Summary
Kvantifiering av DNA dubbel-strängen strimmor med γH2AX bildas som en molekylär markör har blivit ett ovärderligt verktyg i strålningsbiologi. Här har vi demonstrera användningen av ett immunofluorescens test för kvantifiering av γH2AX härdar efter exponering av celler för strålning.
Abstract
DNA dubbel-strängbrott (DSBs), som induceras av antingen endogena metaboliska processer eller av exogena källor, är en av de mest kritiska DNA-skador med avseende på överlevnad och bevarande av genetiska integritet. En tidig reaktion på induktion av DSBs är fosforyleringen av H2A histon varianten, H2AX på serin-139 rester, i starkt konservativa C-terminal SQEY motiv, bildar γH2AX
Protocol
Cellberedningen
- Mänskliga keratinocyter (FEP-1811) odlades i keratinocyte-Serum Gratis Medium (K-SFM, Invitrogen) kompletteras med epidermal tillväxtfaktor, nötkreatur hypofysen extrakt och 20 mikrogram / ml gentamicin, vid 37 ° C och 5% CO 2.
- En enda cellsuspension förbereddes genom att dra med trypsin-EDTA (0,05% v / v)
- Cellerna var seedade i 8-väl Lab Tek II microchamber diabilder (10.000 celler / brunn) och diabilder inkuberades i 3 dagar vid 37 ° C och 5% CO 2.
Bestrålning
- Celler bestrålades på is med 2 Gy med hjälp av en 137 Cs källa (Gammacell 1000 Elit irradiator, Nordion International, ON, Kanada, 20,6 sekunder / Gy)
- Obestrålat kontroll och 2 Gy bestrålade celler inkuberades i 1 timme vid 37 ° C och 5% CO 2.
Immunofluorescens färgning
- Media var tipsad och celler spolades med 300μl PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +) per brunn och var roteras på en roterande blandare i 5 minuter.
- Bufferten blev tipsad och 100μl nyberedd 4% (v / v) paraformaldehyd inkom i varje brunn och diabilder inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter.
Alla inkubationer utfördes i en fuktad färgning tråg - Celler sedan tvättas med PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +). Diabilder placerades i en Coplin burk och roteras på en roterande blandare i 5 minuter. Detta tvättningen upprepades ytterligare två gånger.
- Bufferten blev tipsad och överskott PBS var försiktigt utplånas.
- Celler permeabilized med 100 ml Triton X-100 (0,1% v / v) per brunn och 10 minuters inkubation vid rumstemperatur.
- Cellerna sköljdes med PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +) som beskrivs i steg 3 och 4 ovan.
- Icke-specifik proteinbindning var blockerad med 100ml av BSA (1% v / v) per brunn och 20 minuters inkubation vid rumstemperatur.
- Överskott BSA var tipsad och 100μl av primär mus monoklonala anti-fosfor histon-H2AX antikropp (utspätt 1:500 i 1% BSA, Millipore), lades till varje brunn för en 1 timmes inkubation vid rumstemperatur.
- Cellerna sköljdes med PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +) som beskrivs i steg 3 och 4 ovan och inkuberas med 100μl av sekundär antikropp (Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG utspädd 1:500, i 1% BSA ; Invitrogen) per brunn i 45 minuter vid rumstemperatur i mörker. (Efter utspädning antikroppar hölls i mörker under hela förfarandet)
- Cellerna sköljdes med PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +) som beskrivs i steg 3 och 4 ovan. Emellertid var exponering för ljus minimeras med hjälp av folie.
- Nuclear motfärgning utfördes med 100ml TOPRO3 (efter utspädning 1:500, Invitrogen) per brunn och 10 minuters inkubation vid rumstemperatur
- Cellerna sköljdes med PBS (w / o Ca 2 + eller Mg 2 +) enligt beskrivningen i steg 10 ovan.
- Kamrarna försiktigt togs bort från bilderna, var överflödig fukt torkas och diabilder fick lufttorka.
