Summary
Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides 아르
Abstract
알츠하이머 병 (AD 1)의 presymptomatic 진단이 어려운 렌더링 교활한 코스와 진보, 나이 의존, neurodegenerative 무질서이다. 확실히 AD 진단 따라서 광고의 presymptomatic, 조기 진단이 효과적인 치료법 2,3를 개발하고 관리를 위해 중요합니다 수립, 오직 사후 이루어진다.
아밀로이드 β - 단백질 (Aβ) 광고 pathogenesis의 중심이다. 가용성, oligomeric Aβ 어셈블리는 AD 4,5에서 neurotoxicity 기본 시냅스 기능 장애 및 신경 세포 손실에 영향을 믿고 있습니다. 수용성 Aβ 어셈블리 다양한 형태의이 설명되었습니다, 그러나, 그들의 상호 관계 및 광고의 병인 및 pathogenesis 관련성 복잡하고 잘 이해 6되지 않습니다. 특정 분자 인식 도구는 Aβ 어셈블리 사이의 관계를 해명하고 증상이 등장하기 전에 초기 질병 과정에서 이러한 어셈블리의 탐지 및 특성을 촉진 수도 있습니다. 분자 인식은 일반적으로 항체에 의존합니다. 그러나, 분자 인식 도구, aptamers의 대체 수업은 항체 7,8에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 지수 농축 (SELEX) 9,10하여 리간드의 체계적 발전 : Aptamers는 체외 수정이 선택에 의해 생성 oligonucleotides 있습니다. SELEX는 다원 진화와 마찬가지로, 수, 그 반복 과정을 선택, 증폭, 강화, 그리고 재산의 영구화, 예를 들어, 아비드, 특정 리간드 바인딩 (aptamers) 또는 촉매 활동 (ribozymes 및 DNAzymes).
현대 생물 공학 및 의학 11 도구로 aptamers의 출현에도 불구하고, 그들은 아밀로이드 분야에서 underutilized되었습니다. 몇 RNA 또는 ssDNA의 aptamers은 프리온 단백질 (PrP) 12-16의 다양한 형태에 대한 선택되었습니다. 재조합 보빈 PrP에 대해 생성되는 RNA aptamer는 아밀로이드 원섬유 18 양식 전체 길이 PrP의 가용성, oligomeric, β - 시트 풍부한 conformational 변형, 보빈 PrP - β 17 인식 표시되었다. Aptamers 2 - microglobulin (β 2m)는 β 2m 원섬유 19 이외의 다른 특정 amyloidogenic 단백질 원섬유를 바인딩하는 찾았습니다 원섬유의의 β의 monomeric 여러 양식을 사용하여 생성되었습니다. Ylera 외. 고정 monomeric Aβ40 20에 대한 선택의 RNA aptamers를 설명했다. 예기치이 aptamers은 원섬유의 Aβ40을 바운드. 모두,이 데이터는 몇 가지 중요한 질문을 올립니다. 왜 monomeric 단백질에 대한 선택 aptamers는 고분자 형태를 인식나요? amyloidogenic 단백질의 monomeric 및 / 또는 oligomeric 형태에 대한 aptamers를 얻을 수 있을까요? 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 사진을 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) 22,23을 사용하여 생성된 covalently - 안정 oligomeric Aβ40 21 aptamers를 선택하려했습니다. 이전 결과 17,19,20 마찬가지로, 이러한 aptamers 가능성이 높습니다 aptatope 21 구조 잠재적으로 일반적인 아밀로이드를 인식 Aβ와 기타 여러가지 amyloidogenic 단백질의 원섬유과 반응. 여기, 우리는 이러한 aptamers 21 생산에 사용 SELEX 방법론을 제시한다.
Protocol
1 부 : 단백질 준비와 교차 연결
처음 SELEX에 사용되는 단백질이로 이전 23 설명한 균질, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)와 pretreated 있습니다. 이 단계는 미리 형성 합산은 가난한 실험 재현성 24 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에 필요하며, 단백질의 unaggregated 아닌 원섬유의 형태 aptamers의 선택을 위해 바람직하지 수 있습니다.
- microbalance를 사용하여 순수 ~ 800 μg (~ 180 nmol) Aβ40를 달다. , 실리콘 코팅, 낮은 흡착제 1.6 - ML의 microfuge 튜브 라벨에 건조 동결 건조된 펩타이드를 전송합니다.
- 백퍼센트의 펩타이드를 디졸브로 0.5 MM의 펩타이드 솔루션을 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀은 (HFIP, 400 μl) 이전에 23 설명했다.
- 각 튜브는 명목상 ~ 45 nmol Aβ40을 포함하는 등 사 100 μl aliquots에이 솔루션을 나누십시오. 이전 23 설명한대로 HFIP의 제거를 진행합니다.
