Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

اختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد - β ، والمسبب لمرض الزهايمر

Published: May 13, 2010 doi: 10.3791/1955
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

Summary

الأبتامرات هي ribo-/deoxyribo-oligonucleotides القصيرة المختارة من قبل

Abstract

مرض الزهايمر (ميلادي) هو التقدمية ، التي تعتمد على العمر ، واضطراب الاعصاب مع دورة الغادر الذي يجعل من الصعب تشخيصه سابق للأعراض 1. ويتحقق تشخيص محدد ميلادي بعد الوفاة فقط ، وبالتالي وضع سابق للأعراض ، والتشخيص المبكر للميلادي أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة وبالإدارة 2،3.

β البروتين اميلويد (Aβ) أمر أساسي لالمرضية ميلادي. ويعتقد ، oligomeric ذوبان المجالس Aβ أن يؤثر ضعف العصبية الكامنة متشابك وفقدان الخلايا العصبية في 4،5 م. وقد وصفت مختلف أشكال التجمعات Aβ القابلة للذوبان ، ومع ذلك ، ترابطها وصلتها المسببات المرضية ميلادي ومعقدة وغير مفهومة جيدا 6. قد أدوات محددة الاعتراف الجزيئية كشف العلاقات بين المجالس Aβ وتسهيل الكشف وتوصيف هذه المجالس في وقت مبكر من أعراض المرض قبل الدورة الظهور. الاعتراف الجزيئية تعتمد عادة على الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فئة بديلة من أدوات التعرف الجزيئي ، الأبتامرات ، ويقدم مزايا هامة بالنسبة إلى 7،8 الأضداد. [أليغنوكليوتيد] الأبتامرات هي التي تولدها في المختبر الاختيار : التطور المنهجي للتخصيب بواسطة يغاندس الأسي (سيليكس) 9،10. سيليكس هي عملية تكرارية ، مماثلة لنظرية التطور الداروينية ، ويتيح الاختيار ، والتضخيم ، والإثراء ، وإدامة الممتلكات ، على سبيل المثال ، متعطشا ومحددة وملزمة يجند (الأبتامرات) أو أي نشاط الحفاز (ribozymes وDNAzymes).

على الرغم من ظهور الأبتامرات كأدوات في مجال التكنولوجيا الحيوية الحديثة والطب 11 ، وقد كانوا غير مستغلة في مجال اميلويد. وقد تم اختيار عدد قليل أو RNA الأبتامرات ssDNA ضد أشكال مختلفة من بروتينات بريون (بي ار بي) 12-16. وقد أبدت aptamer RNA الناتجة ضد المؤتلف البقري بي ار بي بي ار بي الاعتراف البقري β - 17 ، ، oligomeric القابلة للذوبان ، β ورقة الغنية متعلق بتكوين متغير من كامل طول بي ار بي الذي يشكل ييفات اميلويد 18. ولدت الأبتامرات باستخدام نماذج موحودي والعديد من β ييفي تم العثور على 2 - المكروغلوبولين (β 2 م) لربط ييفات من بروتينات معينة amyloidogenic أخرى إلى جانب β ييفات م 2 19. Ylera وآخرون. وصف الأبتامرات RNA مختارة ضد يجمد 20 Aβ40 موحودي. بشكل غير متوقع ، وهذه الأبتامرات ملزمة لييفي Aβ40. تماما ، وهذه البيانات تثير تساؤلات عديدة هامة. لماذا اختيار الأبتامرات ضد بروتينات موحودي الاعتراف أشكالها البوليمرية؟ ويمكن الحصول على استمارات الأبتامرات ضد موحودي و / أو البروتينات oligomeric amyloidogenic؟ للتصدي لهذه الأسئلة ، وحاولنا تحديد الأبتامرات لتساهميا استقرت 21 Aβ40 oligomeric تم إنشاؤها باستخدام الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) 22،23. مشابهة لنتائج سابقة 17،19،20 ، تفاعلت مع هذه الأبتامرات ييفات Aβ من البروتينات وغيرها من عدة amyloidogenic الاعتراف الأرجح اميلويد مشتركة محتملة الهيكلية aptatope 21. هنا ، فإننا نقدم سيليكس منهجية المستخدمة في إنتاج هذه الأبتامرات 21.

Protocol

الجزء 1 : إعداد البروتين وعبر ربط ،

في البداية ، هو سابقة التجهيز للبروتين يستخدم لسيليكس مع بروبانول 1،1،1،3،3،3 - hexafluoro - 2 (HFIP) للحصول على واحدة متجانسة ، خالية من مجموع الأعمال التحضيرية ، كما هو موضح سابقا 23. هذه الخطوة كانت ضرورية لأن ما قبل تشكيل المجاميع حمل التجميع السريع للبروتينات amyloidogenic ، مما أدى إلى استنساخ التجارب الفقراء 24 عاما ، وغير مرغوب فيها لاختيار الأبتامرات unaggregated عن أشكال غير لييفي ، من البروتين.

