Summary
التيلوميرات ضرورية لتحقيق الاستقرار كروموسوم والتيلومير G - عبء بنية أساسية لتيلوميراز بوساطة صيانة التيلومير. اعتمدنا مؤخرا طريقتين للكشف عن التيلومير G - المتراكمة في هيكل
Abstract
تم التعرف على مجموعة عبء التيلومير هيكل في حقيقيات النوى بما في ذلك العديد من الخميرة ، والفقاريات ، والمثقبية البروسية. انها بمثابة الركيزة لتيلوميراز لنوفو توليف الحمض النووي دي التيلومير ولذا فمن المهم للصيانة التيلومير. T. البروسية هو طفيلي الذي يسبب مرض النوم في البشر والماشية في nagana. الثدييات المضيفة المصابة مرة واحدة ، T. البروسية خلية مفاتيح مستضد سطحه بانتظام لتجنب هجوم المضيف المناعية. وقد أثبتت لنا مؤخرا أن T. البروسية التيلومير هيكل يلعب دورا أساسيا في تنظيم التعبير الجيني مستضد السطح ، وهو أمر حاسم بالنسبة T. البروسية المرضية. ومع ذلك ، T. لم البروسية التيلومير هيكل درس على نطاق واسع نظرا لمحدودية وسائل لتحليل هذه البنية المتخصصة. لدينا الآن اعتمدت بنجاح الأصلي في هلام التهجين وربط التمديد بوساطة أساليب الفحص التمهيدي للهيكل G - عبء التيلومير وسيلة ربط محول للعزم محطة التيلومير النوكليوتيدات في T. خلايا البروسية. هنا ، فإننا سوف تصف البروتوكولات بالتفصيل ومقارنة مزاياها المختلفة والقيود.
Protocol
1. كشف T. البروسية التيلومير التهجين في هلام - G - عبء استخدام اللغة 3
المبدأ (الشكل 1) : تحت الشرط الأصلي ، ووضع حد المسمى (CCCTAA) 4 (TELC) بنسبة ضئيلة التحقيق يمكن فقط للهجن التيلومير واحد الذين تقطعت بهم السبل G - عبء المنطقة. كثافة التهجين غير متناسبة مع طول المتراكمة. بعد تمسخ وتحييدها ، سيقوم المسبار نفسه يكون قادرا على هجن في المنطقة برمتها التيلومير. كثافة تهجين الحمض النووي التيلومير يمثل المبلغ الإجمالي ، ويمكن استخدامها كعنصر تحكم التحميل. اثنين من عناصر التحكم القياسية لهذه التجربة والتهجين باستخدام نهاية المسمى (TTAGGG) 4 (TELG) بنسبة ضئيلة التحقيق الذي لا ينبغي أن يسفر عن أية إشارة إلى T. البروسية الخلية لا يملك التيلومير C - عبء الهيكل ، وعلاج الجيني مع الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل exonucleases 3' محددة مثل أنا إكسو أو تي إكسو قبل التهجين ، التي ينبغي القضاء على الأم إشارة TELC التهجين.
الخطوة 1. إعداد المقابس الحمض النووي لالكهربائي النبضي (PFGE)
وسيتم فصل الكروموسومات سليمة بواسطة PFGE. ولذلك ، على استعداد الحمض النووي DNA الجينومية والمقابس.
- تبدأ مع 100 مليلتر من الدم شكل خلايا (في الخلايا -2000000 1.5 / مل) أو 20 مل من الخلايا procyclic (ب 10 مليون خلية / مل).
- حل 1.6 ٪ منخفضة ذوبان نقطة (LMP) agarose العازلة في لتر (0.01 م تريس • CL 7.6 درجة الحموضة ، كلوريد الصوديوم 0.02 M ، 0.1 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0) وابقائه دافئا عند 50 درجة مئوية.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 1.5 krpm ، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. طاف وإزالة الخلايا resuspend بيليه مع العازلة L إلى التركيز النهائي 5 ملايين خلية / مل.
- احتضان تعليق خلية في 42-50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 1 حجم agarose LMP إلى 1 حجم الخلايا. تخلط جيدا ولكن بسرعة.