- 가교 반응에 대한 버퍼에 HFIP - 대우 펩티드를 solubilizing 전에 교차 연결 및 담금질의 시약을 준비합니다. 암모늄 persulfate를 달다 (APS, MW 228.2 g / 몰)와 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4 40 mm의 솔루션을 준비합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
- 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4의 트리스 2 MM 솔루션 (2,2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate을 (RuBpy, MW 748.63 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해체를 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다.
- 담금질 시약을 준비합니다. dithiothreitol을 (DTT, MW 154.5 g / 몰)가 무게 1 M. 위해 탈이온수 또는 10 - MM 인산 나트륨, 산도 7.4의 용해
- 정확하게 설명하지만, 이전에 23,25 ~ 60 μm의의 펩타이드 솔루션을 얻기 위해 목표 HFIP - 처리 펩타이드를 디졸브.
- 이전 23 설명한대로 oligomeric Aβ40의 혼합물을 생성 PICUP을 수행합니다. 전형적인 PICUP 반응은 단백질, RuBpy와 APS의 최종 농도가 30 μm의, 0.05 MM, 각각 23 1 밀리미터입니다 20 μl의 볼륨에서 수행됩니다. 여기 PICUP에 사용되는 혼합물은 108 μl 단백질, 6 μl RuBpy, 6 μl APS, 1 μl DTT와 단백질의 농도, RuBpy 및 APS을 포함은 모든 전형적인 반응에 비해 두 배로됩니다. 이것은 수행하는 PICUP 반응의 수가 감소하고 탈염을위한 단백질 농도를 증가시킵니다.
2 부 : 단백질 준비를 탈염
SELEX를위한 단백질을 사용하기 전에, 탈염은 PICUP 사용되는 가교 시약을 제거하기 위해 수행됩니다. 이 PICUP 반응 혼합물은 가교 시약과 ~ 55 μm의 단백질 (공칭 농도)가 포함되어 있습니다.
- 5 ML 탈염 칼럼 웃옷 뚜껑을 제거, 대기로 열을 지원 열 배출구 아래 비커를 배치하고, 콘센트 플러그를 제거합니다. 를 통해 저장 버퍼 흐름을하자와 비커에 수집합니다.
- 10 MM의 암모늄 아세테이트, 산도 8.3의 열을 평형. 그 결과 해당 컬럼에 대한 3 - ML의 aliquots이 버퍼 5 수지 침대 볼륨 (25 ML)를 추가하고 그것을 통해 흐름을 수 있습니다.
- 한편, 라벨 8 낮은 흡착제, 실리콘 코팅 1.6 - ML 튜브와 튜브 랙에서 그들을 놓으십시오.
- 칼럼 equilibrated 후 (열 나중 사용을 위해 저장, 씻어, 그리고 equilibrated 수 있습니다) 단일 탈염 사용 당 열 당 PICUP 반응 혼합물의 0.5-0.7 - ML 나누어지는를 적용합니다. 단백질 혼합물의 열 수지에 흡수와 비커의 흐름을 통해을 삭제하도록 허용합니다.
- 열 배출구 아래의 첫 번째 컬렉션 튜브를 놓습니다. 그 결과 해당 컬럼에 0.5 ML 아세트산 버퍼를 추가하고 흐르는 최초의 0.5 - ML의 분수를 수집합니다.
- 단계 2.4 및 2.5를 반복하고, 해당 튜브 8 0.5 - ML 분수까지 수집합니다.
- 번호 또 다른 여덟 낮은 흡착제, 실리콘 코팅, 소형 0.6 - ML 튜브의 설정 및 랙 그들을 놓으십시오. 같은 다른 튜브 라벨 "빈." 표시 0.6 - ML 튜브에 각각의 분획 및 전송 150 μl를 가져가라. 로 이전 23 그림 (그림 1) SDS - PAGE 분석 20 μl를 사용합니다.
- 빈 튜브에 150 μl 10 MM의 암모늄 아세테이트, 산도 8.3를 전송합니다. 분광 광도계의 빈 설정이 튜브를 사용하십시오.
- 쿼츠 쿠베트에서 λ = 280 nm의 각 분획 130 μl의 흡광도를 측정합니다.
- 흡광도 측정 후, 가장 높은 단백질 함량 (일반적으로 분수 3-5)와 분수를 결합, 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합하고, 실제 단백질 농도를 (표시되지 않음)를 결정하는 아미노산 분석을 위해 10 μl 나누어지는 보관하십시오.
- 튜브 당 ~ 2 nmol 단백질의 여러 aliquots에 샘플을 분할하고 lyophilizer에 샘플을 lyophilize.
- lyophilization 완료 후 이전처럼 100 % HFIP로 샘플을 처리.
- -20 ° C.에 튜브를 저장 (아래) 각 SELEX주기에 대해 하나 튜브를 사용하십시오.
파트 3 : PCR에 의해 합성 임의 ssDNA 도서관 증폭
SELEX 여기에 사용되는 합성 ssDNA 라이브러리 49 무작위 세포핵을 포함 (T : G : C = 25:25:25:25 %)으로 복제 사이트 (에코 RI HI BAM)과 T7 프로 모터로 구성된 일정한 지역의 어귀 이전 26 설명했다.