  1. ~ خارج تزن 800 ميكروغرام (~ 180 nmol) النقي Aβ40 باستخدام microbalance. نقل الببتيد الجاف مجفف بالتجميد في المسمى ، المغلفة السيليكون منخفضة الممتزات microfuge أنابيب 1.6 مل.
  2. حل الببتيد في 100 ٪ ووصف 1،1،1،3،3،3 - hexafluoro - 2 - بروبانول (HFIP ، 400 ميكرولتر) للحصول على 0.5 ملي حل الببتيد كما سبق 23.
  3. تقسيم هذا الحل الى aliquots 100 ميكرولتر four بحيث يحتوي كل أنبوب ~ 45 nmol Aβ40 أبعاده. الشروع في إزالة HFIP كما هو موضح سابقا 23.
  4. قبل solubilizing الببتيد HFIP المعاملة في العازلة للربط عبر ردود الفعل ، وإعداد عبر ربط والكواشف التبريد. تزن خارج بيرسلفات الأمونيوم (الجزائرية ، ميغاواط 228.2 جم / مول) ويعد من حل 40 ملم في 10 ملم فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح.
  5. إعداد 2 ملم من حل تريس (2،2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy ، MW 748.63 غ / مول) في 10 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة والتحقق من حل كامل. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  6. تحضير كاشف التبريد. تزن خارج dithiothreitol (DTT ، ميغاواط 154.5 جم / مول) ، وتذوب في الماء منزوع الأيونات او 10 ملم فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، إلى 1 م.
  7. حل الببتيد HFIP المعالجة تماما كما هو موضح سابقا 23،25 بل تهدف الى الحصول على 60 ميكرومتر ~ الببتيد الحل.
  8. أداء PICUP لتوليد خليط من Aβ40 oligomeric كما هو موضح سابقا 23. يتم تنفيذ رد فعل PICUP نموذجية في حجم 20 ميكرولتر حيث تركيزات النهائي من البروتين ، RuBpy وكالة الأنباء الجزائرية هي 30 ميكرومتر ، 0.05 ملم ، و 1 ملم ، 23 على التوالي. وتتضاعف كل شيء هنا ، وتستخدم لخليط يحتوي على 108 PICUP البروتين ميكرولتر ، 6 RuBpy ميكرولتر ، 6 ميكرولتر وكالة الأنباء الجزائرية ، و 1 ميكرولتر DTT وتركيز البروتين ، RuBpy وكالة الأنباء الجزائرية نسبة إلى رد فعل نموذجي. هذا يقلل من عدد من ردود الفعل PICUP التي يتعين القيام بها ويزيد من تركيز بروتين للتحلية.

الجزء 2 : إعداد البروتين التحلية

قبل استخدام هذا البروتين لسيليكس ، يتم تنفيذ تحلية لإزالة عبر الكواشف المستخدمة لربط PICUP. هذا الخليط يحتوي على رد فعل PICUP الكواشف عبر ربط والبروتين ميكرومتر ~ 55 (تركيز الاسمية).

  1. إزالة الغطاء العلوي قبالة عمود تحلية 5 مل ، سند العمود قبل الوقوف ، ضع الدورق دون مخرج العمود ، وازالة سد منفذ. السماح لتدفق العازلة من خلال تخزين وجمع في الدورق.
  2. يوازن العمود في 10 ملي خلات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 8.3. إضافة 5 الراتنج سرير حجم (25 مل) من هذا المخزن المؤقت في 3 مل aliquots إلى العمود والسماح لها بالتدفق من خلال.
  3. وفي الوقت نفسه ، والتسمية 8 المنخفضة الممتزات ، السيليكون المغلفة 1.6 مل الأنابيب ووضعها في رف أنبوب.
  4. بعد العمود معايرتها ، وتطبيق قسامة 0،5-0،7 مل من خليط التفاعل PICUP لكل عمود في استخدام تحلية واحدة (يمكن غسلها الأعمدة وتخزينها ومعايرتها للاستخدامات في وقت لاحق). يسمح هذا الخليط لامتصاص البروتين في عمود الراتنج وتجاهل من خلال تدفق في الدورق.
  5. وضع أول مجموعة أنبوب تحت مخرج العمود. إضافة 0.5 مل العازلة خلات إلى العمود الأول ، وجمع 0،5 ميلي التي تتدفق من خلال كسر.
  6. كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 ، وجمع ما يصل الى 0.5 ميلي كسور ثمانية في أنابيب المقابلة.
  7. عدد مجموعة أخرى من الأنابيب 0.6 مل 8 المنخفضة الممتزات ، المغلفة السيليكون الصغيرة ووضعها في رف. تسمية أخرى أنبوب بأنها "فارغة". إخراج 150 ميكرولتر من كل جزء ، ونقل إلى أنابيب 0.6 مل المسمى. استخدام 20 ميكرولتر لSDS - PAGE التحليل (الشكل 1) كما هو موضح سابقا 23.
  8. نقل 150 ميكرولتر الأمونيوم 10 مم أسيتات ، ودرجة الحموضة 8.3 ، في أنبوب فارغ. استخدام هذا الأنبوب لتعيين الفارغة في معمل.
  9. قياس الامتصاصية في 130 ميكرولتر من كل جزء في نانومتر λ = 280 في كفيت الكوارتز.
  10. بعد قياس الامتصاصية ، والجمع بين الكسور مع محتوى أعلى من البروتين (عادة كسور 3-5) ، ومزيج بلطف باستخدام ماصة ، والحفاظ على قسامة 10 ميكرولتر لتحليل الحمض الأميني لتحديد تركيز البروتين الفعلي (غير معروضة).
  11. تقسيم العينة إلى aliquots متعددة من البروتين nmol ~ 2 في أنبوب وlyophilize العينات في lyophilizer.
  12. بعد الانتهاء من lyophilization ومعالجة العينات مع HFIP 100 ٪ كما كان من قبل.
  13. تخزين أنابيب في -20 درجة مئوية. استخدام أنبوب واحد لكل دورة سيليكس (أدناه).

الجزء 3 : التضخيم من المكتبة ssDNA عشوائي الاصطناعية بنسبة PCR

وشملت المكتبة ssDNA الاصطناعية المستخدمة هنا لسيليكس 49 النيوكليوتيدات العشوائية (A : T : G : C = 25:25:25:25 ٪) يحيط بها مناطق ثابتة تضم مواقع الاستنساخ (بام مرحبا ، RI ايكو) والمروج T7 ، كما الموصوفة سابقا 26.