- En droppe av Förläng GOLD anti-fade lösning (Invitrogen) inkom per brunn och diabilder var monterade (22x50 mm täckglas) och överflödig vätska runt kanterna på bilden var utplånat.
- Bilderna hölls i mörker i ytterligare 30 minuter i rumstemperatur före tätning med nagellack.
- Bilderna förvarades över natten i 4 ° C i mörker före analys.
Mikroskopi / Analys
- Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe användas för att förvärva bilder med standarden GFP (för γH2AX - Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG) och långt rött laser (för TOPRO-3). Normalt är en 63 x oljeimmersion objektiv som används.
Bilderna förvärvats i ett Z-serie mönster med en steglängd på 0,5 mm. Ett steg storlek på 0,5 ìm valdes för att minimera förlust av foci finns i olika plan i cellkärnorna. Vid analys är individuella plan deconvoluted och staplas för att producera en maximal projicerad bild för att minimera överlappning av foci (top-hat filtret tillämpas). - Metamorfa (Molecular Devices, USA) användes för att analysera antalet foci.
Programmet quantitates antalet foci i varje cell efter att tröskeln har tillämpats att utesluta bakgrunden. Den information som loggas i en Microsoft Excel-kalkylblad för vidare analys.
Figur 1. Immunofluorescens visualisering av γH2AX foci (grön) i obehandlat mänskligt keratinocyter och i celler bestrålas med 2 Gy och inkuberas i ytterligare 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2. DNA var fläckad med TOPRO-3 (blå). Bilderna har förvärvats med hjälp av en Zeiss LSM 510 Meta konfokalmikroskop. Bar = 10 mikrometer.
Figur 2. Immunofluorescens visualisering av γH2AX foci (grön) i mänskliga keratinocyter och i celler bestrålas med 2 Gy och inkuberas i ytterligare 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2. Bilderna har förvärvats med hjälp av en Zeiss LSM 510 Meta konfokalmikroskop med 0,5 ìm Z-sektionering (1-9) för att se alla härdar förvärvades. Bilderna var då staplas för kvantifiering med hjälp av metamorfa. DNA var fläckad med TOPRO-3 (blå). Den staplade γH2AX och blå bilderna staplade för visualisering. Bar = 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter exponering för joniserande strålning (γ-strålar), γH2AX fokus formen snabbt och fokus siffror uppgå till högst mellan 30-60 minuter 2. Därför speglar vår 1 timme efterbestrålning tidpunkt första DSB bildas. Vi har använt kliniskt relevant stråldosen av 2 Gy för vårt experiment. Däremot kan metoden användas för stråldoser upp till 4 Gy för detektering av första DSB utformning; betydande överlappning av foci utesluter exakt kvantifiering vid högre doser. Högre stråldoser kan användas för längre efterbestrålning inkubationstider som γH2AX härdar går förlorade på grund av reparation, vilket resulterar i mätbara siffror. Normalt är 4 timmar och upp till 24 timmar efter bestrålning inkubationstiderna används för övervakning av DNA-reparation. Vi har använt DNA fläcken TOPRO-3 på grund av begränsningar i excitation lasrar av våra konfokalmikroskop. Oftare är 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydroklorid (DAPI) som används för kärnkraft motfärgning. Även om vi använde en konfokalmikroskop, epifluorescent mikroskop med Z-sektionering kapacitet är tillräcklig. Den immunofluorescens metod är lämplig för andra anhängare cancer och normala cellinjer, vi har testat T98G mänskliga glioblastom och normala humana endotelceller och råtta H9c2 embryonala ventrikulär myocyter.
Slutligen är kvantifiering av γH2AX användbara i samband med joniserande strålning-inducerad DNA-skador, för övervakning av DNA-skador, vilket illustreras av vårt experiment och reparation (strålning känslighet). Analysen är också användbar för att utvärdera effekten av föreningar som modulera cellulära svaren på strålning (dvs strålning beskyddare och allergiframkallande). Vidare är γH2AX fram som en potentiell molekylär markör i åldrande och sjukdomar, främst cancer 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
