Summary
Wir haben festgestellt, Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie (PVL), die vorherrschende Hirn-Trauma bei Frühgeborenen durch periventrikulären Läsionen der weißen Substanz gekennzeichnet. Hypoxie / Ischämie mit / ohne systemische Infektion sind die primären Ursachen der PVL. Einseitige carotis Ligation und Hypoxie Exposition mit / ohne Lipopolysaccharid Injektion schafft PVL-Läsionen in P6 Mäusen.
Abstract
Wir beschreiben ein Protokoll für die Gründung Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie (PVL). PVL ist die vorherrschende Form der Hirn-Trauma bei Frühgeborenen und die häufigste Vorläufer der Zerebralparese. PVL ist durch periventrikulären weißen Substanz Schaden mit prominenten oligodendroglialen Verletzungen geprägt. Hypoxie / Ischämie mit oder ohne systemische Infektion / Entzündung sind die primären Ursachen der PVL. Wir verwenden P6 Mäuse Modelle der Neugeborenen-Hirn-Trauma durch die Induktion von Hypoxie / Ischämie mit oder ohne systemische Infektion / Entzündung mit einseitigen Carotis-Ligation durch die Exposition gegenüber Hypoxie mit oder ohne Injektion von Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS), gefolgt erstellen. Immunhistochemie von Myelin basisches Protein (MBP) oder O1 und elektronenmikroskopische Untersuchung zeigen prominente Myelinverlust in weißen Hirnsubstanz mit zusätzlichen Schäden am Hippocampus und Thalamus. Gründung von Maus-Modellen der PVL wird erheblich erleichtern das Studium der Pathogenese der Erkrankung anhand der verfügbaren transgenen Mausstämme, Durchführung von Arzneimittelstudien in einem relativ hohen Durchsatz Weise Kandidat Therapeutika zu identifizieren und das Testen der Stammzelltransplantation mit Immunschwäche Mausstämme.
Protocol
Detaillierte Verfahren zu schaffen, Neugeborenen-Hirn-Trauma in P6 Mäusen:
- Postnatalen Tag 6 (P6) Mäuse anästhesiert mit indirekter Kühlung auf Eis bis hin zur Teilnahmslosigkeit auf schädliche Stimulation (tiefe Narkose).
- Nach der Reinigung der Haut mit Alkohol, ist eine Mittellinie ventral Einschnitt in der vorderen Hals.
- Unter einem Binokular ist der Bifurkation der rechten Arteria carotis communis durch leichtes Zurückziehen des M. omohyoideus und sternocleidomastoideus näherte.
- Die Blende rund um die Karotisscheide wird entfernt und der proximalen inneren Ast aus dem nahe gelegenen Vagusnerv und sympathischen Ganglien mit einem Haken isoliert. Die A. carotis interna wird dann geätzt mit einer ätzenden Spitze.
- Nach Verätzungen, wird der Hautschnitt vernäht, und das Tier warm gehalten, bis sie vollständig wach und kehrte dann nach der Staumauer.
- Eine Stunde nach der Ligation wird das Tier in einer geschlossenen Kammer mit Stickstoff bis zu einem Niveau von 6,0% O 2 erreicht ist infundiert platziert. Das Tier wird dann 35 min Hypoxie ausgesetzt.
- Nach Hypoxie Exposition, erholt sich der Mauszeiger auf einem Heizkissen (33 ° C) für 30 min und dann ist es, den Damm zurück. Zur Erstellung von Hirn-Trauma mit kombinierter Hypoxie / Ischämie und Infektion / Entzündung, ist das Tier dann intraperitoneal mit 0,015 ml Lipopolysaccharid (LPS, 1 mg / kg) injiziert.
- Vier Tage post-hypoxia/ischemia sind Mäuse mit indirekter Kühlung auf Eis bis zu dem Punkt der Reaktion auf Schmerzreize, dann mit Kochsalzlösung und dann 4% Paraformaldehyd perfundiert. Brains entfernt und cryoprotected.
Abbildung 1. Charakterisierung von Hirn-Trauma in der hypoxisch / ischämischen Mausmodell mit H & E Färbung. Es ist eine fokale Nekrose (Pfeile) in der weißen Hirnsubstanz ipsilateral (A) zu der Carotis-Ligation, im Vergleich zu der kontralateralen zerebralen weißen Substanz (B). Ipsilateral Nekrose und Schwerpunkte Mikroinfarkten sind im Hippocampus (C) und Thalamus (D) in den Gehirnen mit ipsilateralen zerebralen weißen Substanz Verletzungen beobachtet.
