Summary
Aptamers tarafından seçilen kısa ribo-/deoxyribo-oligonucleotides
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH) 1 presymptomatic tanı zor kılan sinsi bir seyir ile ilerici, yaşa bağlı, nörodejeneratif bir bozukluktur . Kesin MS tanısı, böylece AD presymptomatic, erken tanı, etkin tedaviler 2,3 geliştirmek ve yönetmek için çok önemlidir kurulması, sadece postmortem elde edilir.
Β amiloid protein (Aβ), MS patogenezinde merkezi. Çözünür, oligomerik Aβ meclisleri AD 4,5 nörotoksisite altında yatan sinaptik fonksiyon bozukluğu ve nöron kaybı etkilediğine inanılmaktadır . Çözünür Aβ meclislerinin çeşitli şekillerde tarif edilmiştir, ancak onların ilişkileri ve AD etyolojisi ve patogenezi ile ilgili karmaşık ve iyi 6 anlaşılmış değildir. Spesifik moleküler tanıma araçları Aβ meclisleri arasındaki ilişkiler çözülmeye ve belirtiler ortaya çıkmadan önce erken hastalık seyri bu meclislerin tespiti ve karakterizasyonu kolaylaştırmak. Moleküler tanıma antikorlar genellikle dayanır. Ancak, moleküler tanıma araçları, aptamers, alternatif bir sınıfı antikorların 7,8 göre önemli avantajlar sunuyor. Üstel zenginleştirme (SELEX) 9,10 ligandların sistematik evrim: Aptamers in-vitro seçim tarafından oluşturulan oligonükleotidler. SELEX Darwinci evrim benzer sağlar, iteratif bir süreç seçimi, amplifikasyon, zenginleştirme, ve devamına bir özellik, örneğin, arzulu, özel, ligand bağlanması (aptamers) veya katalitik aktivitesi (ribozimlerle rekabet ederek geçmişlerdir ve DNAzymes).
Modern biyoteknoloji ve tıp 11 aptamers araçları olarak ortaya çıkması rağmen, amiloid alanında atıl olmuştur. Birkaç RNA veya ssDNA aptamers prion proteinlerin (PrP) 12-16 çeşitli biçimlerine karşı seçilmiştir. Rekombinant sığır PrP karşı oluşturulan bir RNA aptamer amiloid fibrillerinin 18 formları tam uzunlukta PrP çözünür, polimerik, β-tabaka zengin konformasyonel varyant, sığır PrP-β 17 tanımayı gösterildi. Aptamers fibriler β 2-mikroglobulin (β 2 m) yanı sıra, diğer bazı amiloidojenik proteinlerin β 2 m fibrillerin 19 fibriller bağlamak bulundu monomerik ve çeşitli formları kullanılarak oluşturulur. Ylera et al. immobilize monomerik Aβ40 20 karşı seçilen RNA aptamers nitelendirdi. Beklenmedik bir şekilde, bu aptamers fibriler Aβ40 bağlı. Toplamda, bu veriler, birçok önemli soruları gündeme. Neden monomerik proteinlere karşı seçilen aptamers polimerik biçimlerini biliyoruz? Amiloidojenik proteinler monomerik ve / veya oligomerik formları karşı aptamers elde edilebilir? Bu sorulara yanıt için, biz, fotoğraf kaynaklı çapraz bağlama (PICUP) 22,23 değiştirilmemiş proteinleri kullanılarak oluşturulan kovalent stabilize oligomerik Aβ40 21 aptamers seçmek için çalıştı . Önceki bulgularla 17,19,20 benzer şekilde, bu aptamers muhtemelen yapısal bir aptatope 21 potansiyel ortak amiloid tanıma Aβ ve diğer bazı amiloidojenik proteinler liflerinde tepki gösterdi. Burada, biz, bu aptamers 21 üretiminde kullanılan SELEX metodoloji mevcut .
Protocol
Bölüm 1: Protein hazırlanması ve cross-linking
Başlangıçta, SELEX için kullanılan protein olarak daha önce 23 homojen, toplam ücretsiz preparatları, elde etmek için 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) ile ön işlem. Bu adım, önceden oluşmuş agrega kötü deneysel tekrarlanabilirlik 24 sonuçlanan, amiloidojenik proteinlerin hızlı agregasyonu neden çünkü gerekli, ve protein Ayrı ayrı, fibriler olmayan formları için aptamers seçimi için arzu edilmez .
- Bir mikro kullanarak saf ~ 800 mg (~ 180 nmol) Aβ40 tartılır. Kuru liyofilize peptid, silikon kaplı, düşük-adsorban 1.6 ml mikrofuge'de tüp etiketli içine aktarın.
- % 100 peptid çözülür olarak 0.5 mM peptid çözüm elde etmek için 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP, 400 ul), daha önce açıklanan 23.
