Summary
وصفنا جزيء صغيرة مقرها بروتوكول للتمايز الخلايا الجذعية الجنينية لتصبح خلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs). يولد هذا البروتوكول Olig2 + + NG2 OPCs ذات كفاءة عالية في موعد أقصاه 30 يوما من التمايز. نحن تصف أيضا طريقة لتوليد "التشويك" OPCs النار التي يمكن أن إمكانات العمل.
Abstract
Oligodendrocytes هي الخلايا myelinating النظام العصبي المركزي. لعلاج الخلايا على التجدد في الأمراض المزيل ، هناك اهتمام كبير في اشتقاق النسب السكانية ، نقية من خلايا ملتزمة السلائف oligodendrocyte (OPCs) للزرع. تتميز OPCs عن هذا النشاط من النسخ Olig2 عامل والتعبير سطح NG2 بروتيوغليكان. باستخدام GFP - Olig2 (G - Olig2) الخلية الجذعية الجنينية الماوس (مسك) خط المراسل ، إلى أقصى حد ونحن الظروف لتمايز في mESCs Olig2 + + + OPCs GFP NG2. في بروتوكول لدينا ، ونحن تصف أول جيل من الهيئات مضغي الشكل (EBS) من mESCs. ثانيا ، نحن تصف العلاج من مسك المستمدة EBS مع جزيئات صغيرة : (1) حمض الريتينويك (RA) و (2) القنفذ سونيك purmorphamine ناهض (SHH) (بور) في ظل الظروف المحددة لتوجيه ثقافة التمايز EB في النسب oligodendroglial. هذا النهج ، يمكن الحصول على OPCs ذات كفاءة عالية (> 80 ٪) في فترة زمنية مدتها 30 يوما. الخلايا المشتقة من mESCs في هذا البروتوكول مماثلة لphenotypically OPCs المستمدة من زراعة الأنسجة الابتدائية. ومسك OPCs المشتقة لا تظهر الخاصية التشويك وصف لsubpopulation OPCs من الدماغ في الموقع. لدراسة هذه الخاصية الكهربية ، ونحن تصف توليد MESC التشويك المستمدة OPCs بالإعراب عن ectopically نا
Protocol
إجراءات تفصيلية لتوليد الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) من GFP - Olig2 الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) :
- ويتم شراء خط خلية فأر ES - GFP Olig2 (G - Olig2) ، من مجموعة نوع الثقافة الأميركية (آي تي سي سي). يتم بشكل روتيني passaged mESCs كل 3 أيام على an المشع طبقة الخلايا الليفية الماوس الجنينية المغذية (MEF). ومطلي الخلايا MEF إلى 0.1 ٪ الجيلاتين المغلفة زراعة الأنسجة لمدة ستة جيدا لوحة واحدة على الأقل قبل يوم والركض والمجالس الاقتصادية والاجتماعية. في مستنبت MESC متوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) (GIBCO) تستكمل مع 20 ٪ مصل بقري جنيني (GIBCO) ، 2 مم L - الجلوتامين ، 1 البيروفات الصوديوم ملم ، 0.1 ملم β - المركابتويثانول / ، 1 ٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية ( NEAA) ، وسرطان الدم عامل مثبط 1000 U / مل.
- وزارة التربية والعلم المستعمرات trypsinized (TrypLE ، 5 دقائق ، و 37 درجة مئوية) في الخلايا واحدة وعلقت في المصل خروج المغلوب المتوسطة (KSR) الاستبدال ، ثم يتم نقل الخلايا إلى مرفق منخفضة جدا Costar ستة كذلك لوحة (كورنينج) في خلية كثافة 50000 خلية / سم 2. في ظل هذه الظروف ، mESCs شكل هيئات مضغي الشكل (EBS). KSR المتوسطة ، وتتألف من الحد الأدنى الضروري المتوسطة (- MEM) تستكمل مع KSR 20 ٪ ، 1 البيروفات الصوديوم مم ، NEAA 1 ٪ ، و 0.1 ملي β - المركابتويثانول /.
