Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur in<em> Trypanosoma brucei</em>, Die zijn eigen in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extensie, die zal worden beschreven.
Abstract
De telomeer G-overhang structuur heeft al in vele eukaryoten, met inbegrip gist, gewervelde dieren, en Trypanosoma brucei. Het dient als substraat voor telomerase voor de novo telomeren DNA-synthese en is daarom belangrijk voor telomeren onderhoud. T. brucei is een protozoaire parasiet die veroorzaakt slaapziekte bij de mens en nagana bij rundvee. Eenmaal besmet zoogdier gastheer, T. brucei cel schakelt regelmatig haar oppervlakte-antigeen te ontwijken van de gastheer immuunsysteem aan te vallen. We hebben onlangs aangetoond dat de T. brucei telomeer structuur speelt een essentiële rol in de regulatie van oppervlakte-antigeen genexpressie, die cruciaal is voor T. brucei pathogenese. Echter, T. brucei telomeer structuur niet is uitgebreid als gevolg van de beperking van de methoden voor de analyse van deze gespecialiseerde structuur bestudeerd. We hebben nu met succes heeft de autochtone in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extension methods voor het onderzoek van de telomeren G-overhang structuur en een adapter ligatie methode voor de bepaling van de telomeren terminal nucleotide in T. brucei cellen. Hier zullen we beschrijven de protocollen in detail en vergelijken hun verschillende voordelen en beperkingen.
Protocol
1. Detecteren T. brucei telomeren G-overhang met behulp van inheemse In-gel hybridisatie 3 Principe (figuur 1): Onder autochtone staat, een eind-label (CCCTAA) 4 (TELC) oligo probe kan alleen hybridiseren aan het enkelstrengs telomeer G-overhang regio. De hybridisatie intensiteit is evenredig met de lengte van de overhang. Na denaturatie en neutralisatie, zal dezelfde sonde in staat zijn om te hybridiseren met de hele telomeer regio. De hybridisatie intensiteit i…
Discussion
Trypanosoma brucei veroorzaakt slaapziekte bij de mens. Deze ziekte, indien onbehandeld, is onvermijdelijk fataal. T. brucei cellen in zoogdieren gastheren ondergaan antigene variatie regelmatig, zodat de gastheer immuunsysteem aanvallen 7 te ontwijken. Daarom is het erg moeilijk uit te roeien T. brucei cellen zodra een infectie wordt vastgesteld. We hebben onlangs aangetoond dat telomeren een belangrijke rol spelen in de regulatie van de expressie van T. brucei oppervlakte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dr Carolyn Price bedanken voor de wetenschappelijke discussies en inzichtelijke suggesties. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie AI066095 (PI: Bibo Li).