  1. لتضخيم المكتبة ، وإقامة تفاعل PCR القياسية على النحو التالي : 202 ميكرولتر ماء منزوع الأيونات ، 40 ميكرولتر الحمض النووي بوليميريز طق 10X العازلة ، 2 قالب ssDNA ميكرولتر (0.5 nmol) ، و 120 ميكرولتر MgCl 25 مم 2 ، 28 ميكرولتر deoxynucleoside 10 مم مزيج ثلاثي الفوسفات (dNTPs) ، 1 ميكرولتر التمهيدي قدما (300 بمول) ، 1 التمهيدي عكس ميكرولتر (300 بمول) ، و 4 بوليميريز طق ميكرولتر.
  2. نفذ تفاعل PCR باستخدام cycler الحرارية مع الإعدادات التالية : 5 دقائق في 94 درجة مئوية لمدة تمسخ الأولي ، و 20 دورة كل 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لالصلب ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ل التمديد ، والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  3. بعد الانتهاء من تفاعل PCR ، تنقية المنتج تضخيم الحمض النووي باستخدام تنقية Qiagen PCR QiaQuick عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عموما ، في هذه التجارب على التركيز والعائد من الحمض النووي من 160 ± 10 نانوغرام / ميكرولتر في 50 ميكرولتر.
  4. التحقق من كمية الحمض النووي بعد PCR بنسبة 2 ٪ هلام إستشراد agarose.

الجزء 4 : الجيل من 32 ف المسمى بواسطة الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ

  1. إعداد رد فعل النسخ في أنبوب يا الدائري وتوج 1.6 لتر ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع إدخال بعض التعديلات على النحو التالي : 20 ميكرولتر النسخ T7 5X العازلة ، 7.5 ميكرولتر كل من rATP 100 ملم ، rGTP ، rUTP ، 1 ميكرولتر 100 ملي rCTP ، 2 ميكرولتر α 32 ف CTP (3000 تسى / ملمول) ، 50-10 ميكروغرام المنقى قالب الحمض النووي (~ 30-40 ميكرولتر من تنقية المنتج الحمض النووي) ، و 10 ميكرولتر مزيج الأنزيم ، ويشكلون الحجم النهائي إلى 100 ​​ميكرولتر بإضافة nuclease خالية من المياه.
  2. مزيج الحل بلطف ماصة ، الطرد المركزي الخليط ، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  3. في نهاية التفاعل ، القالب الحمض النووي لابد من إزالته. إضافة RQ1 ريبونوكلياز خالية الدناز إلى تركيز 1 U / ميكروغرام من الحمض النووي القالب واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية لهضم قالب الحمض النووي.
  4. بعد 4 ساعات ، واستخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 حجم سيترات المشبعة ، الفينول : كلوروفورم : كحول أيزو أميلي (125:24:1 ، ودرجة الحموضة 4.7). مزيج من دوامة ل1 دقيقة ~ والطرد المركزي في 16000 ز لمدة 2 دقيقة.
  5. نقل العلوي ، المرحلة مائي لأنبوب طازجة أو تجاهل مرحلة القاع بواسطة الشفط باستخدام micropipette. إضافة 1 حجم كلوروفورم : كحول أيزو أميلي (24:1) ، ومزيج من دوامة لمدة 1 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في 4.4.
  6. نقل العلوي ، المرحلة مائي لأنبوب طازجة أو تجاهل مرحلة القاع بواسطة الشفط باستخدام micropipette. ويمكن إزالة كلوروفورم المتبقية عن طريق إجراء سريع الدوران (10 ثانية) في microcentrifuge وإزالة للمرحلة القاع مع micropipette. في هذه الخطوة ، فمن الأسهل لإزالة مرحلة القاع بدلا من الطافي.
  7. لترسيب الحمض النووي الريبي ، إضافة 0.1 حجم يعادل خلات الصوديوم 3M ، ودرجة الحموضة 5.2 ، و 1 الحجم يعادل بروبانول - 2. مزيج ومكان في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. بعد 15 دقيقة ، وتدور بسرعة أعلى ، ويفضل في microcentrifuge المبردة عند 4 درجة مئوية ، لمدة 20-30 دقيقة لترسيب المنتج الحمض النووي الريبي.
  9. نضح في الطافي بعناية ، وغسل بيليه RNA مع 0.5 مل من الايثانول 70 ٪ ، وأجهزة الطرد المركزي عند درجة 4 وتجاهل الايثانول بواسطة الطموح.
  10. نقل الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي بيليه إلى كتلة الحرارة وجفاف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. حل عينة الحمض النووي الريبي في 150 ملي STE العازلة ، ودرجة الحموضة 8.0 (المتوفرة مع ProbeQuant illustra G - 50 microcolumns) أو خالية من المياه nuclease إلى وحدة تخزين متطابقة إلى أن من أي رد فعل النسخ في المختبر ، و 100 ميكرولتر (الخطوة 4.1).
  12. الحرارة الأنبوب الذي يحتوي على المنتج الحمض النووي الريبي في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة ومزيج من دوامة الحمض النووي الريبي لتسهيل الحل.
  13. الطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  14. الحفاظ على قسامة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي في أنبوب 0.6 مل المسمى لحساب والتلألؤ TBE - اليوريا الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (الجزء 6).