- Dört 100-ul alikotları her tüp sözde ~ 45 nmol Aβ40 içerdiğini, bu çözüm bölün. HFIP kaldırılması, daha önce 23 açıklandığı gibi devam edin.
- Çapraz bağlama reaksiyonlar için tampon HFIP ile tedavi edilen peptidler çözülebilmesinde önce, çapraz bağlama ve soğutma reaktifler hazırlar. Amonyum persülfat tartılır (APS MW 228,2 g / mol) ve 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 40 mM bir solüsyon hazırlanır. Çözüm netleşene kadar bir vorteks ile karıştırın.
- 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 2 mM çözüm Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hekzahidrat (RuBpy MW 748,63 g / mol) hazırlayın. Bir vorteks ile karıştırın ve tam dağılması doğrulamak. Tüp alüminyum folyo kullanarak ışık koruyun.
- Su verme reaktif hazırlayın. Dithiothreitol (DTT, MW 154.5 g / mol) tartılır ve 1 M. deiyonize su içinde veya 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4 çözülür
- Tam olarak açıklanan, ancak daha önce 23,25 ~ 60 mcM peptid çözüm elde etmek amacı ile tedavi edilen HFIP peptid çözülür.
- Daha önce 23 açıklandığı gibi oligomerik Aβ40 bir karışım oluşturmak için PICUP gerçekleştirin. Tipik bir PICUP reaksiyon, protein, RuBpy ve APS son konsantrasyonları 30 mcM, 0.05 mM ve 1 mM, sırasıyla 23 20 ul hacmi yapılır . Burada, PICUP için kullanılan karışım 108 ul protein, 6 ul RuBpy, 6 ul APS, ve 1 ul DTT ve protein konsantrasyonu, RuBpy ve APS içeren tüm tipik reaksiyon göre ikiye katlanır. Bu yapılacak PICUP reaksiyonların sayısını azaltır ve tuzsuzlaştırma için protein konsantrasyonu artırır.
Bölüm 2: protein hazırlık tuzsuzlaştırma
SELEX protein kullanmadan önce, tuzsuzlaştırma PICUP için kullanılan çapraz bağlama reaktifleri kaldırmak için yapılır. Bu PICUP reaksiyon karışımının reaktifler ve cross-linking ~ 55 mcM protein (nominal konsantrasyon) içerir.
- 5 ml tuzsuzlaştırma sütun kapalı üst kapağını çıkarın, bir stand sütun destek beher sütun çıkışının altında bir yerde ve çıkış fişi çekin. Ile depolama tampon akışı edelim ve beher içine toplamak.
- 10 mM amonyum asetat, pH 8.3 sütun dengelenmesi. 3-ml alikotları sütun bu tampon 5 reçine yatak hacimleri (25 ml) ekleyin ve akmasına izin verin.
- Bu arada, etiket 8 düşük adsorban, silikon kaplı 1.6 ml tüpler ve bir tüp rafa koyun.
- Sütun dengelenmiş sonra, (sütunlar sonraki kullanımlar için saklanır, yıkanmış ve dengelenmiş olabilir) 0.5-0.7 ml, tek tuzsuzlaştırma kullanımı başına kolon başına PICUP reaksiyon karışımı bir kısım geçerli. Protein karışımı sütun reçine içine ıslatın ve beher flow-through atmak için izin verin.
- Sütun çıkış altındaki ilk toplama tüpü yerleştirin. 0.5 ml asetat tamponu sütun ekleyin ve akan ilk 0.5 ml fraksiyonu toplamak.
- 2.4 ve 2.5 adımları yineleyin ve ilgili tüpleri sekiz 0.5 ml kesirler toplayabilirsiniz.
- 0.6-ml 8 düşük adsorban, silikon kaplı, küçük tüpler numarası başka bir set ve bir rafa koyun. Gibi başka bir tüp Label "boş." Etiketli 0.6 ml tüpleri içine her bir fraksiyonu ve transfer ul 150 çıkartın. Daha önce 23 gösterilir (Şekil 1) SDS-PAGE analizi için 20 ul kullanın.
- 150 ul 10 mM amonyum asetat, pH 8.3, boş tüp içine aktarın. Bu tüp, boş bir spektrofotometre ayarlamak için kullanın.
- Kuvars küvet λ = 280 nm her fraksiyonu 130 ul absorbansı ölçülür.
- Absorbansı ölçülür sonra, yüksek protein içeriği (genellikle kesirler 3-5) kesirler birleştirmek, yavaşça bir pipet kullanarak karışımı, ve amino asit analizi için gerçek protein konsantrasyonu (gösterilmemiştir) belirlemek için 10-ul kısım tutmak.
- ~ 2 nmol protein tüp başına birden fazla alikotları örnek Böl ve bir lyophilizer örnekleri lyophilize.
- Liyofilizasyon tamamlanmasından sonra, daha önce olduğu gibi% 100 HFIP örnekleri tedavi.