- قسامة 85 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من العفن المكونات المتاح (BioRad).
- بعد 5-10 دقيقة أو حتى توطد المقابس ، والمقابس نقل في أنبوب 15 مل مخروطية العازلة مع 5 مل لتر / Sarkosyl 1 ٪. إضافة 100 ميكرولتر من 250 ملغ / مل بروتين كاف أو قليل من مسحوق بروتين كاف ، ومزيج جيد ، واحتضان في 50 ساعة لمدة 48 درجة مئوية.
- تجاهل العازلة ، وغسل المقابس مع 5 مل من العازلة L مرتين وتكرار بروتيناز K الهضم لمدة ساعة 48. غسل المقابس مع العازلة L الطازجة مرة أخرى. مخزن المقابس عند 4 درجة مئوية في المخزن L. وينبغي أن تستخدم هذه المقابس في حدود 2 أسابيع.
الخطوة 2. T. سليمة منفصلة الكروموسومات البروسية باستخدام نابض الكهربائي جل الميدانية
- إعداد agarose هلام
- 2-3 إعداد L 0.5 x و العازلة TBE نقل إلى غرفة الجل تشغيل وحدة CHEF (BioRad) DRII. ضبط درجة حرارة التشغيل ، بدء تشغيل المضخة ، ثم بدء تشغيل وحدة التبريد.
- تحضير 100 مل من هلام agarose ٪ 1.2 في 0.5 العازلة TBE س. agarose بارد أثناء إعداد علبة هلام.
- يقرر النظام العينة. تذكر لتشمل مستوى الحمض النووي. الجافة المشط وضعه على سطح مستو. وضع كل المكونات على الحمض النووي في السن المناسبة. إزالة العازلة المفرط حول الحمض النووي عن طريق توصيل القابس حتى تطلع سوف تتمسك الأسنان.
- صب جل agarose دون إدراج المشط. ندعه يبرد إلى 40-50 درجة مئوية (بضع دقائق) ، تدرج ببطء المشط مع المقابس تعلق في هلام. تأكد من أن لا تنزلق المقابس قبالة المشط. السماح لترسيخ هلام. إزالة المشط من الجل ببطء.
- نابض الكهربائي الميدانية جل
تشغيل وحدة في هلام DRII CHEF : 700 ق ق البقول - 1500 ، 2.5 V / سم عند 12 درجة مئوية لمدة 120 ساعة.
الخطوة 3. وصمة عار ويزيل اللون هلام agarose
وصمة عار الجل مع بروميد إيثيديوم 1μg / مل س في 0.5 في TBE RT : 1 ساعة ثم في TBE X 0.5 دون بروميد إيثيديوم لمدة 1 ساعة مع هزاز لطيف. التقاط صورة من هلام.
الخطوة 4. تجفيف agarose هلام
وضع الجل على agarose طبقتين من 3 مم Whatman الورق وتغطية الجل مع غلاف بلاستيكي. جفاف في هلام RT (لا ينبغي أن تكون ساخنة الجل أكثر من 50 درجة مئوية لتفادي أي تمسخ من عينات الحمض النووي). استبدال الأوراق الرطبة Whatman بأخرى جافة بعد 2 و 4 ساعات من التجفيف ، على التوالي. إبقاء التجفيف حتى الجل جافة تماما. قد يستغرق ذلك بين عشية وضحاها تبعا لمجفف.
الخطوة 5. تسمية تحقيقات جزئية
مزيج من 1 ميكرولتر TELC نانوغرام / ميكرولتر 50 أو جزئية TELG مع 1 ميكرولتر من 10 × عديد النوكليوتيد العازلة (PNK) كيناز ، 5 ميكرولتر من γ [32P] ATP ، 2 ميكرولتر من DDH 2 O ، و 1 ميكرولتر من PNK T4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إضافة 90 ميكرولتر من TNES العازلة (10 ملي تريس الكلورين ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ٪ SDS) إلى خليط التفاعل.
