Summary
हम periventricular (PVL) leukomalacia, प्रमुख periventricular सफेद बात घावों द्वारा विशेषता समयपूर्व शिशुओं में मस्तिष्क की चोट के माउस मॉडल की स्थापना की. Hypoxia / के साथ / प्रणालीगत संक्रमण के बिना ischemia PVL के प्राथमिक कारण हैं. एकतरफा मन्या ligation और / lipopolysaccharide इंजेक्शन के बिना के साथ hypoxia जोखिम P6 चूहों में PVL की तरह घावों बनाता है.
Abstract
हम periventricular leukomalacia (PVL) के माउस मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. PVL समयपूर्व शिशुओं और मस्तिष्क पक्षाघात का सबसे आम पूर्वपद में मस्तिष्क की चोट के प्रमुख रूप है. PVL periventricular प्रमुख oligodendroglial चोट के साथ सफेद पदार्थ नुकसान द्वारा विशेषता है. Hypoxia / प्रणालीगत संक्रमण / सूजन के साथ या बिना ischemia PVL के प्राथमिक कारण हैं. हम P6 चूहों का उपयोग करने के लिए hypoxia के साथ ischemia / की प्रेरण द्वारा या / एकतरफा मन्या endotoxin lipopolysaccharide (LPS) के इंजेक्शन के साथ या उसके बिना hypoxia के लिए जोखिम के बाद ligation के साथ प्रणालीगत संक्रमण सूजन के बिना नवजात मस्तिष्क की चोट के मॉडल बनाने के लिए. माइलिन बुनियादी (MBP) प्रोटीन या O1 और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म परीक्षा के immunohistochemistry हिप्पोकैम्पस और thalamus के लिए अतिरिक्त नुकसान के साथ मस्तिष्क सफेद मामले में प्रमुख माइलिन हानि दिखा. PVL के माउस मॉडल की स्थापना बहुत उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों, दवा परीक्षण के एक अपेक्षाकृत उच्च throughput उम्मीदवार चिकित्सात्मक एजेंटों की पहचान के तरीके में प्रवाहकत्त्व, और स्टेम सेल प्रत्यारोपण के परीक्षण इम्यूनो माउस उपभेदों का उपयोग कर का उपयोग रोग रोगजनन के अध्ययन की सुविधा होगी.
Protocol
P6 चूहों में नवजात मस्तिष्क चोट बनाने की विस्तृत प्रक्रिया:
- प्रसवोत्तर दिन 6 चूहों (P6) हानिकारक उत्तेजना (गहरी संज्ञाहरण) unresponsiveness के मुद्दे पर बर्फ पर अप्रत्यक्ष रूप से ठंडा करने के साथ anesthetized हैं.
- शराब के साथ त्वचा की सफाई के बाद, एक midline वेंट्रल चीरा पूर्वकाल गर्दन में किया जाता है.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सही आम मन्या धमनी के विभाजन धीरे omohyoid और sternocleidomastoid मांसपेशियों retracting द्वारा संपर्क किया है.
- मन्या म्यान के आसपास प्रावरणी हटा दिया है, और प्रॉक्सिमल आंतरिक शाखा पास वेगस तंत्रिका और एक हुक के साथ सहानुभूति ganglia से अलग है. आंतरिक मन्या धमनी तो एक cauterizing टिप का उपयोग cauterized है.
- दाग़ना के बाद, त्वचा चीरा sutured है, जानवर और गर्म रखा है जब तक पूरी तरह से जाग और तब बांध को लौट.
- एक घंटे के ligation के बाद, पशु एक मोहरबंद 6.0% 2 हे पहुँच जाता है की एक स्तर तक नाइट्रोजन के साथ संचार कक्ष में रखा गया है. जानवर तो hypoxia के 35 मिनट के लिए संपर्क में है.
