsteking is sterk geassocieerd met PVL. Zo zou gecombineerd hypoxie / ischemie en infectie / ontsteking waarschijnlijk leiden tot meer PVL-achtige modellen. Het knaagdier leeftijd die het beste correleert met de menselijke ontwikkeling periode van de grootste risico's voor PVL laesies (24 tot 32 weken van de dracht) is postnatale omdat oligodendroglia differentiatie is voornamelijk een postnatale evenement in knaagdieren. Omdat het onmogelijk is het produceren van een maternale-foetale infectie / ontsteking in de postnatale leeftijd, zou het redelijk zijn om een infectie te bootsen op een relevante postnatale ontwikkeling podium om een knaagdier model van PVL te creëren. We hebben geprobeerd om LPS injectie combineren met de hypoxische / ischemische model in muizen op P6, om meer klinisch relevante laesies PVL te produceren. Ten tweede, de optimale proof-of-concept experimentele benadering voor een oorzakelijke rol van een molecule is het gebruik van transgene muizen; genetische manipulaties zijn veel moeilijker in de rat dan in de muis. Zo hebben we geprobeerd om ons experimenteel model van PVL te zetten van de rat naar de muis.
Muismodellen van PVL zullen veel gemakkelijker 1) de studie van de ziekte biologie en pathogenese basis van beschikbare transgene muizenstammen, 2) geleiding van geneesmiddelenonderzoek voor kandidaat-agenten te ontdekken met therapeutisch potentieel, 3) het testen van het nut van stamcellen met behulp van immunodeficiënte muizenstammen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk is voor een deel ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (RO1 NS059043 en RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stichting voor Anemie Research, Feldstein Medical Foundation, en Shriners ziekenhuizen voor kinderen.
We willen graag Dr David Pleasure bedanken voor zijn suggesties. Dit werk werd deels gesteund door subsidies aan WD van National Institutes of Health (RO1 NS059043 en RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, en Shriners ziekenhuizen voor kinderen. Wij verklaren geen concurrerende belangen met betrekking tot dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