Repräsentative Ergebnisse und Fakten:
Mausmodelle von PVL mit Hypoxie / Ischämie und / oder Infektion / Entzündung durch einseitige carotis Ligation durch die Exposition gegenüber Hypoxie und Injektion von LPS gefolgt erreicht. Wir definieren die neue Maus-Modelle als geeignete PVL-Modelle. Neuropathologische Untersuchung des koronalen Abschnitte mit Hämatoxylin-und Eosin (H & E) durch das ganze Vorderhirn Kirchenfenster zeigt fokale Nekrosen in der zentralen weißen Substanz des zerebralen Hemisphäre ipsilateral zur Carotis-Ligation (Abb. 1A), mit relativer Aussparung von Neuronen in der darüber liegenden Großhirnrinde zur kontralateralen zerebralen weißen Substanz (Abb. 1B) verglichen. In den Mittelpunkt nekrotischen weißen Substanz, gibt es Zunahme der Zelldichte, bestehend aus Makrophagen und reaktiven Astrozyten markiert, wie es charakteristisch für die menschliche Mittelpunkt PVL. In der kontralateralen zentralen weißen Substanz, die oligodendroglialen Kerne in faszikulären-like Bündeln angeordnet; dieser Architektur ist vollständig durch die fokale Nekrosen auf der ipsilateralen Seite gestört. Zu beachten ist, beobachten wir auch ipsilateral Nekrose im Hippocampus (Abb. 1C) und Thalamus (Schwerpunkt Mikroinfarkten) (Abb. 1D) in den Gehirnen mit ipsilateralen zerebralen weißen Substanz Verletzungen. Menschliche PVL auch nicht in völliger Isolation auftreten, von begleitenden grauen Substanz Läsionen. Das Markenzeichen von PVL ist die relative, wenn auch nicht vollständig, Schonung der Hirnrinde, die über dem verletzten weißen Substanz - ein Feature, das wir glauben, ist in unseren Mausmodellen.
Abbildung 2. Scoring Skala von 0-5 für die Beurteilung der weißen Substanz Verletzungen durch MBP oder O1 in Mausmodellen der periventrikuläre Leukomalazie.
Unsere Maus-Modellen zeigen, Merkmale von PVL sowohl auf phänotypischer und molekularer Ebene. Wir haben immunzytochemische Nachweis von Myelin basisches Protein (MBP) oder O1-Antigen verwendet werden, um Verletzungen zu bewerten, haben festgestellt, eine Standard-Skala von 0 bis 5, um die weiße Substanz Verletzungen (Abb. 2) Gäste, und haben aus der weißen Substanz Pathologie (Abb. . 3). In jüngerer Zeit hat eine nicht vorgespannte stereologische Assay wurde implementiert, um für die erste semi-quantitative Methode zu ersetzen. Darüber hinaus testen für korrelative Auswirkungen der weißen Substanz Verletzungen auf funktionelle Ergebnisse haben wir Verhaltenstests für Motorik durchgeführt. Wir haben gezeigt, dass die Mäuse auffällige motorische Defizite aufweisen bei P10-21 nach Hypoxie / Ischämie und LPS auf P6. Wir haben Bewertungskriterien mit einer Skala von 0-4 gegründet, um kontralateralen Extremität Dysfunktion bei verletzten Mäuse definieren auf P10-21. In der Regel können normale Mäuse huschen bis 30 ° Neigung (Score von 4) und erklimmen einen 45 ° Neigung ohne zu gleiten (score of 3). Verletzte Mäuse haben niedrigere Werte in Korrelation mit dem Grad der weißen Substanz Verletzungen.
Abbildung 3. Charakterisierung der weißen Substanz Verletzungen durch MBP oder O1 Färbung und der Myelin-Struktur durch elektronenmikroskopische (EM). MBP und O1 Färbung zeigen Myelinverlust in weißen Hirnsubstanz ipsilateral zur Ligation, im Vergleich zu kontralateralen weißen Substanz. EM Untersuchung zeigt myelinisierte Axone in weißen Hirnsubstanz kontralateral zur Ligation und entartete Gewebe in ipsilateralen weißen Substanz.
Wir gehen davon aus, dass die Errichtung der neuen Maus-Modellen der PVL wird uns erlauben, spezifische Mechanismen der PVL-wie Verletzungen der unreifen Gehirn zu studieren. Wir werden uns mit Pathogenese Verwendung von transgenen Mauslinien, die Rolle einzelner Moleküle von Interesse zu untersuchen und zu bewerten Ziele der Neuroprotektion.