بينما وصفها oligoes ، بإعداد G - 25 عمود : وضع بعض الصوف الزجاجي في حقنة سم 3 وعليه الاشياء بشكل وثيق مع تلميح ماصة. ملء الحقنة مع Sephadex G - 25 دقيقة (autoclaved في TE) إلى علامة مل 3. ندعه تسوية من حيث الوزن. لتنقية التحقيق المسمى : تحميل دقق في أعلى العمود. يغسل مع 700 ميكرولتر من TNES العازلة ، وأزل مع 600 ميكرولتر من TNES العازلة. بدلا من ذلك ، تنقية المسبار المسمى باستخدام سبين مصغرة سريعة ™ العمود (روش العلوم التطبيقية).
خطوة 6 : التهجين
- رطبة لفترة وجيزة الجل المجففة في الماء المقطر ، ويغسل أي ورقة Whatman عالقين على الجل
- وضع الجل في كيس التهجين وإضافة 20 مل من hybridiztion العازلة (0.25M نا 2 4 هبو pH7.2 ؛ EDTA 1 ملم و 7 ٪ SDS ؛ 1 ٪ BSA وتصفيتها من خلال تصفية 0.22 ميكرون). احتضان في حمام الماء عند 50 درجة مئوية مع هزاز لطيف لما لا يقل عن 1 ساعة.
- إزالة المنطقة العازلة قبل التهجين. تغلي التحقيق المسمى لمدة 5 دقائق وإضافته إلى 25 مل من التهجين عازلة جديدة ، فلتر تعقيم المزيج مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون وإضافة مزيج التهجين مباشرة إلى حقيبة التهجين. ختم الكيس ووضعه في وعاء الضحلة مع الماء الدافئ. مكان الحاوية كله في حمام مائي. احتضان عند 50 درجة مئوية خلال الليل مع هزاز لطيف.
- قطع فتحة صغيرة في الكيس التهجين. أسكب أكبر قدر ممكن من المزيج التهجين وحفظه في أنبوب مخروطي 50 مل. إبقاء لجنة التحقيق في المجمدة -20 درجة مئوية. إزالة هلام من الكيس التهجين ووضعها في وعاء.
في هذه الخطوة سيكون كل شيء حار ويحتاج تنظيف واسعة النطاق (مقاعد البدلاء ، والشاشة ، مقص ، الخ. تأكد من ارتداء القفازات الطبقات المزدوجة! - اغسل الجل في SSC × 4 لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. استبدال العازلة غسل الطازجة وكرر مرتين.
- اغسل الجل في SDS SSC/0.1 × 4 ٪ عند 50 درجة مئوية.
- وضع الجل على قطعة من الورق Whatman 3 مم والجافة طفيفة الجل.
- التفاف هلام مع غلاف بلاستيكي وفضح لphosphorimager لمدة 3 أيام ~
- مسح phosphorimager
- احتضان الجل في تغيير طبيعة عازلة (1.5 م كلوريد الصوديوم ، هيدروكسيد الصوديوم 0.5 M) في RT لمدة 30 دقيقة
- اغسل الجل في تحييد العازلة (3 M كلوريد الصوديوم ، 0.5 M تريس • الحموضة CL / 7.0) على RT لمدة 30 دقيقة
- شطف في الماء المقطر لمدة 3 دقائق
- عند درجة حرارة 55 مئوية قبل هجن مقابل 1 ساعة
- كرر التهجين باستخدام مسبار المحتوية على نفس مزيج التهجين عند 55 درجة مئوية خلال الليل.
- يغسل على النحو الموصوف أعلاه إلا في 55 درجة مئوية.
- التفاف جل وفضح لphosphorimager للساعة 2 ~.
- مسح phosphorimager. تطبيع إشارة التهجين التي تم الحصول عليها قبل أن تمسخ مع تمسخ تم الحصول عليها بعد.
2. تحديد الطرفية التيلومير النكليوتيد بواسطة ربط محول 6
'هو ligated نهاية المسمى قليل النوكليوتيد فريدة ل3' 5 ونهاية عبء - G : المبدأ (الشكل 2A و 2B). ويتم تحقيق هذا عن طريق الصلب محددة بنسبة ضئيلة دليل التكميلية. وسيتم ligated فقط بنسبة ضئيلة تحمل متواليات محول فريدة / دليل متوافق مع تسلسل التيلومير محطة G - المتراكمة. لT. البروسية ، التي قد تنتهي في التيلوميرات واحدة من ست النيوكليوتيدات مختلفة من يكرر TTAGGG. بالتالي فهي دليل oligoes استخدموا ستة مختلفة (TG1 - TG6 ، الشكل 2A). بعد ربط ، يتم هضم الحمض النووي مع endonucleases التقييد وحلها على جل agarose.