الجزء 5 : إزالة النيوكليوتيدات الفردية ، تحلية RNA ، والتلألؤ عد

لإزالة النيوكليوتيدات الفردية ، استخدام اثنين من أعمدة G - 50 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

  1. عكس الأعمدة ومزيج من دوامة لresuspend الراتنج.
  2. إغلاق المفاجئة قبالة الجزء السفلي من الأعمدة في ثقب باستخدام أداة بلاستيكية المنصوص عليها في عدة وتأكد من أن تترك منفذا يمسها. تخفيف سقف ربع دورة ومكان الأعمدة إلى أنابيب جمع النظيفة المنصوص عليها في G-50 عدة.
  3. تدور الأعمدة في أنابيب جمع في 730 غرام في 1 دقيقة لإزالة العازلة التخزين.
  4. نقل الأعمدة إلى اثنين من جديد يا الدائري وتوج أنابيب 1.6 مل ، وتحميل 50 ميكرولتر من 32 ف المسمى عينة الحمض النووي الريبي لكل عمود مباشرة على راتنج دون تكدير الراتنج.
  5. تدور في 730 غ لمدة 2 دقيقة لجمع الحمض النووي الريبي المنقى المسمى. بعد هذه الخطوة ، وتجاهل الأعمدة.
  6. نقل 1 ميكرولتر من G - 50 - RNA لتنقية أنبوب 0.6 مل لحساب والتلألؤ الكهربائي (الجزء 6). تخزين الأوراق المالية في الحمض النووي الريبي -20 درجة مئوية حتى استخدامها لسيليكس. فمن المستحسن أن يتم استخدام الحمض النووي الريبي داخل 2 يوما بعد وضع العلامات لتجنب تدهور وفقدان النشاط.
  7. استخدام اثنين 1 - RNA aliquots ميكرولتر من الخطوات 4.14 و 5.6 لقياس التهم لكل دقيقة (CPM / ميكرولتر) باستخدام عداد التلألؤ. هنا ، فإننا نستخدم العداد Triathler التلألؤ المقعد العلوي.
  8. نقل الأنابيب التي تحتوي على عينة الحمض النووي الريبي داخل محول البلاستيكية المستخدمة لحساب ف 32 ، مزودة Triathler. وضع أنبوب ومحول داخل غرفة الفرز ، وإغلاق غطاء للغرفة ، واختيار 32 العد P ، ثم اضغط على بدء لبدء العد.
  9. أي حساب ٪ التأسيس التسمية ، دمج 32 ٪ من α = ف CTP (CPM / ميكرولتر ل "G - 50" عينة ÷ CPM / ميكرولتر لعينة "توتال") × 100. مجموع العينة هي عينة قبل G - 50 تنقيتها.
  10. بعد عد التلألؤ وحساب التأسيس في المئة ، وحساب العائد من الحمض النووي الريبي والنشاط محددة من الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال ، إذا كانت تعول على مجموعة من الحمض النووي الريبي قبل (237370 نسخة في الدقيقة / ميكرولتر) وبعد تنقية G - 50 (191330 نسخة في الدقيقة / ميكرولتر) إدماج العائد 81 ٪ ، ثم يتم احتساب ما يلي قبل الحصول على عائد من الرنا :

    من الخطوة 4.1 ، مبلغ 32 α ف CTP في 3000 تسى / ملمول و 10 μCi / ميكرولتر هو :
    المعادلة 1 .
    كمية CTP غير المسماة المستخدمة هي :
    المعادلة 2 .
    المبلغ الإجمالي للاستخدام غير 100006.7pmol CTP. يتم حساب الوزن الجزيئي من الحمض النووي الريبي على النحو التالي
    المعادلة 3
    حيث 321.45 غ / مول 27 هو متوسط ​​كتلة rNTPs ، و 100 سنة مضت هو عدد من القواعد في تسلسل ، و 17 سنة مضت هو عدد من القواعد في المروج T7 التي لم يتم نسخها. الطرح من 61.96 جم / مول من الوزن الجزيئي قليل النوكليوتيد تأخذ بعين الاعتبار إزالة هبو 2 (63،98) ، وإضافة اثنين من ذرات الهيدروجين (2.02) 27. لأنه ، من rNTPs 4 ، CTP هو كاشف الحد ، لو أن كل CTP كان لا بد من إدراج النظري الشامل من الحمض النووي الريبي تنتج كان :
    المعادلة 4 .
    ومع ذلك ، لأن التأسيس 81 ٪ ، هذه الكتلة هو الآن 2156 ميكروغرام. وتعول في ميكروغرام من الحمض النووي الريبي عندئذ
    المعادلة 5
    حيث 100 ميكرولتر هو حجم ردود الفعل النسخ ، وكذلك من حيث الشامات : 26618.4 ميكروغرام / μmol 8874 نسخة في الدقيقة العاشرة / ميكروغرام = 2.4x10 8 CPM / μmol. من هنا ، فإن كمية من الحمض النووي الريبي في nmol وحجمه مناسب للاستخدام مع حضانة البروتين يمكن أن تحسب على سبيل المثال ، سوف تحتوي على 5 RNA ميكرولتر ~ 4 nmol RNA ، أي
    معادلة 6
    في هذه التجارب ، واستخدمت 300 بمول للبروتين nmol nmol 1 و 4 إلى RNA nmol 100 21.

الجزء 6 : توصيف للمنتج عن طريق الحمض النووي الريبي الكهربائي وتصوير الإشعاع الذاتي