- 202 μl 탈이온수, 40 μl 10X DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 버퍼, 2 μl ssDNA 템플릿 (0.5 nmol), 120 μl 25 MM MgCl 2, 28 μl 10 MM의 deoxynucleoside의 삼인산 믹스 : 라이브러리를 증폭하려면 다음과 같이 표준 PCR 반응을 설정 (dNTPs), 1 μl 앞으로 프라이머 (300 pmol), 1 μl 역방향 프라이머 (300 pmol), 4 μl DNA 형성 촉매 효소.
- 아래와 같은 설정을 가진 열 자전거 타는 사람을 사용하여 PCR 반응을 수행 : 94시 5 분 ° 초기 변성에 대한 C, 소둔 30 초 30 초 52 ° C 20주기 94 ° C의 각 72 ° 30 초에 대한 C에 대한 72의 확장, 그리고 마지막 연장 ° 7 분을위한 C.
- PCR 반응의 완료 후, 제조 업체의 지침에 따라 같은 Qiagen PCR QiaQuick 정화 키트를 사용하여 증폭 DNA 제품을 정화. 일반적으로,이 실험에서 농도와 DNA의 수율은 160아르 ± 50 μl 10 NG / μl.
- 2퍼센트 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 후 DNA의 양을 확인합니다.
4 부 : 체외 수정의 전사에 의해 32 P - 라벨 RNA의 생성
- 20 μl 배 T7의 전송 버퍼, 7.5 μl 100 MM rATP, rGTP, rUTP, 1 μl 100 각각 다음과 같이 몇 가지 수정 제조 업체의 지시에 따라 O - 링 덮인, 1.6 - ML 튜브에서 전사 반응을 설정 MM rCTP, 2 μl α 32 P - CTP (3000 CI / mmol), 5-10 μg DNA가 템플릿 (DNA 제품을 정화의 ~ 30-40 μl), 10 μl 효소 믹스, 100 μl에 최종 볼륨을 만들 투석을 nuclease없는 물을 추가하여.
- 피펫으로 부드럽게 솔루션을 혼합, 혼합물을 원심하고, ° C 야간 37 알을 품다.
- 반응의 끝에서 DNA 템플릿은 제거되어야한다. 37 1 U / 4 H에 대한 템플릿 DNA와 부화의 μg의 농도 RQ1 RNase 무료 DNase를 추가 ° C가 DNA 템플릿을 소화합니다.
- 클로로포름 : isoamyl 알콜 (125:24:1, 산도 4.7) 4 H 후, 구연 산염 - 포화 페놀 1 볼륨을 추가하여 RNA를 추출합니다. 2 분 16,000그램에서 ~ 1 분 및 원심 분리기의 소용돌이로 섞는다.
- 새로운 튜브로 상단, 수성 단계를 전송하거나 micropipette를 사용 흡인하여 아래 단계를 폐기하십시오. isoamyl 알콜 (24:1)으로 4.4에서 설명한 1 분 및 원심 분리기의 소용돌이에 의해 혼합 : 클로로포름 1 볼륨을 추가합니다.
- 새로운 튜브로 상단, 수성 단계를 전송하거나 micropipette를 사용 흡인하여 아래 단계를 폐기하십시오. 나머지 클로로포름은 micropipette와 하단 단계의 microcentrifuge 및 제거에 빠른 스핀 (10 초) 수행하여 제거할 수 있습니다. 이 단계에서는, 그것은 오히려 supernate보다 아래 단계를 제거하는 것이 더 쉽습니다.
- RNA을 촉진하기 위해, 0.1 - 볼륨 3M의 아세트산 나트륨의 상응하는, 산도 5.2 2 - 프로파놀 1 볼륨에 상응을 추가합니다. 15 분 -20 ° C의 냉동고에 혼합과 장소.
- 후 15 분, 최고 속도로 스핀, 선호 4 냉장 microcentrifuge에서 ° C가 20-30 분 RNA 제품을 촉진합니다.
- 자세히 supernate을 기음, 70 % 에탄올 0.5 ML, 4 ° C에서 원심 분리기와 RNA 펠렛을 씻고 흡인하여 에탄올을 삭제.
- 열 블록에 RNA 펠렛이 들어있는 튜브를 전송 5 분 37 펠릿 ° C 건조.
- 체외 수정이 전사 반응 즉, 100 μl (단계 4.1)의 동일 볼륨 150 MM의 인트 버퍼, 산도 8.0 (illustra ProbeQuant G - 50 microcolumns 함께 제공) 또는 nuclease없는 물에 RNA 샘플을 디졸브.
- ° C 소용돌이에 의해 열 블록과 혼합 10 분 RNA 용해를 촉진하기 위해 70 RNA 제품이 들어있는 튜브를 가열.
- 상온에서 1 분 최고 속도로 원심 분리기.