- -20 ° C'de tüpler Mağaza (Aşağıda), her SELEX döngüsü için bir tüp kullanın.
Bölüm 3: PCR ile sentetik rastgele ssDNA kütüphane amplifikasyonu
SELEX için burada kullanılan sentetik ssDNA kütüphanesi, 49 randomize nükleotidler (T: G: A, C =% 25:25:25:25) klonlama siteleri (Bam HI, Eco RI) ve T7 organizatörü oluşan sabit bölgelere göre çevrili daha önce 26 nitelendirdi.
- 202 ul deiyonize su, 40 ul 10x Taq DNA polimeraz tampon, 2 ul ssDNA şablon (0.5 nmol), 120 ul 25 mM MgCl 2, 28 ul 10 mM deoxynucleoside trifosfat karışımı: kütüphane yükseltmek için, aşağıdaki gibi bir standart PCR reaksiyonu kurmak (dNTP), 1 ul ileri astar (300 pmol), 1 ul ters astar (300 pmol), 4 ul Taq polimeraz.
- PCR, aşağıdaki ayarları ile termal cycler kullanarak uygulayın: 5 dakika 94 ° C ilk denatürasyon, tavlama için 30 saniye 30 saniye, 52 ° C için 20 döngü her 94 ° C, 72 ° C 30 sn için 72 uzantısı, ve son uzatma ° C 7 dak.
- PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre Qiagen QiaQuick PCR saflaştırma kiti kullanarak Çoğaltılan DNA ürün arındırmak. Genel olarak, bu deneyler DNA'nın konsantrasyonu ve verim 160 ± 10 ng / ml 50 ul.
- % 2 agaroz jel elektroforezi ile PCR sonra DNA miktarını kontrol edin.
Bölüm 4: 32 P-etiketli RNA in-vitro transkripsiyon ile Üretimi
- 20 ul 5x T7 transkripsiyon tampon, 7.5 ul her 100 mM RATP rGTP, rUTP, 1 ul 100: aşağıdaki gibi bazı değişiklikler ile üreticinin talimatlarına göre bir O-halka-kapaklı, 1.6-ml tüp transkripsiyon reaksiyonu kadar ayarlayın mM rCTP, 2 ul α 32 P-CTP (3000 Ci / mmol), 5-10 mikrogram saflaştırılmış DNA örneğinin (~ 30-40 ul DNA ürün saflaştırılmış), 10 ul enzim karışımı ve makyaj son hacmi 100 ul nükleaz içermeyen su ekleyerek.
- Çözüm bir pipetle yavaşça karıştırın, karışımın santrifüj ve 37 ° ° C'de bir gece inkübe edin.
- Reaksiyon sonunda, DNA şablon kaldırılmalıdır. 37 1 U / mg DNA ve 4 saat inkübe bir konsantrasyon RQ1 RNaz-ücretsiz DNaz ° C DNA şablonu sindirmek için.
- Kloroform: izoamil alkol (125:24:1, pH 4.7), 4 saat sonra, 1 hacim sitrat-doymuş fenol ekleyerek RNA ayıklamak. 2 dakika süreyle 16.000 g ~ 1 dak ve santrifüj bir vorteks ile karıştırın.
- Üst, sulu faz temiz bir tüpe aktarın veya bir mikropipet kullanarak aspirasyon alt faz atın. Izoamil alkol (24:1), 4.4 'de açıklandığı gibi 1 dakika ve santrifüj bir girdap karıştırmak: 1 hacim kloroform ekleyin.
- Üst, sulu faz temiz bir tüpe aktarın veya bir mikropipet kullanarak aspirasyon alt faz atın. Kalıntı kloroform mikropipet ile alt faz mikrosantrifüj ve kaldırma hızlı bir spin (10 saniye) yaparak çıkarılabilir. Bu adımda, supernate ziyade alt faz kaldırmak için daha kolay olur.
- RNA çöktürmek için, 0.1-ciltlik 3M sodyum asetat eşdeğer, pH 5.2, ve 1-2-propanol hacmi eşdeğer ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika için -20 ° C derin dondurucuda yer.
- 15 dakika sonra, en yüksek hızda spin, tercihen buzdolabında mikrosantrifüj 4 ° C, 20-30 dakika süreyle RNA ürün çökelek.
- Supernate dikkatle aspire, 0.5 ml% 70 etanol, 4 ° C'de santrifüj RNA pelet yıkama ve aspirasyon etanol atmak.
- RNA pelet içeren tüp bir ısı bloğu aktarın ve 5 dakika boyunca 37 pelet ° C kuru.
- In-vitro transkripsiyon reaksiyonu, yani 100 ul (adım 4.1) ile aynı hacmi 150 mM STE tamponu, pH 8.0 (gösterime ProbeQuant G-50 microcolumns ile sağlanan) veya nukleaz serbest su RNA örnek çözülür.