- Hypoxia के जोखिम के बाद, माउस 30 मिनट के लिए एक हीटिंग पैड (33 डिग्री सेल्सियस) पर ठीक है और तब बांध के लिए लौट. संयुक्त hypoxia / ischemia और / संक्रमण और सूजन के साथ मस्तिष्क की चोट के निर्माण के लिए, पशु तो lipopolysaccharide की 0.015 मिलीग्राम (LPS, 1 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ intraperitoneally इंजेक्शन.
- चार post-hypoxia/ischemia दिन, चूहों unresponsiveness की बात करने के लिए बर्फ पर अप्रत्यक्ष रूप से हानिकारक उत्तेजनाओं, तो खारा और फिर paraformaldehyde 4% के साथ perfused को ठंडा करने के साथ anesthetized हैं. दिमाग हटा रहे हैं और cryoprotected.
चित्रा 1 / hypoxic इस्कीमिक एच एंड ई धुंधला के साथ माउस मॉडल में मस्तिष्क की चोट की विशेषता . मस्तिष्क सफेद मामले में फोकल परिगलन (तीर) (ए) मन्या ligation ipsilateral है contralateral मस्तिष्क सफेद पदार्थ (बी) की तुलना में,. Ipsilateral परिगलन और फोकल microinfarcts (सी) हिप्पोकैम्पस और thalamus ipsilateral मस्तिष्क सफेद बात की चोट के साथ दिमाग में (डी) में मनाया जाता है.
प्रतिनिधि परिणाम और आंकड़े:
PVL / hypoxia ischemia और / / या संक्रमण और सूजन के साथ माउस मॉडल एकतरफा मन्या hypoxia और LPS के इंजेक्शन के लिए जोखिम के बाद ligation के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. हम उपयुक्त PVL मॉडल के रूप में नए माउस मॉडल को परिभाषित कर रहे हैं. राज्याभिषेक पूरे अग्रमस्तिष्क के माध्यम से hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग वर्गों के neuropathological परीक्षा मन्या ligation (छवि 1A) ipsilateral मस्तिष्क गोलार्द्ध के मध्य सफेद मामले में न्यूरॉन्स के सापेक्ष में बख्शते साथ फोकल परिगलन, पता चलता है overlying मस्तिष्क प्रांतस्था contralateral मस्तिष्क सफेद पदार्थ (छवि 1B) की तुलना में. फोकल परिगलित सफेद मामले में, वहाँ मैक्रोफेज और प्रतिक्रियाशील astrocytes से मिलकर cellularity में वृद्धि के रूप में चिह्नित है, के रूप में फोकल मानव PVL की विशेषता है. Contralateral केंद्रीय सफेद बात में, oligodendroglial नाभिक fascicular तरह बंडलों में व्यवस्थित कर रहे हैं, इस वास्तुकला ipsilateral तरफ फोकल परिगलन द्वारा पूरी तरह से बाधित है. ध्यान से, हम भी ipsilateral मस्तिष्क सफेद बात की चोट के साथ दिमाग में हिप्पोकैम्पस में ipsilateral परिगलन (छवि 1C) और thalamus (केन्द्र microinfarcts) (छवि 1D) का पालन करें. मानव PVL भी पूरा अलगाव में ग्रे बात घावों के साथ से नहीं होती है. बानगी PVL के रिश्तेदार है, हालांकि नहीं पूरा, प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के घायल सफेद बात overlying बख्शते - एक विशेषता है कि हमें विश्वास है कि हमारे माउस मॉडल में मौजूद है.
चित्रा 2 0-5 की MBP या O1 द्वारा periventricular leukomalacia के माउस मॉडल में सफेद पदार्थ की चोट का मूल्यांकन करने के लिए स्कोरिंग पैमाने.