  1. لتحضير عينات للالكهربي ، استخدم aliquots 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي قبل وبعد G - 50 من الخطوات لتنقية 4.14 و 5.6 على التوالي. إضافة العازلة 4 و 5 ميكرولتر STE ميكرولتر 2X Novex الاحتياطي نموذج TBE - اليوريا.
  2. تسخين العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على النحو الموصى به عادة لالكهربي الحمض النووي الريبي (تم العثور على التدفئة ليكون لا لزوم لها لأن القرار هلام من عينات الحمض النووي الريبي مع وبدون تسخين هو نفسه في هذا الإعداد التجريبية).
  3. تجميع 6 ٪ TBE - اليوريا هلام بولي أكريلاميد في جهاز تشغيل هلام ، وملء داخل وخارج غرف عازلة مع 1X TBE - اليوريا Novex الجري. شطف آبار الجل الجاهزة باستخدام العازلة ماصة 1 مل.
  4. أنابيب الطرد المركزي RNA وتحميل العينات (إجمالي 10 ميكرولتر) باستخدام هلام تحميل النصائح. تشغيل هلام عند 180 V لمدة 50 دقيقة.
  5. بعد 50 دقيقة ، وتفكيك جل عن طريق كسر بعيدا عن قالب من البلاستيك ، لإزالة ونبذ فقط أقصر بدعم من العفن هلام ، ولكن ترك يعد بدعم كدعم للهلام.
  6. تنظيف السطح من ناحية العمل مع التطهير (أو غيرها من المطهر النشاط الإشعاعي المناسب) والتأكد من إزالة كل البقع الملوثة المشعة.
  7. وضع طبقتين من البلاستيك التفاف ساران ؛ التفاف جل وبدعم من البلاستيك في لف اثنين إجتهد البلاستيك.
  8. فضح هلام ملفوفة في ورقة من البلاستيك لمنutoradiography فيلم الأشعة السينية داخل الكاسيت التعرض في غرفة مظلمة ، تحت ضوء آمن. ترك كاسيت على -20 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة.
  9. وضع الفيلم في غرفة مظلمة تحت ضوء آمن بعد 60-90 دقيقة باستخدام مطور الفيلم التلقائي (الشكل 2).

الجزء 7 : رنا حضانة البروتين وملزم التصفية

أولا ، يتم تحضين الحمض النووي الريبي والبروتينات في الحل ومن ثم يتم فصل متواليات الحمض النووي الريبي التي تربط إلى البروتين من المجلدات غير. كما تقدم دورات سيليكس ، سيكون ملزما تصفية تعطي مؤشرا لتخصيب RNA البروتينات ملزمة.

  1. احتضان الحمض النووي الريبي في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للتمسخ ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لاستعادة الطبيعة البطيئة.
  2. حل من خطوة والبروتين 2.12 في 8 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 60 ملم وإضافة 36 ميكرولتر nuclease خالية من المياه منزوع الأيونات. يصوتن الخليط لمدة 1 دقيقة ، وإضافة 36 ميكرولتر العازلة RNA 2X ملزمة (20 ملي تريس ، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي MgCl 2 ، ودرجة الحموضة 7.5).
  3. مزج كمية مناسبة من الحمض النووي الريبي مع 20 ميكرولتر العازلة RNA 10X ملزمة وتشكل وحدة التخزين إلى 200 ميكرولتر بإضافة nuclease خالية من المياه. تسمية الأنبوب "الرقابة السلبية."
  4. مزيج من البروتين 20 ميكرولتر والمبلغ المطلوب من الحمض النووي الريبي مع 20 ميكرولتر العازلة RNA 10X ملزمة وتشكل وحدة التخزين إلى 200 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. تسمية الأنبوب "رد فعل".
  5. خلط واحتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه إعداد المرشحات والإعداد تصفية ملزم للخطوة التالية.
  6. أرفق 125 مل الجانب الذراع القارورة إلى مدخل فراغ. وضع ما قبل تنظيفها ، سند الزجاج مسامية للتصفية على القارورة الجانب الذراع.
  7. يوازن 3 أغشية التصفية في غضون 2-3 مل من الحمض النووي الريبي العازلة 1X ملزم في طبق بتري 35x10 ملم لمدة 10-15 دقيقة. وسيتم استخدام التصفية الاولى لضبط شفط فراغ ، وسوف تستخدم الثانية لRNA بذاتها ، سوف تستخدم لمراقبة سلبية ملزمة التصفية ، والثالثة لتصفية ملزم من الحمض النووي الريبي خليط من البروتين.
  8. بعد 30 دقيقة ، رد فعل الطرد المركزي الملزم ، وأنابيب التحكم في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. بدوره على فراغ ومكان الغشاء الأول على الزجاج التي يسهل اختراقها. باستخدام micropipette ، بالتنقيط 0.5 مل من الحمض النووي الريبي ملزمة عازلة على الغشاء وضبط فراغ للسماح بتدفق بطيء في كل قطرة من خلال الأغشية العازلة.
  10. مكان الغشاء second في الزجاج مسامية وباستخدام نفس معدل التدفق ، وتطبيق الرقابة السلبية على الغشاء.
  11. تطبيق 4x0.5 ميلي aliquots العازلة من الحمض النووي الريبي 1X ملزمة ليغسل الغشاء وتجاهل من خلال تدفق. ملاحظة أنه إذا كان هو المطلوب قبل المقاصة ، ويتم الاحتفاظ بها من خلال تدفق لاستخراج الحمض النووي الريبي. قبل إزالة يزيل متواليات الحمض النووي الريبي التي تربط إلى التصفية.
  12. إزالة الغشاء سلبية الرقابة والمكان الى أنبوب 1.6 مل في المقابل المسمى لحساب التلألؤ.
  13. استبدال الزجاج مسامية مع ما قبل تنظيف الزجاج second دعم يسهل اختراقها.
  14. ضع القرص third على الزجاج مسامية وتطبيق خليط التفاعل. غسل تصفية كما في الخطوة 7.11 وتجاهل من خلال تدفق. ويمكن زيادة عدد يغسل في دورات سيليكس في وقت لاحق لزيادة التشدد في شروط سيليكس.
  15. إزالة القرص التصفية والمكان الى أنبوب 1.6 مل المسمى "خليط التفاعل" ، والحفاظ على التلألؤ العد.
  16. أداء التلألؤ العد كما في الخطوة 5.8 و يدون التهم للمرشحات منها.
  17. حساب مستوى النشاط الإشعاعي مرشح محدد مقابل مبلغ إجمالي النشاط الإشعاعي يطبق على الأغشية (ملزم ٪). وهذا يعطي مؤشرا لتخصيب اليورانيوم ملزما مع تقدم سيليكس.

الجزء 8 : استخراج الحمض النووي الريبي من الفلاتر

يتم استخراج الحمض النووي الريبي من المرشحات للحصول على متواليات التي تربط إلى البروتين. وتتضخم هذه المتتاليات لدورة سيليكس المقبل.