- 섬광 계수와 TBE - 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (6 부)에 대한 표시 0.6 - ML 튜브에 RNA의 1 μl 나누어지는 보관하십시오.
제 5 부 : 비법인 세포핵의 제거, RNA의 탈염, 그리고 섬광이 자식아
비법인 세포핵을 제거하려면 제조 업체의 지침에 따라 두 G - 50 컬럼을 사용합니다.
- 수지 resuspend하는 소용돌이에 의해 열과 혼합 반전.
- 키트에 제공된 플라스틱 도구를 사용하여 천공의 기둥 하단의 폐쇄를 맞추기와 콘센트가 훼손되지 않은 떠나 있는지 확인하십시오. 캡에게 분기 회전을 풀어 G에서 제공하는 깨끗한 수집 튜브에 열을 장소-50 키트.
- 저장 버퍼를 제거 1 분 730g의 수집 튜브에 열을 스핀.
- 두 가지 새로운 O - 링 덮인, 1.6 - ML 튜브에 열을 전송 50 32 μl P -라는 수지 perturbing하지 않고 직접 수지에 열을 당 RNA 샘플.을 로드할 수
- 정화 라벨 RNA를 수집 2 분 730g에 스핀. 이 단계 후에, 열 삭제.
- 섬광 계수와 전기 (6 부)에 대한 0.6 - ML 튜브로 G - 50 정제 RNA 1 μl를 전송합니다. SELEX 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관 주식 RNA. 이 RNA는 활동의 저하와 손실을 피하기 위해 라벨 후 2 일 이내에 사용하는 것이 바람직합니다.
- 신틸레이션 계수기를 사용하여 분 당 카운트 (CPM / μl)를 측정하는 단계에 4.14과 5.6에서 두 개의 1 μl RNA의 aliquots을 사용합니다. 여기, 우리는 Triathler 벤치 톱 신틸레이션 계수기를 사용합니다.
- Triathler와 함께 제공된 32 P의 계산에 사용되는 플라스틱 어댑터 내부의 RNA 샘플이 들어있는 튜브를 전송합니다. , 계산 챔버 내부 튜브와 어댑터를 넣어 챔버의 뚜껑을 닫고 32 P의 카운트를 선택하고, 카운트를 시작 시작 누르십시오.
- %의 레이블 설립의 즉, α 32 P - CTP = (CPM / μl에 대해 "G - 50"샘플 ÷ 노출당 비용 (CPM) / "TOTAL"샘플 μl) × 100 %의 법인을 계산합니다. TOTAL 샘플 G - 50 정화하기 전에 샘플입니다.
- 섬광 계수 및 %의 정관의 계산 후, RNA 및 RNA의 특정 활동의 수율을 계산합니다. 예를 들어, RNA의 수영장을위한 카운트하기 전에 (237,370 CPM / μl) 후 G - 50 정제 (191,330 CPM / μl) 수율 81 % 설립, 다음은 RNA의 수율을 획득하기 전에 계산됩니다 :
단계 4.1에서, 3000 CI / mmol 및 / 10 μCi μl에서 α 32 P - CTP의 양을은 다음과 같습니다 :
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사용하는 레이블이 지정되지 않은 CTP의 금액은 다음과 같습니다 :
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CTP 사용하는 총 금액은 100006.7pmol입니다. RNA의 분자량은 다음과 같이 계산됩니다
321.45 g / 몰 27은 rNTPs의 평균 질량 어디에, 100 BP는 순서 기지의 번호입니다, 17 BP는 베꼈는데하지 않는 T7 프로 모터에 기지의 번호입니다. 61.96 oligonucleotide 분자량에서 G / 스파이의 뺄셈은 계정 HPO 2 (63.98)의 제거와 두 수소 원자 (2.02) 27의 추가로 소요됩니다. 모든 CTP가 생산 RNA가 됐을의 이론적인 질량을 통합하려는 경우 때문에, 4 rNTPs의 CTP는 제한 시약입니다
.
그러나, 81 %의 정관이 대량 지금은 2,156 μg이다. RNA의 μg 당 건의 그러면 될
100 μl의 전사 반응 볼륨이며, 몰스의 관점에서 어디 : 26618.4 μg / μmol X 8874 CPM / μg = 2.4x10 8 노출당 비용 (CPM) / μmol. 예 계산할 수 여기에서 nmol와 해당 볼륨에있는 RNA의 양이 단백질과 부화에 사용되는 5 μl RNA는 ~ 4 nmol RNA, 즉를 포함합니다
이 실험에서, 100 nmol RNA 1 nmol 단백질 4 nmol 300 pmol는 21을 사용했다.
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6 부 : 전기 및 autoradiography하여 RNA 제품의 특성
- 전기에 대한 샘플을 준비하려면, 각각 4.14과 5.6 단계에서 G - 50 정화 전후 RNA의 1 μl aliquots를 사용합니다. 4 μl 쎙뜨 버퍼 5 μl 2X Novex TBE - 요소 샘플 버퍼를 추가합니다.
