Summary
Abbiamo stabilito modelli murini di leucomalacia periventricolare (PVL), il danno cerebrale predominante in neonati prematuri caratterizzata da lesioni della sostanza bianca periventricolare. Ipossia / ischemia con / senza infezione sistemica sono le cause primarie del PVL. Unilaterale legatura carotidea e l'esposizione ipossia con / senza iniezione lipopolisaccaride crea PVL-come le lesioni nei topi P6.
Abstract
Abbiamo descritto un protocollo per stabilire modelli murini di leucomalacia periventricolare (PVL). PVL è la forma predominante di danno cerebrale nei neonati prematuri e l'antecedente più comuni di paralisi cerebrale. PVL è caratterizzata da danno della sostanza bianca periventricolare con importanti lesioni oligodendrogliali. Ipossia / ischemia, con o senza infezione sistemica / infiammazione sono le cause primarie di PVL. Noi usiamo P6 topi per creare modelli di danno cerebrale neonatale con l'induzione di ipossia / ischemia, con o senza infezione sistemica / infiammazione con legatura unilaterale della carotide seguiti da esposizione all'ipossia, con o senza l'iniezione di endotossina lipopolisaccaride (LPS). Immunoistochimica della proteina basica della mielina (MBP) o O1 e esame al microscopio elettronico mostrano perdita prominente mielina cerebrale nella materia bianca, con ulteriore danno per l'ippocampo e talamo. Creazione di modelli murini di PVL faciliterà notevolmente lo studio della patogenesi della malattia utilizzando disponibili ceppi di topi transgenici, la conduzione di prove della droga in maniera velocità relativamente alta di identificare gli agenti terapeutici candidato, e la sperimentazione di trapianto di cellule staminali utilizzando ceppi di topi immunodeficienza.
Protocol
Le procedure dettagliate di creare danni cerebrali neonatali nei topi P6:
- Postnatale giorno 6 (P6) sono topi anestetizzati con raffreddamento indiretto sul ghiaccio fino al punto di non responsività agli stimoli nocivi (anestesia profonda).
- Dopo la pulizia della pelle con l'alcol, una incisione mediana ventrale è fatto in parte anteriore del collo.
- Sotto un microscopio da dissezione, la biforcazione della carotide comune destra si avvicina con delicatezza ritraendo i muscoli omoioideo e sternocleidomastoideo.
- La fascia attorno alla guaina carotidea viene rimosso e il ramo prossimale interna isolata dal nervo vago e vicine gangli simpatici con un gancio. L'arteria carotide interna viene cauterizzato con una punta di cauterizzare.
- A seguito di cauterizzazione, l'incisione cutanea viene suturata, e l'animale è tenuto caldo fino a quando completamente sveglio e poi tornò alla diga.
- Un'ora dopo la legatura, l'animale è posto in una camera sigillata infuso con azoto fino ad un livello del 6,0% si raggiunge O 2. L'animale viene poi esposta a 35 minuti di ipossia.
- Dopo l'esposizione all'ipossia, recupera il mouse su una piastra elettrica (33 ° C) per 30 minuti e poi viene restituito alla diga. Per la creazione di lesioni cerebrali con ipossia combinato / ischemia e di infezione / infiammazione, l'animale viene quindi iniettato per via intraperitoneale con 0,015 ml di lipopolisaccaride (LPS, 1 mg / kg).
- Quattro giorni post-hypoxia/ischemia, i topi vengono anestetizzati con raffreddamento indiretto sul ghiaccio fino al punto di non responsività agli stimoli nocivi, poi perfusi con soluzione salina e poi paraformaldeide 4%. Cervelli sono stati rimossi e crioprotetti.
Figura 1. Caratterizzazione di lesioni cerebrali nel ipossico / ischemico modello di topo con H & E colorazione. Vi è necrosi focale (frecce) nella materia bianca cerebrale ipsilaterale (A) per la legatura della carotide, rispetto al controlaterale materia cerebrale bianca (B). Necrosi ipsilaterale e microinfarti focali sono osservati nell'ippocampo (C) e il talamo (D) nel cervello con ipsilaterale lesioni della sostanza bianca cerebrale.