- RNA ürünü içeren 70 ° C 10 dakika, bir girdap bir ısı blok ve mix RNA çözülme kolaylaştırmak için tüp ısıtın.
- Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle en yüksek hızda santrifüjleyin.
- Sintilasyon sayma ve TBE üre poliakrilamid jel elektroforezi (Part 6) etiketli 0.6 ml tüp RNA 1-ul kısım tutun.
Bölüm 5: Kaldırma, tüzel kişiliği olmayan nükleotidlerin RNA tuzsuzlaştırma ve sintilasyon sayım
Tüzel kişiliği olmayan nükleotidlerin kaldırmak için iki adet G-50 sütun, üreticinin talimatlarına göre kullanın.
- Reçine tekrar süspansiyon bir girdap haricindekileri sütun ve karıştırın.
- Kitinde verilen plastik aracını kullanarak perforasyonu sütunların alt kapatılması çekin ve prize bakir bıraktığınızdan emin olun. Kap, bir çeyrek tur gevşetin ve G sağlanan temiz toplama tüpleri içine sütun-50 Kiti.
- Depolama tampon kaldırmak için 1 dakika için 730 g toplama tüpleri sütunların Spin.
- , Iki yeni O-ring-kapaklı, 1.6 ml tüpler sütunlar transferi ve 50 32 ul P-etiketli reçine rahatsızlık vermesini olmadan doğrudan reçine üzerine kolon başına RNA örnek. yüklemek
- Saflaştırılmış etiketli RNA toplamak için 2 dakika süreyle 730 g dönerler. Bu adımdan sonra, sütunlar atın.
- G-50-saflaştırılmış RNA 1 ul sintilasyon sayma ve elektroforez (Part 6) için 0.6 ml tüp aktarın. Mağaza stok RNA SELEX için kullanmak kadar -20 ° C'de. Bu RNA faaliyet bozulması ve kaybı önlemek için etiketleme sonra 2 gün içinde kullanılmasını arzu edilir.
- Sintilasyon sayacı kullanarak dakikada (cpm / ml) sayılarını ölçmek için 4.14 ve 5.6 adımları iki 1-ul RNA alikotları kullanın. Burada, Triathler tezgah üstü sintilasyon sayacı kullanın.
- Triathler ile sağlanan 32 P sayımı için kullanılan plastik adaptör içinde RNA örnek içeren tüpler, aktarın. Sayma odasının içine tüp ve adaptörü koyun haznesinin kapağını kapatın, 32 P sayma seçin ve başlamak için saymaya başlayacaktır.
- % Etiket kuruluş, yani α 32 P-CTP = (cpm / ml için "G-50" örnek ÷ "TOPLAM" örnek cpm / ul) x 100% birleşme hesaplayın. TOPLAM örnek G-50 arıtma önce örnek.
- Sintilasyon sayımı ve yüzde esas hesaplama sonra, RNA ve RNA'nın spesifik aktivite verim hesaplar. Örneğin, RNA havuzu için sayıları önce (237.370 kopyaya / ml) ve sonrasında G-50 arıtma verimi (191.330 kopyaya / ml)% 81 ortaklık, sonra aşağıdaki RNA verim almadan önce hesaplanır:
Adım 4.1 'den, 3000 Ci / mmol / 10 μCi ul α 32 P-CTP miktarı:
.
Kullanılan unlabeled CTP miktarı:
.
CTP kullanılan toplam tutarı 100006.7pmol. RNA molekül ağırlığı aşağıdaki gibi hesaplanır
321,45 g / mol 27 ortalama rNTPs kitlesi olduğu, 100 bp sıradaki üslerinin sayısı ve 17 baz puan (bp) transkripsiyonu değildir T7 organizatörü üsleri sayıdır. Oligonükleotid molekül ağırlığı 61,96 gr / mol Çıkarma hesabı HPO 2 (63,98) kaldırılması ve iki hidrojen atomu (2.02) 27 ek içine alır. Çünkü, tüm CTP üretilen RNA olurdu teorik kütle dahil olsaydı 4 rNTPs, CTP, sınırlayıcı reaktif:
.
Ancak,% 81 ortaklık, bu kitle 2156 mikrogram. RNA mikrogram başına sayar olurdu
100 ul transkripsiyon reaksiyon hacmi ve mol açısından: 26618,4 mikrogram / mol x 8874 cpm / mg = 2.4x10 8 cpm / mol. Örneğin hesaplanabilir Burada, nmol ve uygun hacmi RNA miktar protein ile inkübasyon için kullanılan, 5 ul RNA ~ 4 nmol RNA, yani içerecektir
Bu deneylerde, 100 nmol RNA 1 nmol protein ve 4 nmol 300 pmol 21 kullanıldı.
. 
. 
. 
Bölüm 6: elektroforez ve otoradyografi RNA ürün karakterizasyonu
- Elektroforez örnekleri hazırlamak için sırasıyla 4.14 ve 5.6 adımları arıtma G-50 öncesi ve sonrası RNA 1-ul alikotları. 4 ul STE tampon ve 5 ul 2x Novex TBE-Üre Örnek Tampon ekleyin.