- 70 샘플을 가열 ° 일반적으로 RNA 전기 영동 (와 난방없이 RNA 샘플의 겔 해상도가이 실험 설정에서 동일하기 때문에 난방이 불필요한 것을 알았습니다)의 추천으로 5 분 C.
- 젤 실행 장치에 6% TBE - 우레아 - polyacrylamide 젤을 조립, 1X Novex TBE - 우레아 실행 버퍼로 내부와 외부 회의소를 입력합니다. 1 - ML 피펫으로 버퍼를 사용하여 프리 캐스트 젤의 우물을 씻어.
- RNA의 튜브를 원심 분리기 및 겔 - 로딩 도움말을 사용하여 샘플을 (10 μl 총)로드합니다. 50 분 180 V에서 젤을 실행합니다.
- 50 분 후, 플라스틱 금형을 분리 속보로 젤을 분해 제거하고 겔 금형만을 짧은지지를 삭제하지만, 젤에 대한 지원으로 더 이상 백업을 둡니다.
- Decon (또는 다른 적절한 방사능의 decontaminant)의 모든 오염 방사능 장소가 제거되었는지 확인하고있는 작업 영역의 표면을 청소하십시오.
- 플라스틱 사란 랩 두 레이어를 배치, 두 먹었 플라스틱 포장에서 젤 및 플라스틱 지원을 포장.
- 의 시트에 비닐에 싸서 젤 폭로안전 조명 아래 어두운 방에 노출 카세트 내부 utoradiography X - 선 필름. 60-90 분 -20 ° C에서 카세트를 남겨주세요.
- 자동 필름 개발 (그림 2)를 사용하여 60-90 분 후 안전 조명 아래 어두운 방에서 영화를 개발할 수 있습니다.
7 부 : RNA 단백질 보육 및 필터 바인딩
첫째, RNA와 단백질이 솔루션에 incubated하고 다음 단백질에 바인딩 RNA 시퀀스가 아닌 바인더에서 분리됩니다. SELEX주기의 진전으로 필터 결합 단백질 RNA 구속력 강화의 표시를 줄 것이다.
- 변성 10 분 후 느린 renaturation 10 분 실온에서 90 ° C에서 RNA를 품어.
- 8 μl 60 MM NaOH 단계에서 2.12의 단백질을 디졸브 36 μl nuclease 무료 탈이온수를 추가합니다. 1 분에 대한 혼합 Sonicate 36 μl 2X RNA 결합 버퍼 (20 MM 트리스, 300 MM NaCl, 10 MM MgCl 2, 산도 7.5)을 추가합니다.
- 20 μl 10X RNA 결합 버퍼와 RNA의 해당 금액을 믹스하고 nuclease없는 물을 추가하여 200 μl에 볼륨을합니다. 튜브 "부정적인 통제를."라벨
- 20 μl 10X RNA 결합 버퍼 20 μl 단백질과 RNA의 원하는 금액을 믹스하고 nuclease - 무료 물 200 μl에 볼륨을합니다. 튜브 "반응"을 라벨.
- 믹스와 실온에서 30 분 튜브를 품어. 한편 필터와 다음 단계에 대한 필터 바인딩 설정을 준비합니다.
- 진공 입구에 125 - ML 사이드 암 플라스크를 연결합니다. 사이드 암 플라스크에있는 필터에 대한 사전 청소, 다공성 유리 지원을 놓습니다.
- 10-15 분 35x10 - mm 배양 접시에있는 1X RNA 바인딩 버퍼로부터 2-3 ML 3 필터 세포막을 평형. 첫 번째 필터는 진공 흡입을 조정에 사용되며, 두 번째는 RNA 실행형에 사용되며, 부정적인 통제 필터 바인딩, 그리고 세 번째는 RNA - 단백질 혼합물의 필터 바인딩에 사용됩니다.
- 30 분 후, 상온에서 5 분 최고 속도에 바인딩 반응 및 제어 튜브를 원심 분리기.
- 진공 켜고 다공성 유리의 첫 막을 장소. micropipette를 사용하여 멤브레인에 RNA 바인딩 버퍼의 0.5 ML 드립하고 세포막을 통해 각 버퍼 드롭의 느린 흐름을 허용하도록 진공을 조정합니다.
- 다공성 유리에 두 번째 막을 플레이스와 같은 흐름 속도를 사용하여 멤브레인에 부정적인 제어를 적용합니다.
- 멤브레인를 세척하고 흐름을 통해를 폐기하는 1X RNA 바인딩 버퍼의 4x0.5 - ML aliquots을 적용합니다. 미리 삭제를 원하는 경우, 흐름을 통해이 RNA 추출을 위해 보관됩니다. 사전 삭제는 필터에 바인딩 RNA 시퀀스를 제거합니다.
- 섬광 계수에 대한 correspondingly - 표시 1.6 - ML 튜브에 부정적인 제어 막과 장소를 제거합니다.