Discussion
Eine Verletzung des sich entwickelnden Gehirns führt zu verheerenden neurologischen Folgen. Auffallend ist das Muster der perinatalen Hirnschädigung stark altersabhängig. In Neugeborenen, es betrifft vor allem Großhirnrinde mit charakteristischen Verlust von Nervenzellen. Doch bei Frühgeborenen, sie selektiv wirkt weißen Hirnsubstanz mit prominenten Verletzungen zu entwickeln Oligodendrozyten, bezeichnet eine Störung periventrikuläre Leukomalazie (PVL). Die Größenordnung des Problems der Hirnschädigung in der Frühgeborenen ist außergewöhnlich. Frühgeburt und verbesserte Neugeborenen-Intensivstation zu knapp 90% des Überlebens der 13 Millionen Frühgeborenen weltweit (rund 56.000 in den USA) geboren jährlich mit einem Geburtsgewicht unter 1500 Gramm, also sehr niedrigen Geburtsgewicht Säuglinge geführt. Etwa 10% der Überlebenden später zeigen Zerebralparese und ca. 50% haben kognitive und Verhaltenstherapie Defizite. PVL ist die wichtigste Pathologie zugrunde liegenden Zerebralparese bei Frühgeborenen. Eine spezifische Therapie für PVL gibt es gegenwärtig, zum Teil wegen der Pathogenese ist nicht gut 1,2 verstanden.
Obwohl die Ätiologie der PVL ist multifaktoriell, perinatale Hypoxie / Ischämie mit mütterlicher intrauterine Infektion ist vermutlich eine der Hauptursachen für PVL werden. Ein hypoxischen / ischämischen Modell der PVL in der Ratte in P7 wurde bereits 3 festgelegt. Dieses Modell ist einzigartig, da es PVL bei Frühgeborenen ähnelt. Das Kennzeichen dieses Modells ist die selektive weißen Substanz Pathologie, im Gegensatz zu der Mehrheit der Schlaganfall-Modellen, die von grauen Substanz Infarkt gekennzeichnet sind. Allerdings sollten die Grenzen der hypoxisch-ischämischen Modell in der Ratte nicht zu übersehen. Erstens ist die Ätiologie der PVL oft multifaktoriell. Neben Hypoxie / Ischämie, mütterlich-fetalen Infektion / Entzündung ist stark mit PVL verbunden. So würde in Kombination Hypoxie / Ischämie und Infektion / Entzündung bewirkt größeres PVL-like-Modelle. Das Nagetier Alter, die am besten korreliert mit der menschlichen Entwicklung Zeit der größten Gefahr für PVL Läsionen (24-32 Schwangerschaftswochen) ist postnatale weil oligodendroglialen Differenzierung ist überwiegend eine postnatale Veranstaltung in Nagetieren. Da es unmöglich ist, eine mütterlich-fetalen Infektion / Entzündung in postnatalen Alters zu produzieren, wäre es sinnvoll, eine Infektion zu einem relevanten postnatalen Entwicklungsphase zu simulieren, um ein Nagetier Modell der PVL zu schaffen. Wir haben versucht, LPS-Injektion mit der hypoxischen / ischämischen Modell bei Mäusen P6 kombinieren, um mehr klinisch relevante PVL Läsionen zu erzeugen. Zweitens erfordert die optimale Proof-of-Concept-experimentellen Ansatz für eine ursächliche Rolle eines Moleküls die Verwendung von transgenen Mäusen, genetische Manipulationen sind viel schwieriger in der Ratte als in der Maus. So haben wir versucht, unsere experimentellen Modell der PVL aus der Ratte, die Maus zu konvertieren.
Mausmodelle von PVL wird dadurch wesentlich erleichtert 1) die Erforschung von Krankheiten Biologie und Pathogenese mit den verfügbaren transgenen Mausstämme, 2) Durchführung von Medikamentenstudien an Wirkstoffkandidaten mit therapeutischem Potenzial zu entdecken; 3) Prüfung des Nutzens der Stammzellen mit immundefizienten Mausstämmen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (RO1 NS059043 und RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anämie Research, Feldstein Medical Foundation und Shriners Hospitals for Children unterstützt.
Wir möchten Dr. David Genuss für seine Anregungen bedanken. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse zu WD von National Institutes of Health (RO1 NS059043 und RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, und Shriners Hospitals for Children unterstützt. Wir erklären, keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit diesem Artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