- 70 örnekleri Isı ° C RNA elektroforezi (jel çözünürlük ve ısıtma olmadan RNA örneklerinin bu deney düzeneği aynı olduğundan ısıtma gereksiz olduğu tespit edildi) için, genellikle tavsiye edildiği gibi, 5 dk.
- % 6 TBE-üre-poliakrilamid jel jel çalışan aparat birleştirin, 1x Novex TBE-Üre Koşu Tampon ile iç ve dış odaları doldurmak. 1 ml pipet ile tampon kullanarak prekast jel kuyu durulayın.
- RNA tüpleri, santrifüj ve yük jel yükleme ipuçlarını kullanarak örnekleri (10 ul toplam). 50 dakika için 180 V jel çalıştırın.
- 50 dakika sonra, plastik kalıp dışında kırarak jel sökmeye çıkarın ve jel kalıp sadece kısa desteğiyle atmak, ancak jel için bir destek olarak uzun desteğiyle bırakın.
- Decon (veya diğer uygun radyoaktivite dekontaminant) tüm kirlenmesine neden olan radyoaktif lekeler çıkarıldığından emin çalışma alanının yüzeyini temizleyin.
- Iki kat plastik Saran wrap yatıyordu; iki uğraşıyorlardı plastik wrap jel ve plastik arka sarın.
- Plastik bir levha sarılmış jel Açığagüvenli ışığı altında karanlık bir odada bir pozlama kaset içinde utoradiography x-ray film,. Kaset için -20 ° C'de 60-90 dakika bırakın.
- 60-90 dakika sonra otomatik bir film geliştirici (Şekil 2) kullanarak güvenli bir ışık altında karanlık bir odada film geliştirin.
Bölüm 7: RNA protein kuluçka ve filtre bağlama
Birincisi, RNA ve protein çözüm inkübe edilir ve daha sonra protein bağlamak RNA dizileri, bağlayıcı olmayan ayrılır. SELEX döngüleri ilerledikçe, filtre bağlayıcı bir protein RNA bağlayıcı zenginleştirme bir göstergesi verecektir.
- Denatürasyon için 10 dakika ve daha sonra yavaş Yeniden doğallaştırmanın 10 dakika oda sıcaklığında, 90 ° C'de RNA inkübe edin.
- 8 ul 60 mM NaOH adım 2.12 protein çözülür ve 36 ul nükleaz içermeyen deiyonize su ekleyin. 1 dakika boyunca karışımı sonikasyon ve 36 ul 2x RNA bağlayıcı tampon (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, pH 7.5) ekleyin.
- 20 ul 10x RNA bağlayıcı tampon ile uygun miktarda RNA nükleaz ücretsiz su ekleyerek karıştırın ve hacmi 200 ul makyaj. Tüp "negatif kontrol." Etiket
- 20 ul 10x RNA bağlayıcı tampon ile 20 ul protein ve RNA istenilen miktarda karıştırın ve nükleaz içermeyen su ile 200 ul birimi oluşturacak. "Tepki" tüp etiketleyin.
- Mix ve tüpler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu arada, bir sonraki adım için filtreler ve filtre-bağlayıcı kurulum hazırlayın.
- 125 ml'lik bir yan kol şişesi, bir vakum girişine takın. Yan kol balon filtre için bir ön temizleme, gözenekli cam destek yerleştirin.
- 10-15 dakika süreyle 35x10 mm Petri kabında 1x RNA bağlayıcı tampon 2-3 ml 3 filtre membranlar dengelenmesi. İlk filtre vakum emme ayarlamak için kullanılır, ikinci RNA tek başına kullanılır, negatif kontrol filtre, bağlama, ve üçüncü bir RNA-protein karışımı filtre bağlama için kullanılır.
- 30 dakika sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca en yüksek hızda bağlama reaksiyonu ve kontrol tüpler santrifüj.
- Vakum açın ve gözenekli camına ilk membran yerleştirin. Mikropipet kullanarak, membran üzerine 0.5 ml RNA bağlayıcı tampon damla ve her bir tampon damla zarından yavaş akışına izin vermek için vakum ayarlayabilirsiniz.
- Ikinci bir membran gözenekli cam üzerine yerleştirin ve aynı akış hızı, membran üzerine negatif kontrol uygulanır.
- Membran yıkama ve flow-through atmak için 1x RNA bağlayıcı tampon 4x0.5 ml alikotları uygulayın. Ön temizleme isteniyorsa, flow-through RNA ekstraksiyonu için tutulur. Ön temizleme filtre bağlamak RNA dizileri ortadan kaldırır.
- Sintilasyon sayımı için, buna paralel olarak etiketli 1.6 ml tüp içine negatif kontrol membran ve yer çıkarın.
