Summary
لقد أصبح القياس الكمي للالشرائط المزدوج حبلا الحمض النووي باستخدام تشكيل γH2AX كعلامة الجزيئية أداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي للالكمي للبؤر γH2AX بعد التعرض للإشعاع من الخلايا.
Abstract
الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) ، والتي يسببها إما عمليات الأيض الذاتية أو من مصادر خارجية ، هي واحدة من آفات الحمض النووي الأكثر حرجا بالنسبة لبقاء والحفاظ على سلامة الجينوم. استجابة مبكرة للتحريض DSBs هو البديل من الفسفرة H2A هيستون ، H2AX ، على بقايا سيرين 139 ، في غاية الحفظ عزر SQEY C - المحطة ، وتشكيل γH2AX
Protocol
خلية التحضير
- ونمت الخلايا القرنية البشرية (FEP - 1811) في خلية كيراتينية المصل متوسطة الحرة (K - SFM ؛ Invitrogen) تستكمل مع عامل نمو البشرة ، واستخراج الغدة النخامية الأبقار و 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- وقد أعد تعليق خلية واحدة من قبل مع فصل التربسين - EDTA (0.05 ٪ V / V)
- وكانت المصنفة الخلايا في المختبر جيدا 8 شرائح تك microchamber الثاني (10،000 خلايا / جيد) وحضنت الشرائح لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
إشعاع
- وكانت الخلايا المشع على الجليد مع 2 غراي باستخدام مصدر سيزيوم 137 (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، ON ، كندا ؛ 20.6 ثانية / غراي)
- وحضنت السيطرة غير المشع والمشع 2 غراي الخلايا لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
المناعي تلطيخ
- وكان من المتوقع وسائل الاعلام وجرفت المياه قبالة الخلايا مع 300μl من برنامج تلفزيوني (ث / س كا 2 + 2 + أو Mg) لكل بئر وكانت استدارة على خلاط مدارية لمدة 5 دقائق.
- وكان من المتوقع أن العازلة قبالة و100μl من 4 ٪ الطازجة (V / V) وأضيف إلى كل بارافورمالدهيد جيدا والشرائح وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
وأجريت جميع حضانات في حوض تلطيخ ترطيب - تم غسلها ثم الخلايا مع برنامج تلفزيوني (ث / س كا 2 + 2 + أو Mg). وضعت الشرائح في جرة Coplin وتناوب على خلاط مدارية لمدة 5 دقائق. وتكررت هذه الخطوة غسل مزيد من مرتين.
- وكان من المتوقع أن العازلة قبالة ونشف بلطف الزائدة برنامج تلفزيوني.
- وكانت الخلايا باستخدام permeabilized 100ML تريتون X - 100 (0.1 ٪ V / V) وكذلك في الحضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وجرفت المياه الخلايا مع برنامج تلفزيوني (كا ث / س 2 + 2 + أو Mg) كما هو موضح في الخطوات 3 و 4 أعلاه.
- تم حجب غير محددة وملزمة البروتين مع 100ML من جيش صرب البوسنة (1 ٪ V / V) لكل بئر و 20 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة.
- وكان من المتوقع BSA الزائدة والخروج من الماوس وحيدة النسيلة 100μl الأولية الضد - H2AX هيستون مكافحة الفوسفات (مخفف 1:500 ، في جيش صرب البوسنة 1 ٪ ؛ ميليبور) ، وأضيف إلى كل جيدا لاحتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- وجرفت المياه الخلايا مع برنامج تلفزيوني (كا ث / س 2 + 2 + أو Mg) المخفف كما هو موضح في الخطوات 3 و 4 أعلاه ، وحضنت مع 100μl من الأجسام المضادة الثانوية (488 فلور اليكسا الماعز المضادة للمفتش الماوس 1:500 ، في جيش صرب البوسنة 1 ٪ ؛ Invitrogen) لكل بئر لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. (كان يحتفظ الضد المخففة في الظلام طوال الداخلي)
- وجرفت المياه الخلايا مع برنامج تلفزيوني (كا ث / س 2 + 2 + أو Mg) كما هو موضح في الخطوات 3 و 4 أعلاه. ومع ذلك ، كان التقليل من التعرض للضوء باستخدام احباط.
- تم تنفيذ counterstaining النووية مع 100ML TOPRO3 (مخفف 1:500 ؛ Invitrogen) لكل بئر والحضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
- وكانت تغسل مع خلايا (كا ث / س 2 + 2 + أو Mg) في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 10 أعلاه.
- وقد أزيلت بعناية غرف من الشرائح ، ونشف الرطوبة الزائدة وسمح الشرائح للهواء الجاف.
- وأضاف قطرة واحدة من الذهب المضادة للإطالة تتلاشى الحل (Invitrogen) لكل بئر وكانت منصة الشرائح (22x50 ملم ساترة) وكان نشف أي السائل الزائد حول حواف الشريحة.
- بقيت الشرائح في الظلام لمدة 30 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة قبل الختم مع طلاء الأظافر.
- تم تخزين الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام قبل التحليل.