हमारे माउस मॉडल दोनों प्ररूपी और आणविक स्तर पर PVL की विशेषताओं दिखाओ. हम माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP) या O1 प्रतिजन के immunocytochemical पता लगाने का इस्तेमाल किया है को चोट का मूल्यांकन करने के लिए, 0 से 5 के लिए एक मानक पैमाने पर स्थापित करने के लिए सफेद पदार्थ चोट स्कोर (छवि 2), और सफेद बात विकृति (चित्र विशेषता 3.). हाल ही में, एक गैर पक्षपातपूर्ण stereological परख प्रारंभिक अर्द्ध मात्रात्मक पद्धति के लिए विकल्प लागू किया गया है. इसके अलावा, कार्यात्मक परिणामों पर सफेद पदार्थ की चोट के correlative प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए, हम मोटर समारोह के लिए व्यवहार परीक्षण प्रदर्शन किया है. हमने दिखा दिया है कि चूहों P10-21 निम्नलिखित hypoxia / ischemia P6 प्लस LPS में हड़ताली मोटर घाटे एक्ज़िबिट. हम 0-4 के पैमाने के साथ स्कोरिंग मापदंड की स्थापना की है घायल चूहों में P10 पर contralateral अंग शिथिलता को परिभाषित-21. आमतौर पर, सामान्य चूहों दौड़ एक 30 ° इच्छा (4 के स्कोर) और एक 45 चढ़ाई कर सकते हैं ° फिसलने के बिना इच्छा (3 के स्कोर). घायल चूहों संबंध में सफेद पदार्थ की चोट की डिग्री के साथ कम स्कोर है.
चित्रा 3 सफेद बात की चोट के MBP या O1 और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (EM) द्वारा माइलिन संरचना धुंधला द्वारा विशेषता है . MBP और O1 धुंधला दिखाने के मस्तिष्क सफेद मामले में माइलिन हानि ligation के लिए ipsilateral contralateral सफेद बात के लिए की तुलना में. EM परीक्षा मस्तिष्क सफेद मामले में myelinated axons ligation के लिए contralateral से पता चलता है और ipsilateral सफेद मामले में ऊतक degenerated.
हम आशा करते है कि PVL के नए माउस मॉडल की स्थापना हमें PVL की तरह चोट के विशिष्ट तंत्र अपरिपक्व मस्तिष्क के लिए अध्ययन करने के लिए अनुमति देगा. हम ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग करने के लिए ब्याज की अलग - अलग अणुओं की भूमिका की जांच और neuroprotection के लक्ष्य का मूल्यांकन के रोगजनन को संबोधित करेंगे.
Discussion
विकासशील मस्तिष्क चोट विनाशकारी स्नायविक परिणाम की ओर जाता है है. Strikingly, प्रसवकालीन मस्तिष्क की चोट के पैटर्न अत्यधिक आयु पर निर्भर है. अवधि शिशुओं में, यह मुख्यतः विशेषता neuronal नुकसान के साथ प्रमस्तिष्क प्रांतस्था को प्रभावित करता है. हालांकि, समयपूर्व शिशुओं में, यह चुनिंदा विकासशील oligodendrocytes प्रमुख चोट के साथ मस्तिष्क सफेद बात को प्रभावित करता है, एक विकार periventricular leukomalacia (PVL) करार दिया. समय से पहले शिशु के मस्तिष्क में चोट की समस्या की भयावहता असाधारण है. समयपूर्व प्रसव और बेहतर नवजात गहन देखभाल 13 मिलियन समय से पहले दुनिया भर में शिशुओं (लगभग संयुक्त राज्य अमेरिका में +५६०००) 1500 ग्राम से कम birthweight, यानी, बहुत कम वजन जन्म शिशुओं के साथ वार्षिक जन्म के अस्तित्व के लगभग 90% करने के लिए नेतृत्व किया है. बचे के लगभग 10% के बाद प्रदर्शन मस्तिष्क पक्षाघात और लगभग 50% संज्ञानात्मक और व्यवहार घाटे है. PVL सबसे महत्वपूर्ण समय से पहले शिशुओं में मस्तिष्क विकृति अंतर्निहित मस्तिष्क पक्षाघात है. PVL के लिए कोई विशिष्ट चिकित्सा वर्तमान भाग में मौजूद है, क्योंकि रोगजनन में अच्छी तरह से नहीं किया गया है 1,2 समझा.