- 미리 청소 초 다공성 유리 지원 다공성 유리를 교체합니다.
- 다공성 유리에 세 번째 디스크를 삽입하고 반응 혼합물을 적용합니다. 단계 7.11에서와 같이 필터를 세척하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 세척의 수는 SELEX 조건의 엄중을 증가 나중에 SELEX 순환 증가 수 있습니다.
- "반응 혼합물"(으)로 분류 1.6 - ML 튜브에 필터 디스크와 장소를 제거하고 섬광이 계산에 대한 유지.
- 단계 5.8에서와 같이 집계 섬광을 수행하고 해당 필터에 대한 카운트를합니다.
- 안정 (% 바인딩)에 적용되는 방사능의 총량에 비해 필터 - 바운드 방사능 수준을 계산합니다. 이것은 SELEX의 진행으로 바인딩 농축의 표시를 줄 것이다.
8 부 : 필터에서 RNA 추출
RNA는 단백질에 바인딩 순서를 얻기 위해 필터에서 추출됩니다. 이러한 시퀀스는 다음 SELEX주기에 대한 증폭됩니다.
- 섬광의 계산 후, 깨끗하고, 건조 35x10 - mm 페트리 접시에 관에서 필터 결합 반응 (단계 7.15부터)과 장소를 제거합니다.
- 작은 조각에있는 멤브레인를 잘라 깨끗한 메스와 핀셋 한 쌍의을 사용합니다.
- 핀셋을 사용하여 단계를 8.1에서 같은 표시 튜브에 막의 자른 조각을 교체하십시오.
- 400 μl 용출 버퍼 (7 M 우레아, 3 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100 MM 나트륨 구연 산염, 산도 5.0) 추가 10 분 95 ° C에서 튜브를 품어.
- 실온에서 최고 속도에 튜브를 원심 분리기, 기음, 새로운 라벨 튜브로 추출 버터를 수집합니다.
- 추출 효율을 평가하기 위해 계산 섬광에 의해 막 조각이 들어있는 튜브에 남아있는 방사능 카운트를 측정.
- 세 번 추출 프로세스 (단계 8.4-8.6)를 반복합니다. 3 extractions 후 효율은 보통 95~96%을 ~입니다.
- 클로로포름 : isoamyl 알콜 (125:24:1). RNA 추출물이 들어있는 튜브에 구연 산염 - 포화 1 볼륨 (400 μl) (산도 4.7) 페놀을 추가 ~ 1 분 및 centrifu의 소용돌이에 의해 혼합2 분 16,000그램에서 GE.
- 새로운 튜브로 상단, 수성 단계를 전송하거나 micropipette를 사용 흡인하여 아래 단계를 폐기하십시오.
- isoamyl 알콜 (24:1), 2 분 1만6천그램에서 1 분 그리고 원심 분리기의 소용돌이에 의해 혼합 : 클로로포름 1 볼륨을 추가합니다.
- 새로운 튜브로 상단, 수성 단계를 전송하거나 micropipette를 사용 흡인하여 아래 단계를 폐기하십시오.
- RNA을 촉진하기 위해 3 M의 아세트산 나트륨의 0.1 볼륨, 산도 5.2 RNA coprecipitant로 3-4 μl 글리코겐 (10 μg / μl), 2 - 프로파놀 1 볼륨 상당을 추가합니다. 하룻밤 -20 ° C의 냉동고에 혼합과 장소.
- 8.12 단계에서 RNA를 침전 4에서 microcentrifuge ° C, 20-30 분 안에 낫게, 최고 속도로 회전.
- 원심 분리 후, RNA 겨우 볼 수있는 액상으로 분리합니다. 튜브의 하단에이 겨우 보이는 침전제 단계를 dislodging 않고 조심스럽게 supernate를 대기음.
- 70 % 에탄올 0.5 ML로 RNA "펠릿"을 씻고, 4 최고 속도에서 5 분 원심 분리기 ° C와 거의 볼 수 침전제 단계를 dislodging없이 흡인하여 에탄올을 삭제.
- 50 μl 쎙뜨 버퍼에있는 RNA 펠렛를 해산하고 5 단계에서와 같이 G - 50 정제로 진행합니다.
파트 9 : 지속 SELEX주기위한 역방향 전사 및 PCR
SELEX의 다음주기를 진행하기 위해 RNA는 DNA에 리버스 베꼈는데 및 PCR에 의해 증폭되어야한다.
- 5 0.6 - ML 튜브가 표시된 정화 3 μl, 8 배 희석된 역방향 프라이머 2 μl와 G - 50 - desalted RNA를 섞는다. 라벨 한 튜브 '부정적인 통제.
- RNA에 뇌관의 하이브리드화 수 있도록 ° C 5 분 후 또 다른 5 분 얼음 70 혼합물을 품어.
