Summary

L'esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei</em

Published: January 26, 2011
doi:

Summary

I telomeri sono essenziali per la stabilità dei telomeri dei cromosomi e la G-sbalzo struttura è essenziale per la telomerasi mediato conservazione dei telomeri. Abbiamo recentemente adottato due metodi per individuare i telomeri G-sbalzo struttura<em> Trypanosoma brucei</em>, Che sono nativi in ​​gel di ibridazione e ligation-mediata primer extension, che saranno descritti.

Abstract

Il G-sbalzo struttura dei telomeri è stato identificato negli eucarioti tra cui lievito, vertebrati, e Trypanosoma brucei. Esso funge da substrato per la telomerasi per de novo sintesi del DNA dei telomeri e quindi è importante per il mantenimento dei telomeri. T. brucei è un protozoo parassita che causa la malattia del sonno negli esseri umani e nagana nei bovini. Una volta infettato dei mammiferi, T. cellula brucei interruttori regolarmente il suo antigene di superficie di eludere attacco immunitario dell'ospite. Abbiamo recentemente dimostrato che il T. brucei struttura dei telomeri svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell'espressione genica antigene di superficie, che è critica per T. brucei patogenesi. Tuttavia, T. brucei struttura dei telomeri non è stata ampiamente studiata a causa delle limitazioni dei metodi per l'analisi di questa struttura specializzata. Ora abbiamo adottato con successo il nativo in gel ibridazione e ligation-mediata metodi fondo estensione per l'esame del telomero G-sbalzo struttura e un metodo di legatura adattatore per la determinazione del terminale dei telomeri nucleotide in T. brucei cellule. Qui, verranno descritti i protocolli in dettaglio e confrontare i loro diversi vantaggi e limitazioni.

Protocol

1. Rileva T. brucei telomeri G-sbalzo utilizzando nativi In-gel ibridazione 3 Principio (Figura 1): In condizioni native, una soluzione end-etichetta (CCCTAA) 4 (TELC) oligo sonda può ibridare solo al singolo filamento telomeri G-sbalzo regione. L'intensità di ibridazione è proporzionale alla lunghezza dello sbalzo. Dopo la denaturazione e neutralizzazione, la sonda stessa sarà in grado di ibridare la regione dei telomeri intera. L'intensità di ibrid…

Discussion

Trypanosoma brucei causa la malattia del sonno negli esseri umani. Questa malattia, se non trattata, è inevitabilmente fatale. T. cellule brucei a ospiti mammiferi subiscono variazione antigenica regolarmente in modo da eludere l'attacco immunitario dell'ospite 7. Quindi è molto difficile da eliminare T. cellule brucei una volta l'infezione è stabilita. Abbiamo recentemente dimostrato che i telomeri svolgono un ruolo importante nella regolazione dell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il Dott. Carolyn Prezzo per discussioni scientifiche e suggerimenti penetranti. Questo lavoro è supportato dal NIH concedere AI066095 (PI: Bibo Li).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SeaKem LE Agarose   Lonza 50004  
Agarose Type VII (low melting agarose)   Sigma A4018  
Proteinase K, recombinant, PCR grade   Roche Diagnostic 03 115801001  
Exo I   NEB M0293  
Exo T   NEB M0265  
T7 exonuclease   NEB M0263  
T4 DNA polymerase   NEB M0203  
QIAquick nucleotide removal kit   Qiagen 28304  

References

  1. Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
  2. Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
  3. Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
  4. McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
  5. Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
  6. Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
  7. Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
  8. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).

Play Video

Cite This Article
Sandhu, R., Li, B. Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (47), e1959, doi:10.3791/1959 (2011).

View Video