المجهري / تحليل
- زايس LSM510 ميتا متحد البؤر Microscpe المستخدمة للحصول على الصور باستخدام GFP القياسية (لγH2AX -- اليكسا 488 فلور الماعز المضادة للمفتش الماوس) ، وأشعة الليزر الحمراء حتى الآن (على TOPRO - 3). عادة ، يتم استخدام النفط × 63 غمر عدسة الهدف.
يتم الحصول على الصور في نمط Z - سلسلة مع حجم الخطوة من 0.5 ميكرون. وتم اختيار حجم من 0.5 ميكرومتر خطوة للحد من الخسائر في الطائرات الحالية في بؤر مختلفة في النوى. خلال التحليل ، deconvoluted طائرات الفردية ومكدسة لإنتاج صورة الأقصى المتوقع للحد من تداخل البؤر (أعلى قبعة التصفية المطبقة). - وقد استخدم Metamorph (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة) لتحليل عدد من البؤر.
برنامج quantitates عدد من البؤر في كل خلية بعد تطبيق عتبة لاستبعاد الخلفية. يتم تسجيل المعلومات في جدول بيانات Microsoft Excel لمزيد من التحليل.
الشكل 1. التصور المناعي بؤر γH2AX (الأخضر) في الخلايا القرنية البشرية غير المعالجة في الخلايا والمشع مع 2 غراي والمحتضنة لمدة ساعة 1 مرة أخرى في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. وكان ملون الحمض النووي مع TOPRO - 3 (الأزرق). تم الحصول على الصور باستخدام LSM زايس مجهر متحد البؤر 510 ميتا. بار = 10 ميكرومتر.
الشكل 2. التصور المناعي بؤر γH2AX (الأخضر) في الخلايا القرنية في الخلايا البشرية والمشع مع 2 غراي والمحتضنة لمدة ساعة 1 مرة أخرى في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر زايس LSM ميتا 510 متحد البؤر باستخدام 0.5 ميكرومتر Z - sectioning (1-9) لضمان الحصول عليها جميع البؤر. ثم كانت مكدسة الصور لاستخدام الكميات Metamorph. وكان ملون الحمض النووي مع TOPRO - 3 (الأزرق). وكانت مكدسة γH2AX مكدسة والصور الزرقاء لالتصور. بار = 10 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بعد التعرض للإشعاع المؤين (γ السينية) ، γH2AX شكل بؤر بؤر الأرقام بسرعة والتوصل إلى الحد الأقصى ما بين 30-60 دقيقة 2. لذا ، لدينا الوقت ساعة 1 نقطة بعد التشعيع يعكس تشكيل الأولي DSB. لقد استخدمنا جرعة الاشعاع ذات الصلة سريريا من 2 غراي عن تجربتنا. ومع ذلك ، يمكن استخدام أسلوب الجرعات الإشعاعية تصل إلى 4 غراي للكشف عن تشكيل جهاز تسوية المنازعات الأولية ؛ تداخل كبير من بؤر يمنع الكميات دقيقة في الجرعات الكبيرة. ويمكن استخدام جرعات أعلى من الإشعاع لأوقات أطول الحضانة بعد التشعيع ، حيث خسر γH2AX بؤر بسبب إصلاح ، مما أدى إلى أرقام قابلة للقياس الكمي. عادة ، يتم استخدام 4 ساعات وتصل إلى 24 ساعة مرات الحضانة بعد التعرض للإشعاع لإصلاح الحمض النووي للرصد. لقد اعتدنا على الحمض النووي وصمة عار TOPRO - 3 بسبب القيود في الليزر من الإثارة لدينا مبائر المجهر. أكثر شيوعا ، ويستخدم 4،6 - diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد (دابي) لcounterstaining النووية. على الرغم من أننا استخدام المجهر مبائر ، المجاهر epifluorescent باستخدام z - sectioning قدرة كافية. الأسلوب هو مناسبة المناعي للسرطان وأخرى ملتصقة خطوط الخلية الطبيعية ؛ اختبرناها T98G ورم أرومي دبقي الإنسان العادي والخلايا البطانية الإنسان والفئران H9c2 myocytes البطين الجنينية.
أخيرا ، من الكميات γH2AX مفيد في سياق الإشعاع المؤين الناجم عن الحمض النووي من التلف ، على الحمض النووي من التلف الرصد كما يتضح من تجربتنا وإصلاح (حساسية الإشعاع). في مقايسة مفيد أيضا لتقييم فعالية من المركبات التي تعدل الاستجابات الخلوية للإشعاع (حماة أي إشعاع والمحسسات). مزيد من γH2AX يبرز بوصفه علامة جزيئية محتملة في الشيخوخة والمرض ، والسرطان في الغالب في 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). ويدعم LM عن طريق البحث في ملبورن (جامعة ملبورن) والمنح الطبية التكميلية لجنة حقوق الطفل التصوير. وبدعم من جامعة موناش مايكرو التصوير (الدكاترة ستيفن كودي وكارمايكل Iśka) لا تقدر بثمن لهذا العمل.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
