Floral-pendage de la transformation Arabidopsis thaliana Pour examiner PTSO2:: β-glucuronidase Expression du gène rapporteur

Summary

Cet article illustre l'floral dip méthode de

Abstract

La capacité à introduire des gènes étrangers dans un organisme est le fondement de la biologie moderne et de la biotechnologie. Dans le modèle de plante à fleurs

Protocol

I. Floral-pendage de transformation d'Arabidopsis thaliana

1. Environ un mois avant la transformation, semer des graines d'Arabidopsis sur 4 à 8 pots (5 pouces pots carrés) avec environ 10-15 plantes par pot. Pour les plantes à la fertilité normale, 4 pots de plantes par construire le plasmide sera suffisant. Si on a de transformer Arabidopsis mutantes avec une fertilité réduite, augmenter le nombre de pots en conséquence.
2. Les plantes sont cultivées dans des conditions standard (16 h de lumière et 8 h obscurité à 22 ° C). Si les plantes sont cultivées sous journée plus courte ou plus basse température, ils vont prendre plus de fleurs et plus de temps pour être prêt pour la transformation. Soins des plantes de bonne volonté d'assurer des plantes saines, qui sont essentielles pour la transformation réussie.
3. Lorsque les plantes ont simplement boulonnés et commencé à fleurir. Ils sont maintenant prêts pour la transformation. Pour accroître l'efficacité de transformation, 3-4 jours avant la transformation, coupez les pousses inflorescence principale dès qu'ils ont boulonné à encourager davantage la formation de pousses secondaires. Arrosez les plantes le jour avant la transformation. Cela garantit que le sol ne sera pas s'imprégner de l'infiltration des médias trop pendant floral-trempage.
4. Deux jours avant la transformation, inoculer LB 40ml contenant des antibiotiques appropriés (dans le cas de pTSO2:: GUS, 50 pg / ml de kanamycine) par Agrobacterium tumefaciens souche GV3101 portant le pTSO2:: GUS construire. Le pTSO2:: GUS est cloné dans le vecteur qui possède pBIN20 gène NPTII qui confère une résistance à la kanamycine ^3. Cultivez la nuit dans un incubateur agitateur à 28-30 ° C.
5. Le jour suivant, 8ml transfert de la culture de la nuit dans 400ml de milieu LB contenant 50 pg / ml de kanamycine. Cultivez la nuit dans un incubateur agitateur à 28-30 ° C.
6. Le jour de la transformation, lorsque la DO ₆₀₀ de la culture d'Agrobacterium atteint environ 0,8 (DO ₆₀₀ de 0,5 à1 sont acceptables), ralentit la culture d'Agrobacterium nuit à 8 minutes à 5000rpm.
7. Reprendre le culot dans 1 L d'Agrobacterium (litre) des médias d'infiltration (10 mM MgCl _2, 5% de saccharose, 0,44 mm 6-benzyladénine (BA), 0,3% Silwet L-77, la solution de 1x Gamborg s vitamines et l'eau à l'autoclave). Le milieu n'a pas besoin d'être autoclavés mais elle doit être préparée. Verser le milieu 1 L infiltration d'Agrobacterium contenant dans un plat (comme 8 "x15" x2 "Pyrex plat).
8. Inverser le pot (plantes ne tombent pas) et trempette toutes les parties aériennes des plantes dans la solution d'infiltration, maintenez pendant 5 minutes un pot à la fois. Alors que toutes les parties aériennes de la plante sont immergées dans le milieu d'infiltration, éviter de laisser le sol absorbent toute infiltration des médias afin de réduire les chances de croissance fongique sur le sol.
9. Après le trempage, placer tous les pots trempé de leur côté sur plusieurs couches de serviettes en papier dans un tiroir. Les serviettes en papier absorbent quantité d'accès des médias d'infiltration. Couvrir le bac avec une pellicule de plastique pour assurer une forte humidité. Placer le plateau dans la chambre de croissance des plantes.
10. Le lendemain, retirer la pellicule plastique et des serviettes en papier, et des pots lieu debout. Ne pas arroser ces plantes pendant quatre à cinq jours de plus. Ensuite, maintenir les plantes normalement jusqu'à ce qu'ils jeu graines et récolter les graines en vrac.
11. Verser dans les boîtes (150x15mm boîte de Petri) avec un milieu MS contenant 50 pg / ml de kanamycine (poids 2.2g de sel de Murashige et Skoog basale sans vitamine, dissoudre dans 500 ml d'eau, le pH à 5,8 avec NaOH 1M, ajouter 4 grammes d'agar, autoclave, frais et Ajouter à la kanamycine à 50 pg / ml en concentration finale). Les plaques sont conservés dans 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
12. Pour sélectionner des résistantes aux antibiotiques des plantes transgéniques, on a besoin de l'écran 20 000 graines au minimum. 0,1 gramme est d'environ 5000 graines. Poids et estimer la quantité de graines.
13. Stériliser les graines en les laver dans le tube Falcon de 15 ml d'éthanol à 70% pendant 30 secondes. Laver les graines à l'eau stérile une fois. Faire tremper les graines pendant 30 secondes dans une solution contenant de dilution 1:10 de l'eau de Javel achetée en magasin de 5% (Clorox). Rincer les graines à l'eau stérile trois à six fois. Dans hotte stérile, une pipette environ 5000 graines sur chaque EM (kanamycine) plaque, répandre les graines uniformément sur la plaque, les plaques d'étanchéité avec 3M Micropore bande pour éviter la contamination.
14. Incuber les plaques à 4 ° C dans l'obscurité pendant 3-4 jours, puis de transférer les plaques à une chambre (la chambre peut être même plante de croissance). Après environ 14 jours, les plants transgéniques restent vertes, mais celles non transgéniques sont en pâlissant et les mourants. Transfert des plants transgéniques sur le sol en ralentissant tirant les racines à partir de la moyenne et les a placés dans le sol.