- كيناز من العلاج بنسبة ضئيلة فريدة من نوعها.
مزيج من 6 ميكرولتر pmole 10 / جزئية فريدة ميكرولتر مع 3 ميكرولتر من الاحتياطي PNK 10X ، 5 ميكرولتر من γ [32 ف] ATP ، 14 ميكرولتر من DDH 2 O ، و 2 ميكرولتر (10 U) من PNK T4. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. - إزالة النوكليوتيدات الساخنة الفردية.
استخدام طقم Qiaquick النوكليوتيدات إزالة لإزالة الساخنة الفردية للاعبي التنس المحترفين وأزل في نهاية المسمى بنسبة ضئيلة مع 60 ميكرولتر من الاحتياطي شطف (تركيز النهائي سيكون pmole ~ 1 / ميكرولتر). - يصلب جزئية فريدة من نوعها لدليل بنسبة ضئيلة (لإنشاء محول).
أضف 10 ميكرولتر من تنقية جزئية فريدة من نوعها إلى 2 ميكرولتر من كل جزئية دليل و 1 ميكرولتر العازلة الصلب (200 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة). وضع أنابيب إلى عناصر مستوى فرعي حرارة 85 مئوية وإيقاف كتلة الحرارة. السماح للأنابيب وكتلة حرارة باردة لRT. هذا سيستغرق بضع ساعات. لو كان في أنبوب نقل امرنا ، وبعد 5 دقائق كل إلى 65 درجة مئوية ، ثم 37 درجة مئوية ، والسماح لتبرد ثم RT. - محولات Ligate إلى مجموع الحمض النووي الجيني.
إلى 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي سليمة ، وإضافة 4 من 5 ميكرولتر العازلة يغاز س ، 10 ميكرولتر من oligos صلب ، 2.5 ميكرولتر من DDH 2 O ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي يغاز T4. احتضان عند 16 درجة مئوية خلال الليل. - تقييد نوكلياز داخلية الهضم
إلى 20 ميكرولتر من الناتج ربط إضافة 3 ميكرولتر من 10 العازلة NEB × 4 ، 1.5 ميكرولتر من AluI ومبوي لكل منهما ، و 4 ميكرولتر من DDH 2 O. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية خلال الليل. - الكهربي.
إضافة 3 ميكرولتر من 10 × G صبغ برتقالي (الجلسرين 50 ٪ ، و 0.5 ٪ البرتقالية G) لكل عينة. تحميل عينات من الحمض النووي على 20X20 سم agarose هلام 0.7 ٪ في TBE X 0.5 مع 0.2 ميكروغرام / مل بروميد إيثيديوم. تشغيل في 30V لمدة 30 دقيقة ، ثم جontinue مع الجهد العالي ولكن أقل من 120V إلى ما مجموعه 1000 ساعة ت. التقاط صورة من هلام مع حاكم بجوار علامة الحمض النووي. - هلام الجافة وفضح.
وضع الجل agarose على طبقة من ورق الترشيح وDE81 طبقتين من 3 ملم ورقة Whatman تغطية الجل مع غلاف بلاستيكي. الجافة في هلام RT. فضح الجل المجفف إلى phosphorimager بين عشية وضحاها.
3. ملحق ربط التمهيدي ساطة 6
المبدأ (الشكل 2A و 2C) : هو قليل النوكليوتيد ligated وفريدة من نوعها ل3 'G - المتراكمة مع تسلسل محطة معينة ، تحددها تسلسل المكملة له في المحول (الدليل) بنسبة ضئيلة. بعد تنقيتها ، وبنسبة ضئيلة دليل المسمى الذي لا يزال في صلب بنسبة ضئيلة G-overhang/unique التمهيدي هو يمتد ليشمل تقاطع SS - DS باستخدام الحمض النووي بوليميريز T4 ، الذي يفتقر الى النزوح حبلا والأنشطة نوكلياز خارجية 5' - 3 ". المنتجات تمديد التمهيدي يعطي بالتالي طول عبء - G.
