Summary

Val av aptamers för Amyloid β-protein, vilka smittämnen av Alzheimers sjukdom

Published: May 13, 2010
doi:

Summary

Aptamers är korta ribo-/deoxyribo-oligonucleotides väljs av<em> In-vitro</em> Evolutionen metoder baserade på affinitet för ett specifikt mål. Aptamers är molekylär igenkänning verktyg med mångsidiga terapeutiska, diagnostiska och forskningsansökningar. Vi visar metoder för val av aptamers för amyloid β-protein, vilka smittämnen av Alzheimers sjukdom.

Abstract

Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv, åldersberoende, neurodegenerativa sjukdomar med en smygande kurs som gör att företagets presymtomatiska diagnosen svår 1. Definitiv AD diagnos uppnås först efter döden, vilket skulle innebära presymtomatiska, tidig diagnos av AD är avgörande för att utveckla och administrera effektiva behandlingar 2,3.

Amyloid β-protein (A-beta) är central AD patogenes. Löslig, oligomeric A-beta församlingar tros påverka neurotoxicitet underliggande synaptiska dysfunktion och neuron förlust i AD 4,5. Olika former av lösliga A-beta-församlingar har beskrivits, men deras inbördes och relevans för AD etiologi och patogenes är komplexa och inte förstått 6. Särskilda molekylär igenkänning verktyg kan reda ut sambanden mellan A-beta-församlingar och underlätta upptäckt och karakterisering av dessa församlingar tidigt i sjukdomsförloppet innan symptomen dyker upp. Molekylär erkännande bygger ofta på antikroppar. Men ett alternativ klass av Molecular Recognition verktyg, aptamers, viktiga fördelar jämfört med antikroppar 7,8. Aptamers är oligonukleotider genereras av in vitro-valet: systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning (SELEX) 9,10. SELEX är en iterativ process som, i likhet med Darwins evolutionslära, gör urval, förstärkning, anrikning och förevigande av en fastighet, t.ex. ivrig, specifika, ligandbindande (aptamers) eller katalytisk aktivitet (ribozymer och DNAzymes).

Trots framväxten av aptamers som verktyg i modern bioteknik och medicin 11, de har varit underutnyttjade inom amyloid området. Få RNA eller ssDNA aptamers har valts ut mot olika former av prionproteiner (PrP) 12-16. En RNA aptamer genereras mot rekombinant bovint PrP visades att känna igen nötkreatur PrP-β 17, en löslig, oligomeric, β-sheet-rika konformationsändringar variant av full längd PrP som utgör amyloidfibrerna 18. Aptamers genereras med hjälp av monomera och flera former av fibrillar β 2-mikroglobulin2 m) konstaterades att binda fibriller av vissa andra amyloidogenic proteiner än β 2 m fibriller 19. Ylera et al. beskrivs RNA aptamers utvalda mot immobiliserade monomera Aβ40 20. Oväntat dessa aptamers bunden fibrillar Aβ40. Sammantaget dessa data upp flera viktiga frågor. Varför aptamers utvalda mot monomera proteiner erkänna sina polymera former? Kunde aptamers mot monomera och / eller oligomeric former av amyloidogenic proteiner erhållas? För att lösa dessa frågor försökte vi att välja aptamers för kovalent stabiliserad oligomeric Aβ40 21 genereras med hjälp av foto-inducerade bryggbindningen av omodifierade proteiner (picup) 22,23. I likhet med tidigare resultat 17,19,20, reagerade dessa aptamers med fibriller av A-beta och flera andra amyloidogenic proteiner kan erkänna ett potentiellt gemensamt amyloid strukturella aptatope 21. Här presenterar vi de SELEX metod som används i produktionen av dessa aptamers 21.

Protocol

Del 1: Protein förberedelse och tvärbindning Inledningsvis är det protein som används för SELEX förbehandlas med 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) för att erhålla homogen, ballast-fri preparat som beskrivits tidigare 23. Det här steget är nödvändigt eftersom förformade aggregat framkalla en snabb sammanställning av amyloidogenic proteiner, vilket ger dålig experimentella reproducerbarhet 24, och är inte önskvärt för val av aptamers för unaggrega…

Discussion

Utgångspunkten för SELEX processen är syntesen av ett slumpmässigt oligonukleotid bibliotek som normalt innehåller 10 12 -10 15 sekvenser. I DNA SELEX är detta bibliotek som används direkt efter en ssDNA pool genereras, medan RNA SELEX, visade här är ssDNA biblioteket konverteras först till en RNA-poolen enzymatiskt av in vitro transkription. Då är SELEX utförs iterativt där varje cykel består av exponering och bindning av oligonukleotider till det avsedda målet, partitione…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats med bidrag AG030709 från NIH / NIA och 07-65.798 från California Department of Public Health. Vi erkänner Margaret M. Condron för syntes av peptider och aminosyror analys, Dr Elizabeth F. Neufeld för att hjälpa och stödja de första stegen i projektet, Dr Chi-Hong B. Chen för att ge stöd och reagenser, och Dr Andrew D . Ellington för bra diskussioner.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

Play Video

Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

View Video