II. Examiner pTSO2:: profils d'expression de GUS

1. Récolte pTSO2:: GUS plants transgéniques et les placer dans de l'acétone à 90% froid dans un flacon à scintillation en verre ou tubes de microcentrifugeusequi sont conservés sur la glace. Des plaques de microtitration en polystyrène (non polypropylène) peuvent également être utilisés si l'on analyse un grand nombre d'échantillons.
2. Après tous les échantillons sont récoltés, placer les flacons à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps forment tampon de coloration douce sans X-gluc (0,2% de Triton X-100, 50mm NaHPO ₄ Tampon pH 7,2, 2 mM ferrocyanure de potassium, potassium 2mM Ferricyanide) et placer sur la glace.
3. Enlever l'acétone à partir des échantillons et ajouter le tampon de coloration.
4. Maquillage solution de coloration X-gluc (0,2% de Triton X-100, 50mm NaHPO ₄ Tampon pH 7,2, 2 mM ferrocyanure de potassium, potassium 2mM Ferricyanide, 2mm x-gluc). Retirez le tampon de coloration à partir d'échantillons et ajouter le tampon de coloration contenant X-gluc aux échantillons.
5. Infiltrez les échantillons sous vide pendant 15 à 20 minutes. Couper le vide lentement et vérifier que tous les échantillons couler sous la surface de la solution de coloration. Si nécessaire, répétez l'infiltration jusqu'à ce que tous les échantillons couler après que le vide est libéré.
6. Incuber les échantillons à 37 ° C la nuit dans le tampon de coloration avec X-gluc.
7. Retirer les échantillons de l'incubateur et éliminer le tampon de coloration. Laver les échantillons successifs en série éthanol (20%, 35% et 50% d'éthanol) à température ambiante pendant 30 minutes à chaque changement.
8. Fixer les tissus dans la FAA fixateur (50% d'éthanol, le formaldéhyde à 5%, 10% d'acide acétique, l'eau reste) pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez la FAA et ajouter 70% d'éthanol. A ce moment les tissus peuvent être visualisées et photographié sous une loupe binoculaire équipée d'un appareil photo numérique. Une couleur bleu foncé indique où TSO2 est exprimée (figure 1). Alternativement, les tissus peuvent être conservés à 4 ° C pour un visionnage ultérieur.
   
   
   Figure 1 pTSO2.:: Expression de GUS dans des plants transgéniques (A), les racines latérales (B), et l'extrémité des racines (C). Notez que TSO2 promoteur est très actif dans les tissus jeunes et en divisant. Le profil d'expression sporadiques montré en (C) est typique des gènes exprimés dans les phases spécifiques du cycle cellulaire.

Les résultats représentatifs

Une fois fait correctement, l'efficacité de transformation devrait être d'environ 0,1-0,2%. Dans un autre mot, on devrait obtenir de 50 à 10 plants transgéniques par un dépistage tous les 5000 graines. En moyenne, environ 100 lignées transgéniques peuvent être obtenus en transformant 4 pots de plantes de type sauvage.