- العلاج كيناز من oligoes دليل وفريدة من نوعها
- مزيج 20 ميكرولتر من 10 pmole / جزئية فريدة ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من 10 العازلة PNK س ، 20 ميكرولتر 5 العازلة يغاز × (الذي يحتوي على 10 ملي ATP) ، 3 ميكرولتر (30 U) من PNK T4 ، و 47 ميكرولتر من DDH 2 O . احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- مزيج 1 ميكرولتر من 10 pmole / ميكرولتر بنسبة ضئيلة دليل مع 1 ميكرولتر من 10 العازلة PNK س ، 2 ميكرولتر من γ [32 ف] ATP ، 1 ميكرولتر (10 U) من PNK T4 و 5 ميكرولتر من DDH 2 O. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- يصلب دليل جزئية وجزئية فريدة
أضف 10 ميكرولتر (20 pmole) بنسبة ضئيلة من فسفرته فريدة من نوعها و 10 ميكرولتر (10 pmole) من نهاية المسمى بنسبة ضئيلة دليل في أنبوب 1.5 مل إيبندورف (نسبة 2:01 فريدة من نوعها لتوجيه بنسبة ضئيلة يضمن يلدن كل جزئية دليل ). اتبع نفس الإجراءات الموضحة في البروتوكول الثاني لoligoes الصلب. - Ligate دليل صلب / فريدة محول بنسبة ضئيلة لتحقيق غايات التيلومير
اتبع نفس الإجراءات الموضحة في البروتوكول الثاني لربط الحمض النووي. - الحمض النووي يعجل مع حجم 1 / 10 من خلات الصوديوم و 2.5 حجم الايثانول الجليد الباردة في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تدور أسفل الحمض النووي بيليه في 12 krpm ، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل الحمض النووي مع 70 ٪ من الإيثانول وحل البليت في 10 ميكرولتر من DDH 2 O.
- تمديد التمهيدي
إلى كل عينة DNA 10 ميكرولتر إضافة 2 ميكرولتر من 10 × T4 DNA العازلة البلمرة ، 1 ميكرولتر من جيش صرب البوسنة ملغ / مل 1 ، 1 ميكرولتر من dATP 25 مم ، dCTP ، ولكل dTTP ، 1 ميكرولتر (3 يو) من الحمض النووي البلمرة T4 ، و 3 ميكرولتر من DDH 2 O.
جعل مزيج الرئيسي مع بوليميريز ، العازلة ، وغيرها ، وكمية مناسبة من قسامة المزيج الرئيسي إلى كل عينة من الحمض النووي. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم يضاف 1.2 ميكرولتر من EDTA 0.5M فورا الى رد الفعل. - الكهربي
تمديد تشغيل المنتجات على مادة الأكريلاميد 10 ٪ / 7 هلام urea/1xTBE M. تحميل 4 ميكرولتر من كل عينة. تغلي العينات لمدة 10 دقائق قبل التحميل. تشغيل في 800V في 1X TBE حتى صبغة زرقاء تصل إلى الجزء السفلي من هلام. جفاف الجل على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم على RT لمدة 30 دقيقة ويعرض لمدة 2 ساعة phosphorimager.
لتحضير 100 مل جل بولي أكريلاميد 10 ٪ ، ويحل 41 غراما من اليوريا و 21 مل من محلول مادة الأكريلاميد بنسبة 40 ٪ (الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد 29:1) في 30 مليلتر من الماء المقطر ، إضافة 10 مل من TBE 10X. تجميع ألواح الزجاج. الحق قبل صب جل ، إضافة 1 مل من وكالة الأنباء الجزائرية 10 ٪ و 100 ميكرولتر من TEMED. صب جل ومحاولة تجنب أي فقاعات.