- 얼음이 혼합하기 위해, 6.4 μl nuclease - 무료 물, 4 μl ImProm - II 배 반응 완충액, 1.6 μl 25 MM MgCl 2, 1 μl 10 MM dNTP 믹스, 1 μl RNasein의 Ribonuclease 억제제, 1 μl ImProm - II 역 Transcriptase를 추가 15 μl의 총을 만드는.
- 부정적인 제어를위한, 7.4 μl nuclease 무료 물을 추가하고 반대 transcriptase를 두십시오. 이에 따라 튜브 라벨. 대조군은 이전주기에서 DNA를 오염 것은 다음 SELEX주기에 대한 증폭 아니라는 것을 확인하기 위해 포함되어 있습니다. 이 단계는 단계 4.3에서 RQ1 RNase 무료 DNase에 의해 DNA 템플릿의 소화의 효과를 테스트합니다.
- 어닐링 70 다음 각각 최초 스트랜드 DNA, 연장 1 H 5 분, 42 ° C 25 ° C에서 반응 혼합물을 부화 온도 자전거 타는 사람을 사용하여 ° 15 분에 대해 C는 반대 transcriptase를 inactivate 수 있습니다.
- 리버스 전사 반응 후 PCR 믹스를 설정합니다. 30 μl nuclease - 무료 물, 10 μl 10X DNA 형성 촉매 버퍼, 30 μl 25 MM MgCl 2, 7 μl 10 MM dNTP 믹스, 각 프라이머 1 μl, 모든 튜브 1 μl DNA 형성 촉매 효소를 추가합니다.
- 9-14 사이클에 대한 제 3과 같이 PCR 프로그램을 실행합니다.
- 3.3 단계에서 같은 DNA 제품을 정화.
- 15-20 분 (그림 3) 100 V에서 2% 아가로 오스 2 μl의 DNA 로딩 색소와 electrophorese로 DNA 제품의 8 μl를 섞는다.
- DNA 제품은 4 부와 같이 표시 RNA에 베꼈는데와 SELEX의 다음주기에 사용할 준비가 된 것입니다.
부품 10 : 대표 결과
SELEX 실험에서, 대상, 각 사이클에 사용되는 RNA의 품질, 각 사이클 후 성공적인 RNA 추출 및 증폭으로 사용 Aβ40 oligomers의 자연이 중요합니다. 우리는 정화 및 가교 시약의 제거 후 SELEX에 대한 oligomeric Aβ40 혼합물을 생성하는 PICUP를 사용합니다. 제 2의 설명에 탈염 실험은 보통 50-55% 단백질 손실로 이어집니다. 단백질 금액과 품질 흡광도 측정 (λ = 280) 및 SDS - PAGE (그림 1)를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 그런 실험 중 하나에 eluted Aβ40의 전형적인 SDS - PAGE 프로필을 오버레이 5 개의 개별 실험에서 Aβ40 eluates의 평균 흡광도 프로필은 그림 1에 표시됩니다. 데이터는 단백질이 지속적으로 분수 3-5과 분수 6 이후 elute 가교 시약 (분수 7, 그림 1에서 흡광도 증가)에 열을 elutes 것을 보여줍니다. SDS - PAGE는 전형적인 Aβ40 올리고머 분포 22 보여줍니다. 단백질 분수가 (2.11) 동결 건조된 HFIP (2.11), resolubilized (7.1)로 처리하고, SDS - PAGE에 의해 다시 분석 나서이 배포판 재현할되었습니다.
각 SELEX주기위한 RNA의 무결성은 nuclease - 민감한 ribo - oligonucleotides이 사용하는 특히, SELEX의 진행을 반복 또한 중요합니다. RNA의 증폭 및 라벨 (4 부) 후, 라벨 RNA의 품질 TBE - 우레아 - polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 평가하실 수 있습니다. 그대로 표시 RNA 제품의 전형적인 프로파일 전후 G - 50 정제 (P미술 5) 그림 2에 표시됩니다.
각 SELEX 사이클 후, RNA는 필터 바인딩 이후 막 (8 부) 및 PCR 증폭을위한 DNA (9.5 단계)을 (부 9) 리버스 베꼈는데에서 추출됩니다. 이전주기에서 DNA 템플릿은 다음 다음주기위한 32 P - 라벨 RNA를 (4 부)를 생성하는 데 사용됩니다. 이전주기에서 어떤 오염의 DNA 템플릿에 - 시험 관내 전사 반응 (4 부) 후 표시 RNA 제품에 지속되면, SELEX 사이클의 효율이 더 많은 사이클을 요구 감소됩니다. 이에 대한 제어하려면 각 SELEX주기와 해당 역방향 전사 PCR 반응 후, 아가로 오스의 전기는 (9.12) 수행됩니다. 부정적인 제어 반응 튜브 (9.4)에 DNA 제품의 부재는 이전 SELEX주기 (그림 3)에서 발생하는 DNA 템플릿의 성공적인 제거를 나타냅니다. PCR에 의해 DNA의 증폭이 부정적인 제어 튜브에서 관찰하는 경우, 그것은 RQ1 DNase (4.3)와 부화 기간을 연장하는 것이 좋습니다. RQ1 DNase와 제조 업체 권장 부화 기간은 15 분, 그러나, 우리는 더 이상 incubations (4-5 H)가 (그림 3) 완전히 템플릿 DNA를 제거하는 데 필요한 것으로 나타났다.