  1. بعد عد التلألؤ ، إزالة الربط للرد مرشح من الأنبوب (من الخطوة 7.15) ، والمكان الى ، جافة ونظيفة ، وطبق بيتري 35x10 ملم.
  2. استخدام مشرط نظيفة وزوج من ملاقط لقطع الغشاء في القطع الصغيرة.
  3. باستخدام الملقط ، استبدال قطع قطع من الغشاء في الأنبوب المسمى نفسه من الخطوة 8.1.
  4. إضافة 400 العازلة شطف ميكرولتر (7 M اليوريا ، EDTA 3 مم ، 100 مم سترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.0) ، واحتضان الأنبوب في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. أنبوب الطرد المركزي على سرعة أعلى في درجة حرارة الغرفة ، ونضح ، وجمع زبدة الاستخراج في أنبوب الجديد المسمى.
  6. قياس النشاط الإشعاعي التهم المتبقية في الأنبوب الذي يحتوي على قطع غشاء التي التلألؤ عد لتقييم كفاءة الاستخراج.
  7. تكرار عملية الاستخراج (الخطوات 8،4-8،6) ثلاث مرات. هو عادة بعد 3 كفاءة الاستخراج ~ 95-96 ٪.
  8. في الأنابيب التي تحتوي على مقتطفات الحمض النووي الريبي ، إضافة 1 الحجم (400 ميكرولتر) من المشبعة ، سترات (الرقم الهيدروجيني 4.7) الفينول : كلوروفورم : الكحول isoamyl (125:24:1). مزيج من دوامة لدقيقة وcentrifu 1 ~جنرال الكتريك في 16000 ز لمدة 2 دقيقة.
  9. نقل العلوي ، المرحلة مائي لأنبوب طازجة أو تجاهل مرحلة القاع بواسطة الشفط باستخدام micropipette.
  10. إضافة 1 حجم كلوروفورم : كحول أيزو أميلي (24:1) ، ومزيج من دوامة لمدة 1 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في 16000 ز لمدة 2 دقيقة.
  11. نقل العلوي ، المرحلة مائي لأنبوب طازجة أو تجاهل مرحلة القاع بواسطة الشفط باستخدام micropipette.
  12. لترسيب الحمض النووي الريبي ، إضافة 0.1 حجم 3 خلات الصوديوم م ، ودرجة الحموضة 5.2 ، الجليكوجين ميكرولتر 04/03 (10 ميكروغرام / ميكرولتر) كما coprecipitant RNA ، ويعادل حجم 1 بروبانول - 2. مزيج ومكان في الفريزر -20 درجة مئوية خلال الليل.
  13. تدور بسرعة أعلى ، ويفضل في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية ، لمدة 20-30 دقيقة لترسيب الحمض النووي الريبي من الخطوة 8.12.
  14. بعد الطرد المركزي ، والجيش الملكي النيبالي يفصل في مرحلة السائل الذي بالكاد مرئيا. نضح في الطافي بعناية دون طرد هذه المرحلة بالكاد مرئية مرسب في الجزء السفلي من الأنبوب.
  15. غسل الحمض النووي الريبي "بيليه" مع 0.5 مل من الايثانول 70 ٪ ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على سرعة أعلى في 4 درجات مئوية ، وتجاهل الايثانول بواسطة الشفط بدون طرد المرحلة مرسب بالكاد مرئية.
  16. حل بيليه RNA في 50 ميكرولتر STE العازلة ، والشروع في تنقية G 50 كما في الخطوة 5.

الجزء 9 : النسخ العكسي وPCR لدورات مستمرة سيليكس

للشروع في الدورة القادمة لسيليكس ، RNA يجب أن يكون عكس الحمض النووي للكتب وتضخيمها من قبل الاسترداد.

  1. في 5 المسمى 0.6 مل أنابيب ، مزيج من 3 ميكرولتر المنقى ، G - 50 - RNA المحلاة مع 2 ميكرولتر من 8 أضعاف المخفف التمهيدي عكسي. أنبوب واحد تسمية "السيطرة السلبية".
  2. احتضان الخليط على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم على الجليد لمدة 5 دقائق للسماح للتهجين من التمهيدي إلى الحمض النووي الريبي.
  3. لهذا الخليط على الجليد ، إضافة 6.4 ميكرولتر nuclease خالية من المياه ، 4 - II ميكرولتر ImProm العازلة رد فعل 5X ، 1.6 ميكرولتر MgCl 25 مم 2 ، 1 ميكروليتر مزيج dNTP 10 ملم ، 1 ريبونوكلياز RNasein ميكرولتر المانع ، 1 ميكرولتر ImProm - II عكس المنتسخة يشكلون ما مجموعه 15 ميكرولتر.
  4. لعنصر سلبي ، إضافة 7.4 ميكرولتر nuclease خالية من الماء ويترك جانبا مسألة الناسخ العكسي. تسمية أنابيب تبعا لذلك. يتم تضمين السيطرة السلبية للتحقق من أن تلويث الحمض النووي من الدورة السابقة لم يتم تضخيمها لدورة سيليكس المقبل. هذه الخطوة اختبارات فعالية الهضم من قالب الحمض النووي عن طريق RQ1 ريبونوكلياز خالية الدناز في الخطوة 4.3.
  5. استخدام cycler الحرارية لاحتضان خليط التفاعل على 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عن الصلب والإرشاد لأول حبلا الحمض النووي ، على التوالي ، تليها 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإبطال نشاط الناسخ العكسي.
  6. بعد رد فعل عكس النسخ ، وإعداد مزيج PCR. إضافة 30 ميكرولتر nuclease خالية من المياه ، و 10 ميكرولتر العازلة طق 10X ، 30 ميكرولتر MgCl 25 مم 2 ، 7 10 ميكرولتر مزيج dNTP ملم ، 1 ميكرولتر من كل التمهيدي ، و 1 بوليميريز طق ميكرولتر في أنابيب للجميع.
  7. تشغيل البرنامج PCR كما في الجزء 3 دورات ل14/09.
  8. تنقية المنتج الحمض النووي كما في الخطوة 3.3.
  9. 8 ميكروليتر مزيج من الناتج الحمض النووي DNA مع 2 ميكرولتر صبغ التحميل وelectrophorese على agarose 2 ٪ عند 100 فولت لل15-20 دقيقة (الشكل 3).
  10. المنتج الحمض النووي هو على استعداد ليكون الحمض النووي الريبي لكتب وصفت بأنها في الجزء (4) وتستخدم للدورة المقبلة من سيليكس.