4. ممثل النتائج :
كشف T. البروسية التيلومير G - المتراكمة باستخدام هيكل الأصلي في جل التهجين
سليمة T. تظهر الكروموسومات البروسية مفصولة PFGE في الشكل 3A و 3B (لوحات اليسار). T. عادة ما تحتوي على خلايا البروسية ~ 100 نسخة من minichromosomes ، مع كل نفس الحجم (50-150 كيلو بايت) ، والهجرة إلى الموقف نفسه على هلام (MC). بسبب هذه الحقيقة ، وبعد التهجين مع TELC جزئية التحقيق ، وG - عبء التيلومير الإشارة الأبرز على minichromosomes (الشكل 3A ، وسط لوحة). التهجين مع التحقيق TELG بنسبة ضئيلة عادة لا تسفر عن أي إشارة التهجين (الشكل 3B ، وسط لوحة) لT. خلايا البروسية لم يكن لديك التيلومير C - عبء الهيكل. بعد أن تمسخ وتحييد والتهجين إما مع أو TELC TELG التحقيق جزئية تكشف الإشارات التيلومير على جميع ينتهي كروموسوم (3A و 3B الشكل ، لوحات اليمين).
تحديد محطة التيلومير النوكليوتيدات بواسطة ربط محول
تحميل كمية متساوية من الحمض النووي في كل ممر ضروري لهذا الاختبار ، ويظهر ذلك من خلال تلطيخ بروميد إيثيديوم من هلام. ويرد مثال في الشكل 4A ، اللوحة اليسرى.
في هذا البروتوكول ، و تربط فقط نهاية المسمى فريد بنسبة ضئيلة ودليل المحولات بنسبة ضئيلة إلى نهاية الكروموسوم عندما التيلومير G - يتدلى تنتهي مع متواليات التي تتوافق مع دليل بنسبة ضئيلة. سي NCE على جزئية فريدة من نوعها هو نهاية المسمى ، سوف يكون ربط المنتج المشعة وتعطي إشارة قوية. كما هو مبين في الشكل 4A ، لوحة الحق ، لين 1 يعطي إشارة قوية ، مشيرا إلى أنه تم ligated كمية كبيرة من unique/TG1 محول إلى نهاية التيلومير. TG1 لها تسلسل إنهاء 5'CCCTAA3. ومن هنا التيلومير G - يتدلى ligated لهذه الغاية في محول 5'TTAGGG3. ويلاحظ أي كمية كبيرة من المنتجات باستخدام ربط oligoes دليل الأخرى ، مشيرا إلى أن تنتهي في التيلوميرات TTAGGG هي الغالبة في T. خلايا البروسية.
علاج الجيني DNA مع أنني إكسو إكسو أو تي ، والتي هي عبء nucleases 3 'محددة ، أسفر عن خسائر للمنتجات الربط (الشكل 4A ، اللوحة اليمنى ، والممرات 2 و 3) ، مشيرا الى ان الربط أدى بالفعل من التيلومير G - عبء هيكل
ملحق ربط ساطة التمهيدي
دون ربط ، ونهاية المسمى دليل بنسبة ضئيلة هي 22 NT طويلة. تحميل نهاية المسمى ستوجه بنسبة ضئيلة تكون بمثابة سيطرة سلبية وعلامة الحجم. (الشكل 4B ، لين 11 ، يشير إلى نهاية النجمة التي تحمل علامات دليل بنسبة ضئيلة). نحن عادة نلاحظ أيضا مجموعة من 44 ~ NT السيطرة السلبية في هذا الشكل (4B ، لين 11 ، فتح المثلث) ، والتي هي الأكثر احتمالا بقايا غير التشويه والتحريف المحولات. بعد ربط إلى نهاية الكروموسوم ، وحجم المنتج الموسعة ويعكس طول هيكل G - المتراكمة. معظم T. البروسية التيلومير G - يتدلى في نهاية 5'TTAGGG3 '(الشكل 4A). ومع ذلك ، فإن هذه G - يتدلى يبدو أن تكون قصيرة جدا (فقط ~ 10 NT طويلة) ، وامتدت من المنتجات بنسبة ضئيلة ligated دليل TG1 ليست أطول بكثير من الأخطاء نفسها بنسبة ضئيلة (الشكل 4B ، لين 10) ، لكنها تسمح للرباط TG1 محول (الشكل 4A ، اللوحة اليمنى ، لين 1). وإن كان ligated سوى كمية صغيرة من TG4 محول إلى أقاصي التيلومير (الشكل 4A ، لوحة الحق ، حارة 6) ، والمنتجات تمتد من TG4 ligated تكون أطول من ذلك بكثير (الشكل 4B ، لين 7 ، رؤوس السهم) ، مع كونها أطول المنتج ~ 55 NT. وبالتالي ، لاحظنا نوعين من التيلومير G - المتراكمة في T. خلايا البروسية. السائد التيلومير G - يتدلى في نهاية '5'TTAGGG3 ولكن ليست سوى ~ 10 NT طويلة. قليلة التيلومير G - يتدلى في نهاية 5'GGGTTA3 "ولكن يمكن طويلة تصل NT 40. كلا النوعين من عبء - G حساسة لإكسو T (أو إكسو الأول) العلاج (الشكل 4A ، اللوحة اليمنى ، لين 2 ، 3 ، و 7 ؛ الشكل 4B ، لين 1 والسهام).