Risultati Rappresentante e figure:
Modelli murini di PVL con ipossia / ischemia e / o infezione / infiammazione si ottengono unilaterale legatura carotidea seguita da esposizione a ipossia e l'iniezione di LPS. Stiamo definendo i modelli del mouse nuovi modelli adatti PVL. Esame neuropatologico di sezioni coronali colorate con ematossilina-and-eosina (H & E) attraverso il proencefalo intero rivela necrosi focali nella materia bianca centrale dell'emisfero cerebrale ipsilaterale alla legatura carotidea (Fig. 1A), con relativo risparmio di neuroni in la corteccia cerebrale sovrastante rispetto al controlaterale materia cerebrale bianca (Fig. 1B). Nella questione focale necrotico bianco, c'è un marcato aumento della cellularità costituita da macrofagi e di astrociti reattivi, come è caratteristica della focale PVL umano. Nel controlaterale materia bianca centrale, i nuclei sono disposti in oligodendrogliali fascicolare-come fagotti, questa architettura è completamente distrutto dalla necrosi focale sul lato omolaterale. Da segnalare, inoltre osservare necrosi ipsilaterale nell'ippocampo (Fig. 1C) e il talamo (microinfarti focale) (Fig. 1D) nel cervello con ipsilaterale lesioni della sostanza bianca cerebrale. Umano anche PVL non si verifica in completo isolamento dall'ambiente accompagnano lesioni della sostanza grigia. Il segno distintivo della PVL è il relativo, anche se non completo, risparmiando della corteccia cerebrale sovrastante la materia bianca feriti - una caratteristica che noi crediamo è presente nei nostri modelli murini.
Figura 2. Scala punteggio di 0-5 per la valutazione delle lesioni della sostanza bianca o MBP da O1 in modelli murini di leucomalacia periventricolare.
I nostri modelli murini mostrano caratteristiche di PVL, sia a livello fenotipico e molecolare. Abbiamo usato il rilevamento immunocitochimica della proteina basica della mielina (MBP) o O1-antigene per valutare lesioni, hanno stabilito una scala standard da 0 a 5 a segnare il danno sostanza bianca (Fig. 2), e hanno caratterizzato la sostanza bianca patologia (Fig. . 3). Più recentemente, un test non-polarizzato stereological è stato implementato per sostituire il primo metodo semi-quantitativo. Inoltre, per testare gli effetti correlativo di lesioni della sostanza bianca sugli esiti funzionali, abbiamo svolto test comportamentali per la funzione motoria. Abbiamo dimostrato che i topi mostrano deficit motori colpendo P10-21 ipossia seguente / ischemia più LPS in P6. Abbiamo stabilito i criteri di punteggio con una scala di 0-4 per definire la disfunzione arto controlaterale nei topi feriti a P10-21. In genere, i topi normali può scorrazzano in pendenza di 30 ° (punteggio 4) e salire di 45 ° pendenza senza scivolare (punteggio di 3). Topi feriti hanno punteggi più bassi in correlazione con i gradi di lesioni della sostanza bianca.
Figura 3. Caratterizzazione di lesioni della sostanza bianca o MBP da O1 colorazione e la struttura della mielina al microscopio elettronico (EM). MBP e la perdita di colorazione O1 spettacolo mielina nella materia bianca cerebrale ipsilaterale alla legatura, rispetto al controlaterale della sostanza bianca. Esame EM mostra assoni mielinizzati in materia bianca cerebrale controlaterale alla legatura e tessuto degenerato in ipsilaterale sostanza bianca.
Noi prevediamo che la creazione dei modelli nuovo mouse di PVL ci permetterà di studiare meccanismi specifici di PVL-come lesioni al cervello immaturo. Ci si occuperà patogenesi utilizzando ceppi di topi transgenici per esaminare il ruolo delle singole molecole di interesse e valutare gli obiettivi di neuroprotezione.