الجزء 10 : نتائج الممثل

سيليكس في التجارب ، وطبيعة Aβ40 oligomers تستخدم كهدف ، ونوعية من الحمض النووي الريبي المستخدمة لكل دورة ، واستخراج الحمض النووي الريبي ناجحة والتضخيم بعد كل دورة هامة. استخدمنا PICUP لإنشاء oligomeric Aβ40 الخليط لسيليكس بعد تنقيتها وإزالة المواد الكاشفة ، عبر الارتباط. التجارب تحلية وصفها في الجزء 2 تؤدي عادة إلى فقدان 50-55 ٪ من البروتين. ويمكن تقدير كمية ونوعية البروتين باستخدام قياسات الامتصاصية (λ = 280) وSDS - PAGE (الشكل 1). يتم عرض ملف الامتصاصية المتوسط ​​في الفترة من 5 Aβ40 eluates التجارب الفردية تتراكب نموذجي SDS - PAGE ملف Aβ40 eluted في واحدة من تلك التجارب في الشكل 1. وتشير البيانات إلى أن البروتين elutes باستمرار قبالة كسور العمود في 05/03 والكواشف عبر ربط أزل بعد الكسر 6 (الامتصاصية في زيادة نسبة 7 ، الشكل 1). SDS - PAGE ويبين توزيع قليل وحدات نموذجية Aβ40 22. وكان هذا التوزيع بعد أن تم استنساخه مجفد الكسور البروتين (2.11) ، وتعامل مع HFIP (2.11) ، resolubilized (7.1) ، وإعادة تحليلها بواسطة SDS - PAGE.

سلامة الحمض النووي الريبي لكل دورة سيليكس المهم أيضا بالنسبة للتطور سيليكس تكرارية ، وخصوصا عندما تستخدم nuclease الحساس للريبو ، [أليغنوكليوتيد]. بعد تضخيم الحمض النووي الريبي ، ووضع العلامات (الجزء 4) ، يمكن تقييم نوعية من الحمض النووي الريبي التي تسمى هلام إستشراد TBE - اليوريا بولي أكريلاميد. نبذة نموذجية للمنتج سليمة RNA المسمى قبل وبعد تنقية G - 50 (Pويظهر الفن 5) في الشكل 2.

بعد كل دورة سيليكس ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الغشاء بعد تصفية ملزمة (الجزء 8) ، وعكس كتب (الجزء 9) على الحمض النووي لتضخيم PCR (الخطوة 9.5). ثم يتم استخدام القالب الحمض النووي من الدورة السابقة لتوليد 32 ف المسماة الحمض النووي الريبي (الجزء 4) للدورة المقبلة. إذا كانت بعض قالب تلويث الحمض النووي من الدورة السابقة استمرت في المنتج المسمى RNA بعد ردود الفعل النسخ في المختبر (الجزء 4) ، سيتم تخفيض كفاءة دورات سيليكس ، تطالب بالمزيد من الدورات. للسيطرة على هذا ، بعد كل دورة سيليكس والمناظرة تفاعل PCR عكس النسخ ، ويتم تنفيذ agarose الكهربائي (9.12). غياب المنتج الحمض النووي في أنابيب رد فعل سلبي للسيطرة (9.4) يشير إلى إزالة ناجحة من القالب الحمض النووي التي منشؤها من دورة سيليكس السابقة (الشكل 3). إذا لوحظ تضخيم DNA بواسطة PCR في أنبوب السلبية للسيطرة ، وينصح بأن تكون مدة طويلة من الحضانة مع الدناز RQ1 (4.3). وأوصت الشركة المصنعة مدة الحضانة مع الدناز RQ1 هو 15 دقيقة ، ومع ذلك ، وجدنا أن هناك حاجة إلى فترة أطول حضانات (4-5 ح) لإزالة قالب الحمض النووي تماما (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. SDS - PAGE والتعريف الامتصاصية من PICUP المولدة ، oligomers Aβ40 المحلاة. وكان متوسط ​​ملف الامتصاصية من الأعمدة الفردية 5 تحلية وتعلوها على هلام التمثيلية. وتظهر علامات الوزن الجزيئي على اليمين.

الشكل 2
الشكل 2. TBE - اليوريا الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد من الناتج الحمض النووي الريبي قبل وبعد تنقية G - 50. اتجاه الهجرة من الناتج هو من الحمض النووي الريبي لأنود الكاثود كما هو محدد.