الشكل 1. مبدأ التهجين في جل الأصلي. يسار ، تحت شرط الأصلي ، ونهاية التحقيق المسمى TELC بنسبة ضئيلة فقط يمكن أن يهجن مع فائض G الغنية واحد الذين تقطعت بهم السبل التيلومير. شدة التهجين يعكس طول التيلومير عبء - G. الحق ، وبعد تمسخ ، فإن جزئية TELC التحقيق مع جميع هجن DNA التيلومير. شدة هذا التهجين يمثل المبلغ الإجمالي من الحمض النووي التيلومير ويستخدم كعنصر تحكم التحميل ، ويتم احتساب النهائي G - عبء مستوى بقسمة إشارة الأم عن طريق التهجين التي تم الحصول عليها بعد تمسخ.
الشكل 2. مبدأ ربط محول والإرشاد بوساطة ربط التمهيدي : (أ) من متواليات oligoes دليل فريدة من نوعها وستة. (ب) تحديد المحطة التي التيلومير النوكليوتيدات ربط محول. وجزئية فريدة من نوعها هو نهاية المسمى (ملحوظ مع النجمة الحمراء) ، صلب إلى oligoes دليل وligated إلى نهاية التيلومير. فقط عند محول فريدة / دليل يتحمل عبء أ 3 "والتي تتوافق مع محطة تسلسل التيلومير سيتم ligated المحول. (C) في ملحق بوساطة ربط التمهيدي ، والدليل هو جزئية نهاية المسمى (ملحوظ مع النجمة الحمراء) ، وبنسبة ضئيلة في صلب فريد قبل ligated إلى أقاصي الصبغي. ولن تكون فريدة من نوعها ligated محول / دليل تحمل عبء أ 3 "متوافق مع فائض - G. ^ يدل على السندات phophordiester ligated. بعد إزالة أزواج unligated بنسبة ضئيلة ، سيتم تمديد التمهيدي خارجا مع الحمض النووي بوليميريز T4 ، الذي يفتقر الى النزوح حبلا والأنشطة نوكلياز خارجية 5' - 3 ". طول النهائية لدليل بنسبة ضئيلة مدد يعكس بالتالي طول عبء - G.
الشكل 3. T. البروسية التيلومير G - عبء بنية تحليلها من قبل الأم في جل التهجين : (أ) في جل التهجين مع TELC جزئية التحقيق. (ب) في جل التهجين مع TELG جزئية التحقيق. في كل من (أ) و (B) بقي من بروميد Ethedium ، دوري الدرجة الأولى الملون. الأوسط ، مسقط رأسه نتيجة التهجين. الحق ، نتيجة تهجين بعد تمسخ. البرية من نوع T. استخدمت الخلايا البروسية. تم فصل سليمة أو إكسو أنا المعالجة بواسطة الحمض النووي الجيني PFGE. مثلث فتح تقف على الكروموسومات megabase ؛ IC ، الكروموسومات الحجم المتوسط ؛ MC ، minichromosomes.