Discussion
Infortunio per lo sviluppo del cervello porta a devastanti conseguenze neurologiche. Sorprendentemente, il modello di danno cerebrale perinatale è altamente dipendente dall'età. In neonati a termine, colpisce prevalentemente corteccia cerebrale con perdita di neuroni caratteristici. Tuttavia, nei neonati prematuri, che attacca selettivamente la sostanza bianca cerebrale con danni importanti a oligodendrociti via di sviluppo, un disordine chiamato leucomalacia periventricolare (PVL). L'entità del problema dei danni cerebrali nei neonati prematuri è straordinario. Parto prematuro e una migliore terapia intensiva neonatale hanno portato a quasi il 90% di sopravvivenza dei 13 milioni di neonati prematuri in tutto il mondo (circa 56.000 negli Stati Uniti) nasce ogni anno con un peso alla nascita inferiore a 1500 grammi, vale a dire, molto basso peso alla nascita i neonati. Circa il 10% dei sopravvissuti in seguito mostra la paralisi cerebrale e circa il 50% ha deficit cognitivi e comportamentali. PVL è il più importante paralisi cerebrale sottostante patologia cerebrale nei neonati prematuri. Nessuna terapia specifica per PVL esiste attualmente, in parte perché la patogenesi non è stato ben compreso 1,2.
Sebbene l'eziologia della PVL è multifattoriale, perinatale ipossia / ischemia con infezione materna intrauterina è pensato per essere una causa primaria di PVL. Un modello ipossico / ischemico della PVL nel ratto a P7 è stato stabilito precedentemente 3. Questo modello è unico in quanto assomiglia PVL nei neonati prematuri. La caratteristica di questo modello è selettiva sostanza bianca patologia, in contrasto con la maggior parte dei modelli ictus che sono caratterizzati da infarto materia grigia. Tuttavia, le limitazioni del modello ipossico-ischemica nel ratto non deve essere trascurato. In primo luogo, l'eziologia della PVL è spesso multifattoriale. Oltre a ipossia / ischemia, materno-fetale dell'infezione / infiammazione è fortemente associato con PVL. Così, insieme infiammazione ipossia / ischemia e di infezione / probabilmente creare modelli più PVL-like. L'età roditore che meglio si correla con il periodo dello sviluppo umano di maggior rischio per le lesioni PVL (24-32 settimane di gestazione) è post-natale, perché la differenziazione oligodendrogliali è prevalentemente un evento postnatale nei roditori. Poiché è impossibile produrre un materno-fetale dell'infezione / infiammazione in età post-natale, sarebbe ragionevole per simulare un'infezione ad una rilevante fase di sviluppo post-natale per creare un modello di roditore di PVL. Abbiamo cercato di unire l'iniezione LPS con il modello ipossico / ischemico nei topi a P6, di produrre lesioni PVL più clinicamente rilevante. In secondo luogo, l'ottimale proof-of-concept approccio sperimentale per un ruolo causale di una molecola richiede l'uso di topi transgenici, manipolazioni genetiche sono molto più difficili nel ratto che nel topo. Così, abbiamo cercato di convertire il nostro modello sperimentale di PVL dal topo al mouse.
Modelli murini di PVL agevolerà notevolmente 1) lo studio della biologia della malattia e patogenesi utilizzando disponibili ceppi di topi transgenici, 2) conduzione di studi farmaco per scoprire agenti candidato potenziale terapeutico; 3) verifica dell'utilità delle cellule staminali utilizzando ceppi di topi immunodeficienti.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è in parte supportato anche da finanziamenti National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Nazionale Sclerosi Multipla, la Roche Fondazione per la ricerca anemia, Feldstein Medical Foundation, e Shriners Hospitals for Children.
Vorremmo ringraziare il Dr. Pleasure David per i suoi suggerimenti. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalle concessioni a WD dal National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Società Nazionale Sclerosi Multipla, e Shriners Hospitals for Children. Si dichiara non interessi contrastanti relativi a questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. Progress in periventricular leukomalacia. Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