- Gözenekli cam önceden temizlenmiş ikinci gözenekli cam desteği ile değiştirin.
- Gözenekli cam üzerine üçüncü disk yerleştirin ve reaksiyon karışımı uygulamak. Adım 7.11 gibi filtre yıkayın ve flow-through atın. SELEX koşullarının darlığı artırmak için daha sonra SELEX döngüleri yıkama sayısı artırılabilir.
- "Reaksiyon karışımı" etiketli bir 1.6 ml tüp içine filtre disk ve çıkarın ve sintilasyon sayarak tutun.
- Adım 5.8 gibi sayma sintilasyon yapın ve ilgili filtreler için sayıları bir yere not edin.
- Membranlar (% bağlayıcı) uygulanan toplam miktarı radyoaktivite göre filtre bağlı radyoaktivite düzeyini hesaplayın. Bu SELEX ilerledikçe bağlayıcı zenginleştirme bir göstergesi verecektir.
Bölüm 8: filtreleri RNA ekstraksiyonu
RNA, protein bağlama dizileri elde etmek için filtreler elde edilir. Bu diziler, bir sonraki SELEX döngü için güçlendirilir.
- Sintilasyon sayma sonra, temiz, kuru, 35x10 mm Petri kabı içine tüp filtre bağlayıcı reaksiyon (7.15 adım) ve yer çıkarın.
- Membran küçük parçalar halinde kesmek için temiz bir neşter ve bir cımbız kullanın.
- Cımbız kullanarak, 8.1 adım aynı etiketli tüp membran kesme parçaları değiştirin.
- 400 ul elüsyon tampon (7 M üre, 3 mM EDTA, 100 mM sodyum sitrat, pH 5.0) ekleyin ve tüp 95 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Oda sıcaklığında en yüksek hızda tüp aspirat, Santrifüj ve etiketli yeni bir tüp içine çıkarma tereyağı toplamak.
- Ekstraksiyon verimliliğini değerlendirmek için sayma sintilasyon membran parçaları içeren tüp içinde kalan radyoaktivite sayımları ölçün.
- (Adım 8,4-8,6) çıkartma işlemi üç kez tekrarlayın. 3 ekstraksiyon verimliliği sonra, genellikle 95-96% ~.
- Kloroform: izoamil alkol (125:24:1). RNA özleri içeren tüplerde, sitrat-doymuş 1 hacim fenol (pH 4.7) (400 ul) ~ 1 dk ve centrifu için bir girdap Mix2 dakika süreyle 16.000 g ge.
- Üst, sulu faz temiz bir tüpe aktarın veya bir mikropipet kullanarak aspirasyon alt faz atın.
- Izoamil alkol (24:1), 2 dakika süreyle 16.000 g, 1 dakika ve santrifüj bir girdap karışımı: 1 hacim kloroform ekleyin .
- Üst, sulu faz temiz bir tüpe aktarın veya bir mikropipet kullanarak aspirasyon alt faz atın.
- RNA çöktürmek için, 0,1 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 RNA coprecipitant 3-4 ul glikojen (10 mg / ml) ve 2-propanol 1 hacim eşdeğer ekleyin. Mix ve gece -20 ° C derin dondurucuya yerleştirin.
- 8.12 adım RNA çöktürmek için, tercihen bir mikrosantrifüj 4 ° C, 20-30 dakika süreyle en yüksek hızda Spin.
- Santrifüj sonra, RNA zor görünür bir sıvı faz ayırır. Tüpün alt kısmında bu zor görünür Yağışlı faz yerinden oynatmamaya olmadan supernate dikkatlice aspire edin.
- RNA "pellet" 0.5 ml% 70 etanol ile yıkayın, en yüksek hızda 5 dakika santrifüj 4 ° C ve zor görünür Yağışlı faz yerinden oynatmamaya aspirasyon etanol atmak.
- 50 ul STE tampon RNA pelet çözülür ve 5. adımda olduğu gibi G-50 arındırma işlemine devam edin.
Bölüm 9: devam SELEX döngüleri için ters transkripsiyon ve PCR
SELEX sonraki döngüsü devam etmek için, RNA ve DNA ters transkripsiyonu ve PCR ile amplifiye olması gerekir.
- 5 0.6 ml tüpler, etiketli saflaştırılmış 3 ul, 8-kat-seyreltilmiş ters astar 2 ul ile G-50-desalted RNA karışımı. Etiket bir tüp negatif kontrol edin. '
- RNA astar hibridizasyon izin karışım 70 ° C 'de 5 dakika süreyle ve daha sonra başka bir 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Buz üzerinde bu karışım, 6.4 ul nükleaz içermeyen su, 4 ul ImProm-II 5x reaksiyon tamponu, 1.6 ul 25 mM MgCl 2, 1 ul 10 mM dNTP karışımı, 1 ul RNasein Ribonükleaz İnhibitörü, 1 ul ImProm-II Reverse Transcriptase eklemek toplam 15 ul.
- Negatif kontrol için, 7.4 ul nükleaz içermeyen su ekleyin ve ters transkriptaz dışarıda bırakın. Buna göre tüpler Etiket. Negatif kontrol önceki bir döngü DNA kirlenmesine sonraki SELEX döngüsü için amplifiye değil olduğunu doğrulamak için dahildir. Bu adım adım 4.3 RQ1 RNaz ücretsiz DNaz DNA örneğinin sindirim etkinliğini sınar.
- Sırasıyla ilk 70 iplikli DNA, tavlama ve uzatılması için 1 saat 5 dakika, 42 ° C - 25 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe termal cycler kullanın ° C de 15 dakika süreyle ters transkriptaz inaktive.
- Ters transkripsiyon reaksiyonu sonra, PCR karışımı kurdu. 30 ul nükleaz içermeyen su, 10 ul 10x Taq tampon, 30 ul 25 mM MgCl 2, 7 ul 10 mM dNTP karışımı, her astar 1 ul ve tüm tüpleri 1 ul Taq polimeraz ekleyin.
- Bölüm 3 için 9-14 döngüleri gibi PCR programı çalıştırın.
- Adım 3.3 'de DNA ürün arındırın.
- 15-20 dk (Şekil 3) 100 V% 2'lik agaroz 2 ul DNA yükleme boya ve electrophorese 8 ul DNA ürün karıştırın.
- DNA ürün Bölüm 4 olarak etiketlenmiş RNA transkripsiyonu ve SELEX sonraki çevrimi için kullanılmak üzere hazırdır.
Bölüm 10: Temsilcilik Sonuçlar
SELEX deneylerde, hedef, her döngü için kullanılan RNA kalitesi ve her döngüden sonra başarılı RNA ekstraksiyonu ve amplifikasyon olarak kullanılan Aβ40 oligomerlerinin niteliği önemlidir. Biz PICUP sonra SELEX arıtma ve çapraz-bağlantı reaktifler kaldırılması için bir oligomerik Aβ40 karışımı üretmek için kullanılır. Bölüm 2 açıklanan tuzsuzlaştırma deneyler genellikle% 50-55 protein kaybına neden olur. Protein miktarı ve kalitesi absorbans ölçümleri (λ = 280) ve SDS-PAGE (Şekil 1) kullanılarak değerlendirildi. Bu deneylerin birinde yıkandı, Aβ40 tipik bir SDS-PAGE profili kaplanacağı 5 bireysel deneyler Aβ40 Eluatlar ortalama absorbans profili Şekil 1'de gösterilmiştir. Veri protein fraksiyonları 3-5 ve 6 fraksiyonu sonra Zehir çapraz bağlama reaktifler (fraksiyonu 7, Şekil 1 artış absorbans) sürekli sütun elutes olduğunu göstermektedir. SDS-PAGE tipik Aβ40 oligomer dağıtım 22 gösterir. Bu dağıtım protein fraksiyonları, (2.11) liyofilize HFIP (2.11), resolubilized (7.1) ile tedavi edilen ve SDS-PAGE ile analiz edildikten sonra tekrarlanabilir oldu.
Her SELEX döngüsü için RNA Bütünlük nükleaz duyarlı Ribo-oligonükleotidler özellikle, SELEX, ilerlemesi iteratif için de önemlidir. RNA'nın amplifikasyonu ve etiketleme (Bölüm 4) sonra, etiketli RNA kalite TBE-üre-poliakrilamid jel elektroforezi ile tespit edilebilir. Sağlam bir etiketli RNA ürün tipik bir profili öncesi ve sonrası arıtma G-50 (PMadde 5), Şekil 2'de gösterilmiştir.
Her SELEX döngüsünden sonra, RNA bağlayıcı sonra filtre membran (8) ve PCR için DNA (Adım 9.5) (Part 9) ters transkripsiyonu elde edilir. Önceki bir döngü DNA örneğinin sonra, bir sonraki döngü için 32 P-RNA (Bölüm 4) etiketli oluşturmak için kullanılır . Kirlenmesine neden olan DNA örneğinin bir önceki döngüsü bazı in-vitro transkripsiyon reaksiyonlar (Bölüm 4) sonra etiketli RNA ürün devam ederse, daha fazla devir talep SELEX döngüleri verimlilik, azaltılmış olacaktır. Bu kontrol için, her SELEX döngüsü ve ilgili ters transkripsiyon PCR reaksiyonu sonra agaroz elektroforez (9.12) yapılır. Negatif kontrol reaksiyon tüpleri (9.4) DNA ürün yokluğu bir önceki SELEX döngüsü (Şekil 3) kaynaklanan DNA şablonu başarılı kaldırma gösterir. PCR ile DNA amplifikasyonu negatif kontrol tüpü görülürse, RQ1 DNaz (4.3) ile kuluçka süresi uzun süreli olması tavsiye edilir. RQ1 DNaz ile üretici tarafından önerilen inkübasyon süresi 15 dakika, ancak biz daha uzun inkubasyon (4-5 saat) (Şekil 3) DNA tamamen kaldırmak için gerekli olduğunu bulmuştur.
Şekil 1: SDS-PAGE ve PICUP oluşturulan desalted Aβ40 oligomerler absorbans profili. Ortalama 5 ayrı tuzsuzlaştırma sütunlarından absorbans Profil ve temsili bir jel üzerinde örtülür oldu. Molekül ağırlığı işaretleri sağ tarafta gösterilmiştir.
Şekil 2 RNA ürünün TBE-üre-poliakrilamid jel elektroforezi önce ve saflaştırma G-50 sonrası. Belirtildiği gibi RNA ürünün göç yönünün katottan anoda.
Şekil 3 ters transkripsiyon ve PCR sonra DNA ürün agaroz jel elektroforez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SELEX sürecinin başlangıç noktası, genellikle 10 12 -10 15 dizileri içeren bir rasgele oligonükleotid kütüphane sentezi . RNA SELEX, burada gösterdi ise DNA SELEX, bu kütüphane, bir ssDNA havuz oluşturulur sonra doğrudan kullanılır, ssDNA kütüphane in-vitro transkripsiyon tarafından enzimatik bir RNA havuzu ilk dönüştürülür. Sonra her döngü maruz kalma ve amaçlanan hedef için oligonükleotidler bağlayıcı oluşur sayede SELEX bağlayıcı olmayan dizileri ve bağlayıcı dizilerinin elüsyon bağlayıcı bölümleme, iteratif yapılır. Daha sonra döngüleri, hedef ve RNA ve / veya yıkama sayısı stokiyometri değişmiş olabilir, ya da rekabet inhibitörleri SELEX koşullarının darlığı artırmak için bağlayıcı olan ya da yıkama tamponu eklenebilir. Filtre bağlama, çeşitli yöntemler bağlayıcı ve bölümleme için 28 tarif edilmiştir rağmen SELEX 10 için kullanılan bir klasik, basit ve hızlı bir yöntemdir . Filtre bağlama çözüm RNA hedef etkileşimleri yakalama ve seçimi için idealdir. Seçim hedefleri küçük moleküller veya peptidler, filtre bağlanmasında kullanılan membran gözenek boyutu, sınırlayıcı bir faktör ve önemli bir göz haline gelir.
Elüsyon ardından, hedef bağlayıcı oligonükleotidler güçlendirilir ve daha fazla döngüleri için kullanılır. DNA SELEX kullanırken, zenginleştirilmiş havuzu direkt olarak PCR ile amplifiye ve tamamlayıcı dizisi ve DNA etiketleme sindirim sonraki döngü için kullanılan olabilir. RNA SELEX kullanırken, bu havuz ters transkripsiyon yoluyla DNA dönüştürülür ve sonra amplifiye PCR, in-vitro transkripsiyonu ve bir sonraki döngünün devamı için tekrar etiketli olması. Genellikle 8-20 gibi döngüleri, daha sonra klonlanmış ve tek tek aptamers sıralı ve karakterize bir zenginleştirilmiş aptamer havuzu, elde etmek için gereklidir. Fibriler amiloid yapılar için oligonükleotidler doğasında olan ilgisi potansiyel fizyolojik şartlar 21 yaşın altında olmayan fibriler amiloid proteinleri için özel aptamers gelişmesini engellemektedir, çünkü amiloid proteinleri, aptamers karakterizasyonu özellikle önemlidir kullanarak çalışmalar. Oligonükleotidler Bu doğal, sıra-bağımsız bir yakınlığı olmayan fibriler amiloidojenik proteinler 17,19-21 aptamers oluşturmak için amaçlayan çalışmalar fibril çapraz-reaktif aptamers nesil yol açmıştır . Son zamanlarda, Takahashi ve ark. Aβ40 bir oligomerik modeline karşı RNA aptamers nesil ve mikromolar afinite 29 monomerik Aβ reaktivite gösterdi. Ancak, bu aptamers fibriler Aβ40 veya diğer fibriler amiloidojenik proteinleri ile çapraz reaktivite tespit değildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, California Halk Sağlığı Bölümü'nden NIH / NIA ve 07-65798 AG030709 hibe tarafından desteklenmiştir. Peptid sentezi ve amino asit analizi, yardım ve proje destek ve reaktiflerin sağlanması için Dr Chi-Hong B. Chen ilk adımları destekleyen Dr Elizabeth F. Neufeld, ve Dr. Andrew D Margaret M. Condron kabul yararlı tartışmalar için Ellington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polymerase | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega Corp. | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Can be used under red safe light. |
| Membrane discs | EMD Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR international | 26316-696 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega Corp. | A3802 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
References
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