"/>
الشكل 4. T. البروسية التيلومير G - عبء بنية تحليلها بوساطة ربط التمديد التمهيدي : (أ) معظم T. البروسية التيلومير G - يتدلى في إنهاء 5'TTAGGG3. ، Ethedium اليسار هلام بروميد DNA الملون. يتم تحميل المبلغ يساوي تقريبا من الحمض النووي في كل حارة. الحق ، نتيجة التعرض للهلام نفسه بعد التجفيف. سليمة ، وأنا إكسو المعاملة ، أو كان ligated إكسو T - تعامل الحمض النووي لستة مختلفة نهاية المسمى محولات بنسبة ضئيلة فريدة / دليل على النحو المبين. (ب) ت. التيلوميرات البروسية وقصيرة G - يتدلى. كان إكسو ligated سليمة أو الحمض النووي الجيني تي معاملة مختلفة وستة محولات بنسبة ضئيلة فريدة / دليل يليه ملحق به التمهيدي T4 بوليميريز الحمض النووي. تم تحميل نهاية المسمى TG4 بنسبة ضئيلة كعنصر تحكم السلبية (ممر 11). وتدير نفسها بنسبة ضئيلة في الإقليم الشمالي 22 (*) ولكن أيضا أعطى إشارة خفوتا في الإقليم الشمالي 44 ~ (Δ). أسفرت فقط unique/TG4 محول المنتجات تمديد لفترة أطول كثيرا من الأخطاء نفسها بنسبة ضئيلة (السهم رؤساء ، لين 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المثقبية البروسية يسبب مرض النوم في البشر. هذا المرض ، إذا ما تركت دون علاج ، إلى الوفاة لا محالة. T. البروسية في خلايا الثدييات يستضيف اختلاف مستضدي الخضوع بشكل منتظم من أجل التهرب من هجوم المضيف المناعي 7. وبالتالي فإنه من الصعب جدا للقضاء على T. تم تأسيس خلايا البروسية مرة عدوى. وقد أثبتت لنا مؤخرا أن التيلوميرات تلعب دورا هاما في تنظيم التعبير عن T. البروسية جين مستضد السطحي 8. لذا ، فمن المهم أن نفهم كذلك مهام التيلومير وآليات لصيانة التيلومير في T. خلايا البروسية.
والتيلومير G - عبء بنية أساسية لصيانة تيلوميراز بوساطة التيلومير 5. أساليب لقياس أطوال عبء التيلومير ذات قيمة لدراسة آليات الحفاظ التيلومير. اعتمدنا بنجاح الأصلي في جل 3 التهجين وربط التمديد بوساطة التمهيدي 6 طريقة لتحليل T. البروسية التيلومير G - عبء بنية وطريقة ربط محول للعزم محطة التيلومير النوكليوتيدات. ويمكن لكلا الأم في جل التهجين وطريقة ربط محول تكشف عن المبلغ الإجمالي للعبء G في الخلية ، ولكن فقط لربط التمديد التمهيدي بوساطة يمكن أن تكشف عن تراكم مجموعة بالضبط طول.
لأصلي في التهجين هلام ، فمن المهم أن لا تفسد لعينة من الحمض النووي في جميع أنحاء خطوات الإعداد. يمكن التحكم بذلك عن طريق التهجين الحمض النووي مع TELG جزئية التحقيق. اذ لا يوجد اي التيلومير C - المتراكمة ، ينبغي الأصلي التهجين TELG لا يسفر عن أية إشارة ما لم العينات متمسخ جزئيا. وينبغي أيضا أن تكون العينة المستخدمة في غضون أسبوعين كما التيلومير G - عبء حساس جدا إلى أي نشاط nuclease.
لربط محول والإرشاد التمهيدي ، oligoes تنقية الغلة أكثر وضوحا النتائج. EXO T هو أكثر فعالية من الشق الأول لإكسو 3 'الحمض النووي محددة المتراكمة واحد الذين تقطعت بهم السبل. تحميل عينات متساوية من صلب ضرورية لتحديد مقدار المبلغ الإجمالي للتيلومير G - المتراكمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتورة كارولين السعر للمناقشات العلمية والاقتراحات الثاقبة. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI066095 (PI : بيبو لى).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza Inc. | 50004 | |
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Group | 03 115801001 | |
| Exo I | New England Biolabs | M0293 | |
| Exo T | New England Biolabs | M0265 | |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
