Summary
Den här artikeln illustrerar den blommiga-dip metoden
Abstract
Den förmåga att introducera främmande gener i en organism är grunden för modern biologi och bioteknik. I modellen blommande växt
Protocol
I. blom-dip omvandlingen av Arabidopsis thaliana
- Ungefär en månad före omvandling, sugga Arabidopsis frön på 4 till 8 krukor (5 cm fyrkantiga krukor) med ca 10-15 plantor per pott. För anläggningar med normal fertilitet, kommer 4 krukor med plantor per plasmid konstruktion vara tillräckligt. Om man har att förändra muterade Arabidopsis med nedsatt fertilitet, öka antalet krukor därefter.
- Plantorna odlas under normala förhållanden (16 tim ljus och 8 timmar mörker vid 22 ° C). Om växter som odlas under kortare dag eller lägre temperatur, kommer de ta längre tid att blomma och längre för att vara redo för förändring. Bra anläggning vård kommer att se friska växter, som är väsentliga för framgångsrika omvandling.
- När plantorna har precis bultade och börjat blomma. De är nu redo för förändring. För att öka omvandlingseffektiviteten, 3-4 dagar före omvandlingen, trimma bort de största blomställningen skjuter så fort de har bultade för att uppmuntra fler sekundära skjuta formation. Vattna blommorna dagen innan omvandlingen. Detta säkerställer att marken inte kommer att suga upp för mycket infiltration media under blommig-doppning.
- Två dagar före omvandling, inympa 40ml LB med lämpliga antibiotika (i fallet med pTSO2:: Gus, 50 mikrogram / ml Kanamycin) med Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 bär pTSO2:: GUS konstruktion. Den pTSO2:: Gus är klonade i pBIN20 vektor som besitter nptII-genen som ger resistens mot Kanamycin 3. Växa över natten i en skakande inkubator vid 28-30 ° C.
- Följande dag, överföring 8ml av natten kultur i 400ml LB innehåller 50 mikrogram / ml Kanamycin. Växa över natten i en skakande inkubator vid 28-30 ° C.
- På dagen för omvandling, då OD 600 av Agrobacterium kulturen når cirka 0,8 (OD 600 mellan 0,5 till1 är acceptabla), snurra ner Agrobacterium natten kulturen på under 8 minuter vid 5000rpm.
- Resuspendera Agrobacterium pelleten i 1 l (liter) infiltration media (10 mM MgCl 2, 5% sackaros, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0,3% silwet L-77, 1x Gamborg s vitamin lösning och autoklaveras vatten). Mediet behöver inte autoklaveras, men måste göras färsk. Häll 1 L Agrobacterium innehåller infiltration mediet till en skål (till exempel 8 "x15" x2 "pyrexglas maträtt).
- Vänd potten (växter kommer inte ramlar av) och doppa hela antenn delar av plantorna i infiltration lösning, håll i 5 minuter en pott på en gång. Även om alla antenn delar av växten är nedsänkt i infiltrationen medium, inte låta jorden suga upp några av infiltration media för att minska risken för svamptillväxt på jorden.
- Efter doppning, placera alla doppade krukor på sin sida på flera lager hushållspapper i ett magasin. Den pappershanddukar insupa tillgång mängd infiltration medier. Täck facket med plastfolie för att säkerställa hög luftfuktighet. Placera magasinet i växternas tillväxt kammare.
- Följande dag, ta bort plasthöljet och pappershanddukar och krukor plats upprätt. Vattna inte dessa växter i fyra till fem dagar. Efteråt behålla växterna normalt tills de sätter frön och samla frön i bulk.
- Häll ut på plattor (150x15mm petriskål) med MS medium som innehåller 50 mikrogram / ml Kanamycin (vikt 2,2 g Murashige och Skoog basala salt utan vitamin, lös upp i 500 ml vatten, pH till 5,8 med 1M NaOH, tillsätt 4 gram agar, autoklav, sval och lägga Kanamycin till 50 mikrogram / ml slutkoncentration). Plattorna hålls i 4 ° C tills det behövs.