الشكل 3
هلام Agarose الرقم 3. الكهربائي من الناتج الحمض النووي بعد النسخ العكسي ، وتضخيم PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقطة الانطلاق لعملية سيليكس هو توليف مكتبة تحتوي على قليل النوكليوتيد عشوائي عادة 10 12 15 -10 متواليات. سيليكس في الحمض النووي ، ويتم استخدام هذه المكتبة مباشرة بعد إنشاء تجمع ssDNA ، في حين سيليكس RNA ، تظاهر هنا ، هو تحويل مكتبة ssDNA أول حمام سباحة إنزيمي بواسطة الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ. ثم ، يتم تنفيذ سيليكس تكرارا حيث تضم كل دورة من التعرض وملزم [أليغنوكليوتيد] إلى الهدف المقصود ، وتقسيم المجلدات من غير ملزم متواليات ، وشطف للتسلسل ملزمة. في الدورات في وقت لاحق ، ويمكن تغيير رياضيات الكيمياء هدف وRNA و / أو عدد يغسل ، أو يمكن إضافة مثبطات تنافسية في المنطقة العازلة ملزمة أو غسل لزيادة التشدد في الشروط سيليكس. مرشح ملزم هو كلاسيكي ، وهي طريقة بسيطة وسريعة تستخدم لسيليكس 10 ، على الرغم من العديد من الأساليب وصفت 28 لالملزمة والتقسيم. مرشح ملزم يعتبر مثاليا لالتقاط واختيار من الحمض النووي الريبي المستهدفة التفاعلات في الحل. عند اختيار الأهداف التي هي عبارة عن جزيئات صغيرة أو الببتيدات ، وحجم المسام في الغشاء المستخدمة في تصفية ملزمة يصبح عاملا مقيدا ، وأحد الاعتبارات الهامة.

بعد شطف ، يتم تضخيم [أليغنوكليوتيد] هدف ملزم واستخدامها في دورات أخرى. عند استخدام الحمض النووي سيليكس ، يمكن تضخيم تجمع يثريه PCR وتستخدم مباشرة للدورة المقبلة بعد الهضم لتسلسل الحمض النووي متكاملة ووضع العلامات. عند استخدام الحمض النووي الريبي سيليكس ، وهذا التجمع يمكن تحويلها إلى الحمض النووي عن طريق النسخ والخلف وتضخيمه ثم PCR ، كتب في المختبر ، وصفت مرة أخرى لمواصلة لدورة المقبلة. عادة ، هناك حاجة 8-20 هذه الدورات للحصول على حمام سباحة aptamer المخصب ، وهو مستنسخ في وقت لاحق والتسلسل الأبتامرات الفردية وتتميز. في الدراسات التي تستخدم بروتينات اميلويد ، وتوصيف الأبتامرات أهمية خاصة بسبب تقارب الأصيلة [أليغنوكليوتيد] للهياكل اميلويد ييفي يعيق التنمية يحتمل الأبتامرات محددة للبروتينات اميلويد غير ييفي في ظل الظروف الفسيولوجية 21. وقد أدت هذه الملازمة ، وتسلسل مستقلة تقارب من [أليغنوكليوتيد] إلى جيل من لييف ، عبر التفاعل الأبتامرات في الدراسات التي تهدف لتوليد الأبتامرات لغير ييفي البروتينات amyloidogenic 17،19-21. في الآونة الأخيرة ، أفادت تاكاهاشي آخرون جيل من الحمض النووي الريبي الأبتامرات ضد نموذج من oligomeric Aβ40 وأظهر التفاعل مع Aβ موحودي مع تقارب micromolar 29. ومع ذلك ، لم يحدد عبر التفاعل مع هذه الأبتامرات ييفي Aβ40 أو مع غيره من البروتينات amyloidogenic ييفي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق منح من المعاهد الوطنية للصحة AG030709 / NIA و07-65798 من وزارة الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا. نعترف مارغريت M. Condron لتخليق الببتيد وتحليل الحمض الأميني ، الدكتورة اليزابيث واو نويفلد لمساعدة ودعم الخطوات الأولية للمشروع ، والدكتور تشي تشن هونغ باء لتقديم الدعم والكواشف ، والدكتور أندرو دال . إلينغتون لإجراء مناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aβ40 UCLA Biopolymers Laboratory Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance Mettler Toledo
Silicon-coated, 1.6-ml tubes Denville Scientific C19033 or C19035
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns Thermo Fisher Scientific, Inc. 20449
Ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
Silicon-coated, 0.6-ml tubes Denville Scientific C19063
Novex Tricine Gels (10–20%) Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette Hellma 105.250-QS
Beckman DU 640 spectrophotometer Beckman Coulter Inc.
ssDNA library Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’
Taq DNA polymerase USB Corp., Affymetrix 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution USB Corp., Affymetrix 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’
Reverse primer Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’
Thermal cycler Denville Scientific Techne TC-312
QIAquick PCR Purification Kit (50) Qiagen 28104
Agarose Denville Scientific CA3510-8
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings Denville Scientific C19040-S
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 Promega Corp. P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), PerkinElmer, Inc. BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) Sigma-Aldrich 77619
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) Sigma-Aldrich C0549
Absolute ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023
Z216-MK refrigerated microcentrifuge Denville Scientific C0216-MK
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) Invitrogen LC6876
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells Invitrogen EC6865BOX
Novex® TBE Running Buffer (5×) Invitrogen LC6675
Radioactivity decontaminant Fisher Scientific 04-355-67
Gel-loading tips Denville Scientific P3080
XCell SureLock Mini-Cell Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL Amersham RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs EMD Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask VWR international 26316-696
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11YZ
Urea Fisher Scientific AC32738-0050
EDTA Fisher Scientific 118430010
Glycogen Sigma-Aldrich G1767
2-Propanol for molecular biology Sigma-Aldrich I9516
Recombinant RNase inhibitor USB Corp., Affymetrix 71571
ImProm-II™Reverse Transcription System Promega Corp. A3802
Recombinant RNase inhibitor USB Corp., Affymetrix 71571
RapidRun™ Loading Dye USB Corp., Affymetrix 77524

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

Tags

إن الرب علم الأعصاب ، علم الأحياء الخلوي ، العدد 39 ، Aptamer ، RNA ، بروتين اميلويد β ، قليل وحدات ، ييفات اميلويد ، والتجمع من البروتين
اختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد - β ، والمسبب لمرض الزهايمر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rahimi, F., Bitan, G. Selection of… More

Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter