Summary
Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd door
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve, leeftijd-afhankelijk, neurodegeneratieve aandoening met een verraderlijke cursus die maakt haar presymptomatische diagnose moeilijk 1. Definitieve diagnose AD wordt pas postmortem, dus tot oprichting van presymptomatische, vroege diagnose van AD is cruciaal voor het ontwikkelen en beheren van effectieve therapieën 2,3.
Amyloid β-eiwit (Aß) staat centraal in AD pathogenese. Oplosbaar, oligomere Aß assemblages worden verondersteld om neurotoxiciteit onderliggende synaptische dysfunctie en neuronen verlies zullen beïnvloeden in AD 4,5. Verschillende vormen van oplosbare Aß vergaderingen zijn beschreven, echter, hun onderlinge relaties en de relevantie voor AD etiologie en pathogenese zijn complex en niet goed begrepen 6. De specifieke moleculaire herkenning instrumenten kan ontrafelen van de relaties tussen Aß assemblies en vergemakkelijken detectie en karakterisatie van deze vergaderingen vroeg in het ziekteverloop voordat de symptomen ontstaan. Moleculaire herkenning vertrouwt vaak op antilichamen. Echter, een andere klasse van moleculaire herkenning tools, aptameren, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van antilichamen 7,8. Aptameren worden oligonucleotiden gegenereerd door in-vitro selectie: systematische ontwikkeling van liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) 9,10. SELEX is een iteratief proces dat vergelijkbaar is met de evolutietheorie van Darwin maakt selectie, versterking, verrijking, en bestendiging van een onroerend goed, bijvoorbeeld, Avid, specifieke, ligand binding (aptameren) of katalytische activiteit (ribozymen en DNAzymes).
Ondanks de opkomst van aptameren als hulpmiddelen in de moderne biotechnologie en de geneeskunde 11, zijn ze nog onvoldoende benut in het amyloid veld. Weinig RNA of ssDNA aptameren zijn geselecteerd tegen diverse vormen van prion-eiwitten (PrP) 12-16. Een RNA-aptameer gegenereerd tegen recombinant bovine PrP bleek de runder-PrP β 17 herkennen, een oplosbaar, oligomere, β-sheet-rijke conformationele variant van volledige lengte PrP dat amyloïd fibrillen 18 vormen. Aptameren gegenereerd met behulp van monomere en diverse vormen van fibrillair β 2-microglobuline (β 2 m) bleken fibrillen bepaalde andere amyloidogenic eiwitten binden naast β 2 m fibrillen 19. Ylera et al.. beschreven RNA aptameren geselecteerd op grond van geïmmobiliseerd monomere Aβ40 20. Onverwacht, deze aptameren gebonden fibrillair Aβ40. Al met al deze gegevens maken een aantal belangrijke vragen op. Waarom heeft aptameren geselecteerd op grond van monomere eiwitten herkennen hun polymere vormen? Zou aptameren tegen monomere en / of oligomere vormen van amyloidogenic eiwitten worden verkregen? Om deze vragen te beantwoorden, hebben we geprobeerd om aptameren te selecteren voor covalent-gestabiliseerd oligomere Aβ40 21 gegenereerd met behulp van foto-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) 22,23. Net als bij eerdere bevindingen 17,19,20, deze aptameren reageerde met fibrillen van Aß en enkele andere amyloidogenic eiwitten waarschijnlijk het herkennen van een mogelijk gemeenschappelijke amyloid structurele aptatope 21. Hier presenteren we de SELEX methodologie die wordt gebruikt bij de productie van deze aptameren 21.
Protocol
Deel 1: Eiwit voorbereiding en cross-linking
In eerste instantie wordt het eiwit gebruikt voor SELEX voorbehandeld met 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) tot homogene, totaal vrij van bereidingen, zoals eerder beschreven 23 te verkrijgen. Deze stap is nodig omdat vooraf gevormde aggregaten induceren snelle aggregatie van amyloidogenic eiwitten, wat resulteert in een slechte experimentele reproduceerbaarheid 24, en zijn ongewenst voor de selectie van aptameren voor geaggregeerde, niet-fibrillaire vormen van het eiwit.
- Weeg ~ 800 microgram (~ 180 nmol) pure Aβ40 met behulp van een microbalans. Breng de droge gevriesdroogde peptide in gelabelde, silicium-coating, low-adsorbens 1,6 ml microcentrifuge buizen.
- Los het peptide in 100% 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP, 400 pi) tot 0,5 mm peptide oplossing te verkrijgen zoals eerder is beschreven 23.
- Verdeel deze oplossing in vier 100-ul monsters zodanig dat elke buis ~ 45 nmol Aβ40 nominaal bevat. Ga verder met het verwijderen van HFIP zoals eerder is beschreven 23.
- Voor oplossen van de HFIP behandelde peptiden in buffer voor het verknopen van reacties, de voorbereiding van de cross-linking en quenching reagentia. Weeg ammoniumpersulfaat (APS, MW 228,2 g / mol) en maak een oplossing van 40 mM in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is.
- Bereid 2 mM oplossing van Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydraat (RuBpy, MW 748,63 g / mol) in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex en controleer volledig is opgelost. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie.
- Bereid de quenching reagens. Weeg dithiothreitol (DTT, MW 154,5 g / mol) en los op in gedeïoniseerd water of in de 10-mM natriumfosfaat, pH 7,4, met een M.
- Los van de HFIP behandeld peptide precies zoals eerder beschreven, maar 23,25 streven naar ~ 60 uM peptide oplossing te verkrijgen.
- Voer PICUP om een mengsel van oligomere Aβ40 zoals eerder is beschreven 23 te genereren. Een typische PICUP reactie wordt uitgevoerd in een volume van 20 ui, waar de uiteindelijke concentraties van eiwitten, RuBpy, en APS zijn 30 uM, 0,05 mm en 1 mM, respectievelijk 23. Hier, het mengsel wordt gebruikt voor PICUP bevat 108 ul-eiwit, 6 pl RuBpy, 6 pl APS, en 1 ui DTT en de concentratie van eiwitten, RuBpy, en APS zijn allemaal verdubbeld ten opzichte van de typische reactie. Dit vermindert het aantal PICUP reacties uit te voeren en verhoogt de eiwitconcentratie voor het ontzouten.
Deel 2: Ontzouten het eiwit voorbereiding
Voordat u het eiwit voor SELEX, is ontzouting uitgevoerd om de cross-linking reagentia gebruikt voor PICUP te verwijderen. Dit PICUP reactiemengsel bevat de cross-linking reagentia en ~ 55 uM eiwit (nominale concentratie).
- Verwijder de bovenste dop van een 5-ml ontzouten kolom, ondersteunen de column van een stand, plaats een beker onder de kolom stopcontact en verwijder het stopcontact plug. Laat de opslagbuffer doorstroom en verzamelen in de beker.
- Equilibreren de kolom in 10 mM ammoniumacetaat, pH 8,3. Voeg 5 hars-bed volumes (25 ml) van deze buffer in 3-ml monsters van de kolom en laat het doorheen kan stromen.
- Ondertussen label 8 low-adsorbens, silicium-coating 1,6 ml buizen en leg ze in een buis rek.
- Nadat de column is evenwicht, toe te passen een 0,5 0,7 ml van de PICUP reactiemengsel per kolom per enkele ontzouten gebruik (kolommen kan worden gewassen, opgeslagen, en in evenwicht voor later gebruik). Laat het eiwitmengsel te genieten in de kolom hars en de doorstroming ontdoen in de beker.
- Plaats de eerste collectie buis onder de kolom stopcontact. Voeg 0,5 ml acetaat buffer op de kolom en verzamel de eerste 0,5-ml fractie die door.
- Herhaal de stappen 2.4 en 2.5, en het verzamelen van maximaal acht 0,5-ml fracties in de bijbehorende buizen.
- Aantal nog een set van 8 low-adsorbens, silicium-coating, kleine 0,6 ml buizen en plaats ze in een rack. Label een andere buis als "blank". Neem 150 ul van elke fractie en de overdracht in de gemerkte 0,6 ml buizen. Gebruik 20 ul voor SDS-PAGE-analyse (figuur 1) zoals eerder 23 getoond.
- Transfer 150 ul 10 mM ammoniumacetaat, pH 8,3, in het lege buis. Gebruik deze buis naar de lege in een spectrofotometer.
- Meet de extinctie in 130 pi van elke fractie bij λ = 280 nm in een Quartz cuvette.
- Na de absorptie wordt gemeten, de fracties te combineren met het hoogste eiwitgehalte (meestal fracties 3-5), meng met behulp van een pipet, en houdt een 10-ul aliquot voor aminozuur analyse om de feitelijke eiwitconcentratie (niet getoond) te bepalen.
- Verdeel het monster in meerdere porties van ~ 2 nmol eiwit per buis en lyophilize de monsters in een vriesdroger.
- Na voltooiing van vriesdrogen, behandel de monsters met 100% HFIP als voorheen.
- Bewaar de buisjes bij -20 ° C. Gebruik een buis voor elke SELEX cyclus (zie hieronder).
Deel 3: Versterking van de synthetische willekeurige ssDNA bibliotheek door PCR
De synthetische ssDNA bibliotheek hier gebruikt voor SELEX inbegrepen 49 gerandomiseerde nucleotiden (A: T: G: C = 25:25:25:25%), geflankeerd door een constante regio's die kloneringsplaatsen (Bam HI, Eco RI) en een T7 promotor, zoals eerder beschreven 26.
- Te versterken in de bibliotheek, het opzetten van een standaard PCR-reactie als volgt: 202 pl gedeïoniseerd water, 40 pi 10x Taq DNA-polymerase-buffer, 2 pi ssDNA sjabloon (0,5 nmol), 120 ul 25 mM MgCl2, 28 ul 10 mM deoxynucleoside trifosfaat mix (dNTPs), 1 ui voorwaartse primer (300 pmol), 1 ui reverse primer (300 pmol), en 4 pl Taq polymerase.
- Voer de PCR-reactie met behulp van een thermische cycler met de volgende instellingen: 5 min bij 94 ° C voor de initiële denaturatie, 20 cycli van elk 94 ° C gedurende 30 sec, 52 ° C gedurende 30 sec voor gloeien, 72 ° C gedurende 30 sec voor uitbreiding, en de laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 minuten.
- Na de voltooiing van de PCR-reactie, zuiveren het geamplificeerde DNA product met behulp van de Qiagen QIAquick PCR zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant. Over het algemeen, in deze experimenten de concentratie en de opbrengst van DNA zijn 160 ± 10 ng / ul in 50 ul.
- Controleer de hoeveelheid DNA na PCR met 2% agarose gelelektroforese.
Deel 4: Generatie van 32 P-gelabelde RNA door in-vitro transcriptie
- Stel de transcriptie reactie in een O-ring-capped, 1,6 ml buis volgens de instructies van de fabrikant met een aantal wijzigingen als volgt: 20 pl 5x T7 transcriptie buffer, 7,5 pl elk van de 100 mM RATP, rGTP, rUTP, 1 ui 100 mM rCTP, 2 pi α 32 P-CTP (3000 Ci / mmol), 5-10 ug gezuiverd DNA-template (~ 30-40 ul van het gezuiverde DNA product), 10 pi enzym mix, en make-up het uiteindelijke volume van 100 ul door het toevoegen van nuclease-vrij water.
- Meng voorzichtig de oplossing door een pipet, centrifuge het mengsel, en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Aan het eind van de reactie, de DNA-template verwijderd moet worden. Voeg RQ1 RNase-vrij DNase tot een concentratie van een U / ug template-DNA en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C om de DNA-template verteren.
- Na 4 uur, pak het RNA door het toevoegen van een volume van citraat-verzadigd fenol: chloroform: isoamylalcohol (125:24:1, pH 4,7). Meng door een vortex voor ~ 1 min en centrifugeer bij 16.000 g gedurende 2 minuten.
- Breng de bovenste, waterige fase naar een nieuwe buis of verwijderen van de onderste fase door aspiratie met behulp van een micropipet. Voeg een volume van chloroform: isoamylalcohol (24:1), meng door een vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer, zoals beschreven in 4.4.
- Breng de bovenste, waterige fase naar een nieuwe buis of verwijderen van de onderste fase door aspiratie met behulp van een micropipet. Residuele chloroform kunnen worden verwijderd door het uitvoeren van een snelle spin (10 seconden) in een microcentrifuge en verwijdering van de onderste fase met een micropipet. In deze stap is het gemakkelijker om de onderste fase te verwijderen in plaats van de supernate.
- Voor het neerslaan van de RNA-, voeg 0,1-volume equivalent van 3M natriumacetaat, pH 5,2, en 1-volume dat overeenkomt met 2-propanol. Mix en doe dit in een -20 ° C vriezer voor 15 minuten.
- Na 15 min, draaien op topsnelheid, bij voorkeur in een gekoelde microcentrifuge bij 4 ° C, gedurende 20-30 minuten tot het neerslaan van de RNA-product.
- Zorgvuldig aspireren de supernate, was het RNA pellet met 0,5 ml 70% ethanol, centrifuge bij 4 ° C. Verwijder de ethanol door aspiratie.
- Breng de buis met het RNA pellet aan een warmte-blok en droog de pellet bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Los van de RNA-monster in 150 mM STE buffer, pH 8.0 (meegeleverd met de illustratie ProbeQuant G-50 microcolumns) of nuclease-vrij water om een volume gelijk aan die van de in-vitro transcriptie reactie dat wil zeggen, 100 pl (stap 4.1).
- Verwarm de buis met de RNA-product bij 70 ° C gedurende 10 min in een warmte-blok en meng door een draaikolk naar RNA oplossen ervan te vergemakkelijken.
- Centrifugeer op topsnelheid voor een min bij kamertemperatuur.
- Houd een 1-ul hoeveelheid van RNA in een gelabelde 0,6 ml buis voor scintillatietelling en TBE-ureum polyacrylamide gelelektroforese (Deel 6).
Deel 5: Verwijderen van nucleotiden zonder rechtspersoonlijkheid, RNA ontzouten en scintillatietelling
Voor het verwijderen van de niet opgenomen nucleotiden, gebruik van twee G-50 kolommen volgens instructies van de fabrikant.
- Omgekeerde columns en meng door een vortex aan de hars mengen.
- Snap de bodem sluiting van de kolommen bij perforatie met behulp van de plastic gereedschap voorzien in de kit en zorg ervoor om te vertrekken het stopcontact onaangeroerd. Draai de dop een kwartslag en plaats de kolommen in schoon collectie buizen die in de G-50 Kit.
- Spin de kolommen in de collectie buizen bij 730 g gedurende 1 minuut tot de opslag buffer te verwijderen.
- Overdracht kolommen om twee nieuwe O-ring-capped, 1,6 ml buizen en load 50 ul van 32 P-gelabelde RNA-monster per kolom direct op de hars zonder verstorende de hars.
- Draaien op 730 g voor 2 minuten naar het gezuiverde gelabelde RNA te verzamelen. Na deze stap, gooi de kolommen.
- Overdracht 1 ul van G-50-gezuiverd RNA naar een 0,6 ml buis voor scintillatietelling en elektroforese (Deel 6). Bewaar voorraad RNA bij -20 ° C tot gebruik voor SELEX. Het is wenselijk dat RNA wordt gebruikt binnen 2 dagen na de etikettering de afbraak en verlies van activiteit te voorkomen.
- Gebruik de twee 1-pi RNA monsters uit de stappen 4.14 en 5.6 van de tellingen per minuut (cpm / ul) met behulp van een scintillatieteller te meten. Hier gebruiken we de Triathler bench-top scintillatieteller.
- Breng de buizen met het RNA-monster in de plastic adapter gebruikt voor het tellen van 32 P, voorzien van Triathler. Zet de buis en de adapter in de telkamer, sluit het deksel van de kamer, kies dan 32 P tellen, en druk op start om te beginnen met tellen.
- Bereken% label incorporatie dat wil zeggen,% integratie van α 32 P-CTP = (cpm / ul voor "G-50" monster ÷ cpm / ul voor "TOTAL" sample) x 100. Totale steekproef is de steekproef voor de G-50 zuivering.
- Na scintillatietelling en berekening van de oprichting procent, het berekenen van de opbrengst van RNA en de specifieke activiteit van RNA. Bijvoorbeeld, als het telt voor een pool van RNA voor (237370 cpm / ul) en na G-50 zuivering (191330 cpm / ul) rendement 81% opname, dan is de volgende worden berekend voor het verkrijgen van de opbrengst van RNA:
Vanaf stap 4.1 is het bedrag van α 32 P-CTP bij 3000 Ci / mmol en 10 uCi / ul is:
.
De hoeveelheid van niet-gemerkt CTP gebruikte is:
.
Totaal bedrag van de CTP gebruikte is 100006.7pmol. Het molecuulgewicht van RNA wordt als volgt berekend
waar de 321.45 g / mol 27 is de gemiddelde massa van rNTPs, 100 bp is het aantal bases in de reeks, en 17 bp is het aantal bases in de T7 promoter die niet worden getranscribeerd. Aftrekken van 61,96 g / mol van de oligonucleotide moleculair gewicht houdt rekening met het verwijderen van HPO 2 (63.98) en de toevoeging van twee waterstofatomen (2.02) 27. Want van de vier rNTPs, CTP is de beperkende reagens, als alle CTP zou worden opgenomen de theoretische massa van de geproduceerde RNA zou zijn geweest:
.
Echter, omdat van 81% oprichting, deze massa is nu 2156 microgram. Tellingen per ig RNA zou dan
waar 100 pi is de transcriptie reactie volume, en in termen van mollen: 26618.4 g / mol x 8874 cpm / ug = 2.4x10 8 cpm / mol. Vanaf hier is de hoeveelheid RNA in nmol en het juiste volume gebruikt voor incubatie met eiwit kan bijvoorbeeld worden berekend, zal 5 pi-RNA bevatten ~ 4 nmol RNA, dat wil zeggen,
In deze experimenten werden 300 pmol tot 1 nmol eiwit en 4 nmol tot 100 nmol RNA wordt gebruikt 21.
. 
. 
. 
Deel 6: Karakterisering van de RNA-product door middel van elektroforese en autoradiografie
- Ter voorbereiding van de monsters voor elektroforese, gebruik dan de 1-ul monsters van RNA voor en na de G-50 zuivering uit stappen 4.14 en 5.6, respectievelijk. Voeg ui 4 STE buffer en 5 ul 2x Novex TBE-ureum Sample Buffer.
- Verwarm de monsters bij 70 ° C gedurende 5 min als gewoonlijk wordt aanbevolen voor RNA-elektroforese (verwarming bleek niet nodig, omdat de gel resolutie van de RNA-monsters met en zonder verwarming is het ook in deze experimentele setup).
- Monteer een 6% TBE-ureum-polyacrylamide gel in de gel-running apparaat, vul de binnen-en buitenkant kamers met 1x Novex TBE-ureum Running Buffer. Spoel de putjes in de prefab-gel met behulp van de buffer door een 1-ml pipet.
- Centrifugeer de RNA-buizen en de belasting van de monsters (10 ul in totaal) met behulp van gel-loading tips. Laat de gel op 180 V voor 50 minuten.
- Na 50 min, uit elkaar halen van de gel door breken van de plastic mal, te verwijderen en gooi alleen de kortere steun van de gel vorm, maar laat de langere achterkant als een ondersteuning van de gel.
- Reinig het oppervlak van het werkgebied met Decon (of een andere passende radioactiviteit ontsmettend) zorg ervoor dat alle vervuilende radioactieve plekken worden verwijderd.
- Leg twee lagen plastic Saran wrap, wrap de gel en de plastic steun in de twee-getwijnd plastic wrap.
- Expose de gel verpakt in plastic om een blad van eenutoradiography x-ray film in een cassette belichting in de donkere kamer, onder veilige licht. Laat de cassette bij -20 ° C voor 60-90 minuten.
- Ontwikkel de film in de donkere kamer in veilige licht na 60-90 minuten met behulp van een automatische film ontwikkelaar (figuur 2).
Deel 7: RNA-eiwit incubatie en filter bindend
Eerst worden de RNA en eiwit in oplossing geïncubeerd en vervolgens de RNA-sequenties die zich binden aan het eiwit worden gescheiden van de niet-binders. Als SELEX cycli vooruitgang, zullen filter binding geeft een indicatie van de eiwit-RNA-binding verrijking.
- Incubeer de RNA bij 90 ° C gedurende 10 minuten voor denaturatie en daarna bij kamertemperatuur gedurende 10 min. voor trage renaturatie.
- Los het eiwit uit stap 2,12 in 8 ul 60 mM NaOH en voeg 36 ul nuclease-vrij gedeïoniseerd water. Sonificeer het mengsel gedurende 1 minuut en voeg 36 ul 2x RNA-bindende buffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7,5).
- Meng de juiste hoeveelheid RNA met 20 ui 10x RNA bindingsbuffer en maken het volume tot 200 ui door het toevoegen van nuclease-vrij water. Etiket de tube "negatieve controle."
- Mix 20 ul eiwit en de gewenste hoeveelheid van het RNA met 20 ui 10x RNA bindingsbuffer en maken het volume tot 200 ul met nuclease-vrij water. Etiket de tube "reactie".
- En incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ondertussen bereiden de filters en het filter-bindende set-up voor de volgende stap.
- Bevestig een 125-ml side-arm kolf met een vacuüm inlaat. Plaats een pre-gereinigd, poreuze glas ondersteuning van het filter aan de zijkant-arm kolf.
- Equilibreren 3 filter membranen in 2-3 ml 1x RNA bindende buffer in een 35x10-mm Petri schaal voor 10-15 minuten. Het eerste filter zal gebruikt worden voor het aanpassen van het vacuüm zuigen, de tweede zal worden gebruikt voor RNA-alone, zal een negatieve-control filter binding, en de derde worden gebruikt voor het filter binding van het RNA-eiwit mengsel.
- Na 30 min, centrifuge de binding reactie en de controle-buizen op topsnelheid gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet het vacuüm en plaats de eerste membraan op de poreuze glas. Met behulp van een micropipet infuus 0,5 ml van RNA bindingsbuffer op het membraan en pas het vacuüm te vertragen stroom van elke buffer druppel toe te staan door het membraan.
- Leg de tweede membraan op het poreuze glas en met behulp van dezelfde debiet, past u de negatieve controle op het membraan.
- Van toepassing zijn 4x0.5 ml porties van 1 x RNA bindende buffer aan het membraan te wassen en de doorstroming te ontdoen. Merk op dat als pre-clearing gewenst is, de doorstroming wordt gehouden voor de RNA-extractie. Pre-clearing verwijdert RNA-sequenties die zich binden aan het filter.
- Verwijder de negatieve controle membraan en plaatsen in een navenant-gelabeld 1,6 ml buis voor scintillatietelling.
- Vervang de poreuze glas met een pre-gereinigde seconden poreuze glas te ondersteunen.
- Plaats van de derde schijf naar de poreuze glas en toe te passen het reactiemengsel. Was het filter zoals in stap 7.11 en gooi de doorstroming. Het aantal wasbeurten kan verhoogd worden in latere SELEX cycli om de striktheid van SELEX conditie verhogen.
- Verwijder het filter schijf en plaats in een 1,6 ml tube met het label "reactiemengsel" en te houden voor scintillatietelling.
- Voer scintillatietelling zoals in stap 5.8 en noteer de tellingen voor de betreffende filters.
- Bereken het niveau van de filter-gebonden radioactiviteit ten opzichte van de totale hoeveelheid radioactiviteit toegepast op de membranen (% binding). Dit geeft een indicatie van de binding verrijking als SELEX vordert.
Deel 8: RNA-extractie van de filters
RNA wordt geëxtraheerd uit de filters om de sequenties die binden aan het eiwit te verkrijgen. Deze sequenties worden versterkt voor de volgende SELEX cyclus.
- Na scintillatietelling, verwijdert u de binding-reactie filter van de buis (van stap 7.15) en plaats in een schone, droge, 35x10 mm petrischaal.
- Gebruik een schone scalpel en een pincet aan het membraan in kleine stukjes snijden.
- Met behulp van de pincet, vervang dan de gesneden stukken van het membraan in dezelfde gemerkte buis uit stap 8.1.
- Voeg 400 ul elutiebuffer (7 M ureum, 3 mM EDTA, 100 mM natriumcitraat, pH 5,0) en incubeer de buis op 95 ° C gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de buis op topsnelheid bij kamertemperatuur, aspireren, en het verzamelen van de extractie boter in een nieuw label buis.
- Meet de resterende radioactiviteit tellingen in het buisje met het membraan stukken van scintillatietelling aan de extractie-efficiëntie te beoordelen.
- Driemaal herhalen de extractie proces (stappen 8.4 tot 8.6). Het rendement na 3 extracties is meestal ~ 95-96%.
- In de buizen met de RNA-extracten, voeg 1 volume (400 ul) van citraat-verzadigde (pH 4,7) fenol: chloroform: isoamylalcohol (125:24:1). Meng door een vortex voor ~ 1 min en centrifuge bij 16.000 g gedurende 2 minuten.
- Breng de bovenste, waterige fase naar een nieuwe buis of verwijderen van de onderste fase door aspiratie met behulp van een micropipet.
- Voeg een volume van chloroform: isoamylalcohol (24:1), meng door een vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer bij 16.000 g gedurende 2 minuten.
- Breng de bovenste, waterige fase naar een nieuwe buis of verwijderen van de onderste fase door aspiratie met behulp van een micropipet.
- Voor het neerslaan van de RNA-, voeg 0,1 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, 3-4 ui glycogeen (10 ug / ul) als RNA coprecipitant, en een volume dat overeenkomt met 2-propanol. Mix en doe dit in een -20 ° C vriezer gedurende de nacht.
- Draaien op topsnelheid, bij voorkeur in een microcentrifuge bij 4 ° C, gedurende 20-30 minuten voor het neerslaan van het RNA van stap 8.12.
- Na het centrifugeren, de RNA-scheidt in een vloeibare fase die is nauwelijks zichtbaar. Zorgvuldig aspireren de supernate zonder verdrijven dit nauwelijks zichtbaar flocculant fase op de bodem van de buis.
- Was de RNA "pellet" met 0,5 ml 70% ethanol, centrifuge gedurende 5 minuten op topsnelheid bij 4 ° C. Verwijder de ethanol door aspiratie, zonder loskomen van de nauwelijks zichtbare neerslagmiddel fase.
- Los van de RNA pellet in 50 ui STE buffer en ga verder met G-50 zuivering zoals in stap 5.
Deel 9: Reverse transcriptie en PCR voor de voortzetting van SELEX cycli
Te gaan tot de volgende cyclus van SELEX, RNA moet reverse-transcriptie van DNA en versterkt door PCR.
- In 5 gelabeld 0,6 ml buizen, mix 3 ul van het gezuiverde, G-50-ontzout RNA met 2 pl 8-voudige verdunde reverse primer. Label een tube 'negatieve controle. "
- Incubeer het mengsel bij 70 ° C gedurende 5 minuten, en daarna op ijs nog 5 min om hybridisatie van de primer op de RNA mogelijk te maken.
- Aan dit mengsel op ijs, voeg 6,4 pl nuclease-vrij water, 4 ul ImProm-II 5x reactie buffer, 1,6 ul 25 mM MgCl2, 1 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui RNasein ribonucleaseremmer, 1 ui ImProm-II reverse transcriptaseremmers die deel uitmaken van een totaal van 15 pl.
- Voor de negatieve controle, voeg 7,4 pl nuclease-vrij water en laat de reverse transcriptase. Dienovereenkomstig het etiket van de buizen. De negatieve controle is opgenomen om te controleren of besmetten DNA uit een vorige cyclus niet wordt versterkt voor de volgende SELEX cyclus. Deze stap testen van de effectiviteit van de spijsvertering van DNA-template door RQ1 RNase-vrij DNase in stap 4.3.
- Gebruik een thermal cycler aan het reactiemengsel incubeer bij 25 ° C gedurende 5 min, 42 ° C gedurende 1 uur voor de annealing en uitbreiding van de eerste streng DNA, respectievelijk gevolgd door de 70 ° C gedurende 15 min om de reverse transcriptase te inactiveren.
- Na de reverse-transcriptie reactie, het opzetten van de PCR-mix. Voeg 30 ul nuclease-vrij water, 10 pl Taq 10x buffer, 30 ul 25 mM MgCl 2, 7 il 10 mM dNTP mix, 1 ui van elke primer en 1 pl Taq-polymerase in de buizen.
- Voer het PCR-programma als in deel 3 voor 9-14 cycli.
- Zuiveren het DNA product als in stap 3.3.
- Mix 8 ul-DNA product, met 2 ui DNA laden kleurstof en electrophorese op 2% agarose bij 100 V voor 15-20 min (figuur 3).
- DNA-product is klaar om te worden getranscribeerd om gelabeld RNA als in deel 4 en gebruikt voor de volgende cyclus van SELEX.
Deel 10: representatieve resultaten
In SELEX experimenten, de aard van de Aβ40 oligomeren worden gebruikt als het doel, de kwaliteit van het RNA wordt gebruikt voor elke cyclus, en succesvolle RNA-extractie en de versterking na elke cyclus zijn belangrijk. We gebruikten PICUP om een oligomeer Aβ40 mengsel voor SELEX na zuivering en het verwijderen van de cross-linking reagentia te genereren. Het ontzouten experimenten beschreven in deel 2 leiden meestal tot 50-55% eiwit verlies. Het eiwit hoeveelheid en de kwaliteit kan worden beoordeeld met behulp van absorptie-metingen (λ = 280) en SDS-PAGE (figuur 1). De gemiddelde absorptie profiel van Aβ40 eluaten uit 5 individuele experimenten bedekken een typisch SDS-PAGE profiel van Aβ40 geëlueerd in een van die experimenten zijn weergegeven in figuur 1. De gegevens tonen aan dat het eiwit consequent elueert uit de kolom in fracties 3-5 en de cross-linking reagentia elueren na fractie 6 (verhoogde absorptie in fractie 7, figuur 1). SDS-PAGE toont de typische Aβ40 oligomeer distributie 22. Deze verdeling was reproduceerbaar na het eiwit fracties werden gevriesdroogd (2,11), behandeld met HFIP (2.11), resolubilized (7.1), en opnieuw geanalyseerd door SDS-PAGE.
Integriteit van RNA voor elke SELEX cyclus is ook van belang voor iteratieve progressie van SELEX, vooral wanneer nuclease-gevoelige ribofla-oligonucleotiden worden gebruikt. Na de RNA-amplificatie en labeling (Deel 4), kan de kwaliteit van de gelabelde RNA worden beoordeeld door TBE-ureum-polyacrylamide gel elektroforese. Een typische profiel van een intacte gelabeld RNA-product voor en na de G-50 zuivering (Part 5) is weergegeven in figuur 2.
Na elke SELEX cyclus, is RNA geëxtraheerd uit de membraan filter na binding (deel 8) en reverse-transcriptie (deel 9) om DNA voor de PCR-amplificatie (stap 9.5). De DNA-sjabloon uit een vorige cyclus wordt vervolgens gebruikt om 32 P-gelabelde RNA (deel 4) voor de volgende cyclus te genereren. Als sommige besmetten DNA-sjabloon uit een vorige cyclus volhardt in het gelabelde RNA-product na in-vitro transcriptie reacties (deel 4), zal de efficiëntie van SELEX cycli worden verminderd, eisen meer cycli. Om te controleren voor deze, na elke SELEX cyclus en de bijbehorende reverse-transcriptie PCR-reactie, is agarose elektroforese uitgevoerd (9.12). Afwezigheid van DNA product in de negatieve controle reactie buizen (9.4) geeft succesvolle verwijdering van de DNA-template afkomstig van een eerdere SELEX cyclus (figuur 3). Als DNA-amplificatie door PCR wordt waargenomen in de negatieve controle tube, wordt geadviseerd dat de duur van incubatie met RQ1 DNase (4.3) worden verlengd. De door de fabrikant aanbevolen incubatietijd duur met RQ1 DNase is 15 min, echter, vonden we dat langer incubaties (4-5 uur) nodig waren om de template-DNA volledig te verwijderen (Figuur 3).
Figuur 1. SDS-PAGE en absorptie profiel van PICUP-generated, ontzout Aβ40 oligomeren. De absorptie profiel van 5 individuele ontzouten kolommen was gemiddeld en bedekt op een representatieve gel. Moleculair gewicht markers worden getoond aan de rechterkant.
Figuur 2. TBE-ureum-polyacrylamide gelelektroforese van RNA-product voor en na de G-50 zuivering. De migratie richting van de RNA-product is van de kathode naar anode zoals aangegeven.
Figuur 3. Agarosegel elektroforese van DNA-product na reverse-transcriptie en PCR-amplificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het uitgangspunt van het SELEX proces is de synthese van een willekeurige oligonucleotide bibliotheek meestal met daarin 10 12 -10 15 sequenties. In DNA SELEX, deze bibliotheek direct wordt gebruikt na een ssDNA pool wordt gegenereerd, terwijl in RNA SELEX, toonde hier, is het ssDNA bibliotheek eerst omgezet in een RNA-pool enzymatisch door in-vitro transcriptie. Vervolgens wordt SELEX iteratief uitgevoerd, waarbij elke cyclus bestaat uit de belichting en binding van oligonucleotiden aan het beoogde doel, partitionering van bindmiddelen van niet-bindende sequenties, en elutie van bindende sequenties. In latere cycli, kan de stoichiometrie van het doel en RNA en / of het aantal wasbeurten worden gewijzigd, of competitieve remmers kunnen worden toegevoegd in de bindende of was buffer om de striktheid van de SELEX voorwaarden te verhogen. Filter binding is een klassiek, eenvoudig en snelle methode gebruikt voor SELEX 10, hoewel talrijke methoden zijn beschreven 28 voor binding en partitioneren. Filter binding is ideaal voor het vastleggen en selectie van RNA-target interacties in oplossing. Wanneer de selectie doelstellingen zijn kleine moleculen of peptiden, de poriegrootte van het membraan gebruikt in de filter binding wordt een beperkende factor en een belangrijke overweging.
Na elutie worden de doel-binding oligonucleotiden versterkt en gebruikt voor verdere cycli. Bij het gebruik van DNA SELEX, kan de verrijkte pool worden versterkt door PCR direct en gebruikt voor de volgende cyclus na vertering van de complementaire sequentie en DNA-etikettering. Bij het gebruik van RNA SELEX, deze pool moet worden omgezet in DNA door reverse-transcriptie en vervolgens geamplificeerd door PCR, in-vitro getranscribeerde, en opnieuw gelabeld voor voortzetting van de volgende cyclus. Meestal worden 80 tot 20 van dergelijke cycli nodig is om een verrijkte aptameer pool, die vervolgens wordt gekloond en de individuele aptameren zijn gesequenced en gekarakteriseerd te verkrijgen. In studies met behulp van amyloïde-eiwitten, karakterisering van aptameren is bijzonder belangrijk omdat de inherente affiniteit van oligonucleotiden voor fibrillair amyloid structuren mogelijk belemmert de ontwikkeling van aptameren specifiek voor niet-fibrillair amyloïde-eiwitten onder fysiologische omstandigheden 21. Deze inherente, sequentie-onafhankelijke affiniteit van oligonucleotiden kunnen hebben geleid tot generatie van fibril-cross-reactieve aptameren in studies gericht op het aptameren voor niet-fibrillair amyloidogenic eiwitten 17,19-21 te genereren. Onlangs Takahashi et al.. Gemeld generatie van RNA aptameren tegen een oligomere model van Aβ40 en toonde reactiviteit met monomere Aß met micromolair affiniteit 29. Er werd echter cross-reactiviteit van deze aptameren met fibrillair Aβ40 of met andere fibrillair amyloidogenic eiwitten niet bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies AG030709 van NIH / NIA en 07-65798 van het California Department of Public Health. Wij erkennen Margaret M. Condron voor peptide synthese en aminozuur analyse, dr. Elizabeth F. Neufeld voor het helpen en ondersteunen van de eerste stappen van het project, Dr Chi-Hong Chen B. voor het verlenen van steun en reagentia, en Dr Andrew D . Ellington voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polymerase | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega Corp. | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Can be used under red safe light. |
| Membrane discs | EMD Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR international | 26316-696 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega Corp. | A3802 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
References
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