- För att välja för antibiotikaresistenta transgena växter behöver en till skärm 20.000 frön på minimum. 0,1 gram är ca 5000 frön. Vikt och uppskatta mängden frön.
- Sterilisera frön av tvätta dem i 15 ml Falcon rör med 70% etanol i 30 sekunder. Tvätta fröna med sterilt vatten en gång. Blötlägg fröna i 30 sekunder i en lösning med 1:10 utspädning av lagra-köpt 5% blekmedel (Clorox). Skölj fröna med sterilt vatten tre till sex gånger. I sterila huva, spred pipett ca 5000 frön på varje MS (Kanamycin) platta, fröna jämnt på plattan, täta plattor med Micropore 3M tejp för att undvika kontaminering.
- Inkubera plattorna vid 4 ° C i mörker i 3-4 dagar, sedan överföra plattorna till en kammare (kan vara samma växtligheten kammare). Efter cirka 14 dagar, transgena plantor stannar grönt men icke-transgena de vänder bleka och döende. Överför transgena plantor till mark genom att fördröja att dra roten ur på medellång och placerade dem i jord.
II. Undersöka pTSO2:: GUS uttryck mönster
- Harvest pTSO2:: GUS transgena plantor och lägg dem i kallt 90% aceton i ett glas scintillation flaska eller rör mikrofugrörsom hålls på is. Polystyren mikrotiterplattor (ej polypropen) kan också användas om man analyserar ett stort antal prover.
- Efter alla prover skördas, placera rören vid rumstemperatur i 20 minuter. Under denna tid utgör färska fläckar buffert utan x-Gluc (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanid, 2mm kaliumferricyanid) och placera på is.
- Ta aceton från de prover och tillsätt färgning buffert.
- Fyll x-Gluc färglösningen (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanid, 2mm kaliumferricyanid, 2mm x-gluc). Ta bort fläckar buffert från prover och lägga till färgning buffert som innehåller x-Gluc med proverna.
- Infiltrera prov under ett vakuum i 15 till 20 minuter. Släpp vakuum långsamt och kontrollera att alla prover sjunker under ytan av färglösningen. Om nödvändigt, upprepa infiltration tills alla prover sjunker efter att vakuum är släppt.
- Inkubera prov vid 37 ° C över natten i färgning buffert med X-Gluc.
- Ta prov från inkubatorn och ta bort fläckar buffert. Tvätta proverna i successiva etanol-serien (20%, 35% och 50% etanol) i rumstemperatur i 30 minuter varje ändring.
- Fäst vävnaderna i FAA fixativ (50% etanol, 5% formaldehyd, 10% Ättiksyra, resten vatten) i 30 minuter i rumstemperatur. Ta bort FAA och tillsätt 70% etanol. Vid denna punkt vävnader kan visualiseras och fotograferade under ett dissekera mikroskop utrustat med en digitalkamera. En mörk blå färg visar var TSO2 uttrycks (Figur 1). Alternativt kan vävnaderna förvaras vid 4 ° C för senare granskning.
Figur 1 pTSO2:.: Gus uttryck i transgena plantor (A), laterala rötter (B) och rot spets (C). Observera att TSO2 främjare är mycket aktiv i unga och dela vävnader. Den sporadiska uttryck mönster visas i (C) är typiskt av gener som uttrycks i vissa faser cellcykeln.
Representativa resultat
När du gjort korrekt, bör omvandlingseffektiviteten vara ca 0,1-0,2%. I ett annat ord, bör man få 5-10 transgena plantor genom screening varje 5000 frön. I genomsnitt kan ca 100 transgena linjerna uppnås genom att omvandla 4 krukor av vild-typ växter.
För transgena plantor som innehåller pTSO2:: Gus konstruera 3, mörkt blå färg som speglar GUS verksamheten finns i aktivt delande celler, inklusive unga blad, skjuta apex, rot spets, och lateral rot primordia (Figur 1). Den icke-enhetlig sporadiska mönster är karakteristiskt för cellcykeln fas-specifika uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiviteten i omvandlingen bestäms av många olika faktorer, som diskuteras nedan:
- Hälsan hos växter och deras ålder är av största vikt. Ungefär en månad gamla anläggningar som producerar många omogna blommiga knoppar är idealiska. Trimning av primära skott för att stimulera sekundära skjuta bildandet 3-4 dagar innan förvandlingen kommer att öka omvandlingseffektiviteten. Äldre anläggningar kommer att ge upphov till transformants men i lägre takt.
- Fertilitet av anläggningarna är viktigt. Om man har för att förvandla mutanter med nedsatt fertilitet, kommer många fler anläggningar att behövas för doppning.
- 0,3% Silwet L-77 tensid i infiltration buffert anses nödvändig.
- Doppning tid i infiltrationen medier bör vara minst 5 minuter.
- För att minska svampkontamination bör flera åtgärder vidtas. Först måste man undvika att jorden insupa infiltration medier genom att vattna plantorna / jord en dag innan infiltration. Doppa inte jorden i infiltrationen medier. För det andra, ta bort plastskyddet och hushållspapper inom 24 timmar efter infiltration för att minska fukt. Det tredje, inte vattenväxter förrän 5 dagar efter infiltration.
Beroende på specifika plasmiden konstruera, kan urvalsmetoder av transgena växter varierar. Om en plasmidvektorn bär Bar (bialaphos acetyltransferas) markörgen som ger resistens mot glufosinatammonium, kan en anläggning direkt fröna i jorden utan någon sterilisering av frön. Man då sprutar plantorna med 1:1000 utspädd glufosinatammonium (handelsbeteckning: Finale, frihet eller fatta eld) en gång var några dagar för att selektera fram resistenta plantor.
För GUS färgning, är det viktigt att skörda vävnad i aceton på is och hålla alla lösningar för kallt för att undvika nedbrytning. Den färgning buffertar med och utan X-Gluc måste göras färska, även om beståndet lösningen för varje komponent kan göras och lagras i förväg (se nedan). Kaliumferrocyanid och Ferricyanide är giftiga och bör hanteras med försiktighet. Dessutom är det viktigt att inte inkubera vävnaden vid 37 ° C i färgning buffert med X-Gluc längre än 1-2 dagar eftersom vävnaden kan börja att försämras och / eller färgningsmönstret kan bli för diffus under den långa inkubationer . Slutligen, högre Ferri och ferrocyanide koncentrationer ger lägre total färgning nivå, men mer specifika. 2mm X-Glux fungerar bra för de flesta applikationer, men halterna kan behöva justeras för vissa behov. X-Gluc är dyrt. Den färgning bör utföras i minimala volymer.
Stock lösningar som kan göras i förväg:
10% Triton X-100 (förvaras i rumstemperatur i flera månader)
0,5 M NaHPO 4 Buffer (pH7.2) (förvaras i rumstemperatur i flera månader)
100 mM kaliumferrocyanid (Förvaras i mörker vid 4 ° C i flera månader)
100 mM kaliumferricyanid (Förvaras i mörker vid 4 ° C i flera månader)
100 mm x-Gluc (5-bromo-4-klor-3-indolyl β-D-glukuronid cyclohexamine salt) är tillverkad i dimetylformamid (DMF) och förvaras i -20 ° C i aluminiumfolie inslagna rör. Det varar i flera månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Chunxin Wang för att bygga pTSO2:: GUS och för foton i figur 1, Detlef Weigel för att dela GUS-idiotsäkert protokoll, Paja Sijacic och Courtney Hollender för hjälpsamma kommentarer. Forskning i Z. L laboratorium stöds av US National Science Foundation (IOB0616096 och MCB0744752). ZL är delvis stöds av University of Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzyladenine | Sigma-Aldrich | 852430 | |
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | |
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth International, Inc | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark |
| Micropore 3M Tape | Fisher Scientific | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