Pour les semis transgéniques contenant le pTSO2:: GUS construire ^3, couleur bleu foncé qui reflète l'activité GUS est trouvé dans cellules en division active, y compris les jeunes feuilles, apex, l'extrémité des racines et des racines latérales primordia (figure 1). Le modèle non-uniforme sporadique est caractéristique de la phase du cycle cellulaire expression spécifique.

Discussion

L'efficacité de transformation est déterminé par plusieurs facteurs différents, qui sont discutés ci-dessous:

1. La santé des plantes et leur âge sont de première importance. Environ un mois vieilles usines produisant de nombreux bourgeons floraux immatures sont idéales. Découper les pousses primaires pour encourager la formation de pousses secondaires jours 3-4, avant la transformation va augmenter l'efficacité de transformation. Les plants plus âgés donnera lieu à des transformants, mais à un taux inférieur.
2. Fertilité des plantes est important. Si on a de transformer les mutants avec une fertilité réduite, des plantes beaucoup plus seront nécessaires pour faire trempette.
3. 0,3% Silwet L-77 tensioactif dans un tampon de l'infiltration est considérée comme essentielle.
4. Trempage du temps dans les médias l'infiltration devrait être d'au moins 5 minutes.
5. Pour réduire la contamination fongique, plusieurs précautions doivent être prises. D'abord, on a besoin pour éviter le sol de s'imprégner de l'infiltration par les médias arroser les plantes / sol un jour avant l'infiltration. Ne pas plonger la terre dans les médias d'infiltration. Deuxièmement, retirez le couvercle en plastique et serviette en papier dans les 24 heures après l'infiltration afin de réduire l'humidité. Troisièmement, ne pas arroser les plantes jusqu'à 5 jours après l'infiltration.

Selon construire le plasmide spécifiques, les méthodes de sélection des plantes transgéniques peuvent varier. Si un vecteur plasmide porte le bar (bialaphos acétyltransférase) la résistance gène marqueur conférant au glufosinate d'ammonium, on peut planter les graines directement dans le sol sans aucune stérilisation des graines. Un, puis pulvérise le semis avec 1:1000 glufosinate-ammonium diluée (nom commercial: Finale, Liberty ou Ignite) une fois tous les quelques jours de sélectionner pour les semis résistants.

Pour la coloration GUS, il est important de récolter des tissus dans l'acétone sur la glace et de garder toutes les solutions à froid afin d'éviter toute dégradation. Les tampons avec et sans coloration X-Gluc doit être fait frais, bien que la solution de stock pour chaque composant peut être fait et stocké à l'avance (voir ci-dessous). Ferrocyanure de potassium et Ferricyanide sont toxiques et doivent être manipulés avec soin. En outre, il est important de ne pas incuber les tissus à 37 ° C dans le tampon de coloration de X-Gluc pendant plus de 1-2 jours parce que les tissus peuvent commencer à se détériorer et / ou le motif de coloration peut devenir trop diffuse pendant les incubations à long . Enfin, la hausse Ferri et les concentrations de ferrocyanure donnent niveau inférieur coloration globale, mais une plus grande spécificité. 2mm x-Glux fonctionne bien pour la plupart des applications, mais les concentrations peuvent avoir besoin d'être ajusté pour certains besoins. X-Gluc est cher. La coloration doit être réalisée dans des volumes minimes.

Les solutions mères qui peuvent être faites à l'avance:

10% de Triton X-100 (conservé à température ambiante pendant plusieurs mois)
0,5 M NaHPO ₄ tampon (pH 7,2) (conservé à température ambiante pendant plusieurs mois)
100 mM ferrocyanure de potassium (dans l'obscurité à 4 ° C pendant plusieurs mois)
100 mM de ferricyanure de potassium (Conserver dans l'obscurité à 4 ° C pendant plusieurs mois)
100 mm X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide sel cyclohexamine) est faite dans le diméthylformamide (DMF) et stockées dans -20 ° C dans des tubes en étain enroulée. Elle dure depuis plusieurs mois.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzyladenine	Sigma-Aldrich	852430
Silwet-77	Crompton Corp.		Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X	Sigma-Aldrich	G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt	Biosynth International, Inc	B-7300	Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape	Fisher Scientific	19027761