그림 1. SDS - PAGE와 PICUP 생성, desalted Aβ40 oligomers의 흡광도 프로필입니다. 5 개의 개별 탈염 컬럼에서 흡광도 프로필은 평균값과 대표 젤에 overlain되었습니다. 분자량 마커는 오른쪽에 표시됩니다.
그림 2. RNA 제품의 TBE - 우레아 - polyacrylamide 젤 전기 영동 전에 G - 50 정제 후. 표시된로 RNA 제품의 마이 그 레이션 방향은 음극에서 양극하는 것입니다.
리버스 녹음 및 PCR 증폭 후 DNA 제품의 그림 3. 아가로 오스 겔 전기 영동.
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Discussion
SELEX 과정의 출발점은 일반적으로 10 12 -10 15 시퀀스를 포함하는 임의의 oligonucleotide 라이브러리의 합성이다. RNA SELEX에서, 여기를 시연 반면 DNA SELEX,이 라이브러리가, ssDNA 수영장이 생성된 후 직접 사용, ssDNA 라이브러리는 체외 수정의 전사에 의해 효소 RNA 수영장 최초로 변환됩니다. 각각의 사이클은 노출과 의도한 대상으로 oligonucleotides의 바인딩을 구성되어 의하여 다음, SELEX는 구속력 시퀀스 및 바인딩 시퀀스의 용출에서 바인더의 파티션, 반복 수행됩니다. 나중에 사이클에서는, 대상 및 RNA 및 / 또는 세척의 개수의 stoichiometry을 변경할 수 있습니다, 또는 경쟁 억제제는 SELEX 조건의 엄중을 높일 수있는 바인딩 또는 세척 버퍼에 추가할 수 있습니다. 수많은 방법 바인딩 및 파티션에 대한 28 설명했습니다 불구하고 필터 바인딩은, SELEX 10 사용 고전적이고, 단순하고 빠른 방법입니다. 필터 바인딩은 솔루션의 RNA - 대상의 상호 작용 캡처 및 선택에 이상적입니다. 선택 대상 작은 분자 또는 펩티드 경우, 필터 바인딩에 사용되는 멤브레인 기공의 크기는 제한 요인과 중요한 고려 사항이된다.
용리에 따라, 대상 바인딩 oligonucleotides이 증폭되고 더주기 위해 사용됩니다. DNA SELEX를 사용하는 경우, 농축 수영장 직접 PCR에 의해 증폭되고 보완 시퀀스와 DNA 라벨의 소화 후 다음주기에 사용할 수 있습니다. RNA SELEX를 사용하는 경우,이 풀은 리버스 전사의 DNA로 변환하고 증폭 PCR에 의해 체외 수정 베꼈는데하고, 다음주기 연속을 다시 표시되어야합니다. 보통 8-20와 같은주기가 연속적으로 복제하고 개인 aptamers가 합성 및 특징 풍부한 aptamer 수영장을 얻기 위해 필요합니다. 원섬유의의 아밀로이드 구조의 oligonucleotides의 고유 친화력 가능성이 생리적 조건 21 살 미만의 비 원섬유의 아밀로이드 단백질에 대한 특정 aptamers의 개발을 방해하기 때문에 아밀로이드 단백질, aptamers의 특성 특히 중요합니다을 사용하여 연구. oligonucleotides이 내재된, 시퀀스가 독립적인 친화력이 아닌 원섬유의 amyloidogenic 단백질 17,19-21에 대한 aptamers를 생성하기 위해 목표로 연구에 근모 크로스 반응 aptamers의 세대 LED 할 수 있습니다. 최근 다카하시 외가. Aβ40의 oligomeric 모델에 대한 RNA의 aptamers의 생성을보고하고 micromolar 친화력 29 monomeric Aβ와 반응을 보여주었다. 그러나, 원섬유의 Aβ40 또는 다른 원섬유의 amyloidogenic 단백질 이러한 aptamers의 교차 반응이 결정되지 않았습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 보건의 캘리포니아학과에서 NIH / NIA와 07-65798에서 부여 AG030709 지원했다. 우리는 펩타이드의 합성과 아미노산 분석, 도움 및 프로젝트 지원 및 시약을 제공하는 박사 치 - 홍콩 B. 첸의 초기 단계를 지원하는 박사 엘리자베스 F. 네펠드, 박사 앤드류 D에 대한 마가렛 M. 콘드론을 인정 도움이 토론을 위해. 엘링턴.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polymerase | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega Corp. | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Can be used under red safe light. |
| Membrane discs | EMD Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR international | 26316-696 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega Corp. | A3802 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
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