हालांकि PVL के एटियलजि multifactorial है, प्रसवकालीन hypoxia / मातृ अंतर्गर्भाशयी संक्रमण के साथ ischemia PVL का एक प्रमुख कारण माना जाता है. P7 पर चूहे में PVL के hypoxic / इस्कीमिक मॉडल पहले 3 स्थापित किया गया है. इस मॉडल में अद्वितीय है कि यह समय से पहले शिशुओं में PVL जैसा दिखता है. इस मॉडल की पहचान चयनात्मक सफेद बात विकृति स्ट्रोक मॉडल है कि ग्रे मामले रोधगलन द्वारा विशेषता है के बहुमत के विपरीत है. हालांकि, चूहे में hypoxic इस्कीमिक मॉडल की सीमाओं की अनदेखी नहीं की जानी चाहिए. सबसे पहले, PVL के एटियलजि अक्सर multifactorial है. / Hypoxia ischemia, मातृ भ्रूण संक्रमण / सूजन के अलावा जोरदार PVL के साथ जुड़ा हुआ है. इस प्रकार, संयुक्त / hypoxia ischemia और संक्रमण / सूजन की संभावना अधिक PVL की तरह मॉडल बनाने चाहते हैं. कृंतक उम्र है कि सबसे अच्छा PVL घावों (गर्भ के 24-32 सप्ताह) के लिए सबसे बड़ा खतरा के मानव विकास की अवधि के साथ संबद्ध प्रसवोत्तर है क्योंकि oligodendroglial भेदभाव मुख्य रूप से कृन्तकों में प्रसव के बाद घटना है. जैसा कि यह असंभव है एक मातृ - भ्रूण / प्रसवोत्तर उम्र में संक्रमण सूजन का उत्पादन है, यह उचित हो सकता है एक प्रासंगिक प्रसव के बाद विकास के चरण में PVL की एक कृंतक मॉडल बनाने के लिए एक संक्रमण अनुकरण. हम P6 पर चूहों में hypoxic / इस्कीमिक मॉडल के साथ LPS इंजेक्शन गठबंधन करने के लिए, अधिक नैदानिक प्रासंगिक PVL घावों का उत्पादन करने की मांग की है. दूसरा, इष्टतम सबूत की अवधारणा एक अणु के एक प्रेरणा भूमिका के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग आवश्यक है, आनुवंशिक जोड़तोड़ माउस में बहुत से चूहे में कठिन हैं. इस प्रकार, हम के लिए माउस को चूहे से हमारे PVL की प्रयोगात्मक मॉडल बदलने की मांग की है.
2) दवा परीक्षण के चालन के लिए चिकित्सीय क्षमता के साथ उम्मीदवार के एजेंट की खोज, 3) स्टेम कोशिकाओं immunodeficient माउस उपभेदों का उपयोग की उपयोगिता का परीक्षण PVL के माउस मॉडल बहुत 1) रोग जीव विज्ञान और रोगजनन उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग कर के अध्ययन की सुविधा होगी.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS059043 RO1 और ES015988 RO1), राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी, एनीमिया, अनुसंधान Feldstein मेडिकल फाउंडेशन के लिए रॉश फाउंडेशन, और बच्चों के लिए Shriners अस्पताल से अनुदान द्वारा समर्थित भाग में है.
हम अपने सुझाव के लिए डॉ. डेविड खुशी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के हिस्से में WD स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान (NS059043 RO1 और ES015988 RO1), राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी, और बच्चों के लिए श्राइनर्स हॉस्पिटल के द्वारा समर्थित किया गया. हम इस लेख से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धा हितों घोषणा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