- من يوم 4 الى يوم 7 ، يتم تضمين حمض الريتينويك (RA ، 0.2 M) وpurmorphamine (بور ، 1 م) كما هو مبين في الشكل. 1A في KSR أو متوسطة N2. المتوسط هو N2 - MEM يحتوي 1X تكملة N2 ، 1 البيروفات الصوديوم مم ، NEAA 1 ٪ ، و 0.1 ملي β - المركابتويثانول /. يتم تغيير المتوسطة اليومية.
- في يوم 8 ، ومصنفة EBS باستخدام TrypLE (5min و 37 درجة مئوية) ومطلي على أطباق polyornithine المغلفة 0.01 ٪ في المتوسط OPC المتوسطة التي تتكون من N2 وعامل نمو الخلايا الليفية - 2 (FGF - 2 ، و 20 نانوغرام / مل). يتم تغيير المتوسطة كل يومين.
- وtrypsinized الخلايا (TrypLE ، 3 دقائق و 37 درجة مئوية) وreplated تقريبا كل اسبوع عندما تصبح متموجة. في يوم 30 ، ما يزيد على 80 ٪ من الخلايا تظهر GFP/Olig2 التعبير وNG2 إيجابية ، سمة من OPCs.
- لتوليد OPCs ارتفاعه ، ونا BacMam + يستخدم عدة قنوات لتقديم نا ت 1.2 الوحيدات في هذه OPCs MESC المشتقة. خلط الكاشف BacMam (1 لتر ، مكون A) مع برنامج تلفزيوني على الحجم النهائي من 5 مل. ثم ، يتم إضافة كاشف BacMam مختلطة في الثقافة المستمدة من OPCs MESC في صحن الثقافة 60 ملم (50-70 ٪ في التقاء) قبل الشطف مع برنامج تلفزيوني. بعد حضانة 2 ساعة ، ويتم إزالة كاشف BacMam المختلطة واستبدالها المتوسطة OPC تستكمل مع محسن 1X. ومحسن هو مكون B تشكيلها في DMSO (العنصر جيم). المقبل ، بعد الاحتضان 2 ساعة إضافية يتم إزالة المتوسطة مع محسن واستبدالها المتوسطة OPC كاملة. ويعاير الخلايا لمدة 24 ساعة في وقت لاحق.
ممثل النتائج :
بعد بروتوكول التمايز هو مبين في الشكل. وعلقت في البداية 1A ، G - Olig2 mESCs في المتوسط وKSR لمدة 4 أيام لتشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) (الشكل 1B). ثم ، ونحن على تعامل بالتسلسل EBS مع التهاب المفاصل الروماتويدي وبور. لم لا تظهر أي EBS مضان GFP في يوم (4) وأعرب قوية في مضان GFP D8 (الشكل 1B). عند هذه النقطة الوقت ، كانت لtrypsinized EBS مطلي والمتوسطة في N2 تستكمل مع عوامل النمو FGF - 2. بعد مزيد من الثقافة لمدة 22 يوما (D30) ، وصلت النسبة المئوية للخلية + GFP 80.3 ± 0.6 ٪ وفقا لنتائجنا التدفق الخلوي. كما هو مبين في الشكل. 1C ، GFP + الخلايا تتداخل مع NG2 تلطيخ باستمرار (96.4 ± 1.3 ٪ من الخلايا GFP كانت إيجابية NG2 إيجابية ، و94.8 ± 1.5 ٪ من الخلايا إيجابية NG2 GFP كانت إيجابية). وبالتالي ، فإن هذه الخلايا وأعرب عن GFP/Olig2 NG2 ، وتعريف عليها كما OPCs.
فشل OPCs MESC المشتقة (76 خلايا) لاطلاق امكانات العمل على إزالة الاستقطاب (الشكل 2A). بعد transducing مع الفيروسة العصوية تحمل ت نا 1.2 الوحيدات ، يمكن تصنيف هذه OPCs MESC المستمدة من (94.1 ٪ ، و 16 من 17 خلايا) وارتفاعه (الشكل 2B).
الشكل 1. تمايز GOlig - MESC OPCs إلى (A) مخطط يبين بروتوكول الجسم مضغي الشكل (EB) والقائم على جزيء صغير يحركها التمايز. في D8 ، وكانت مصنفة في EBS ومطلي. وpassaged الخلايا مرة واحدة في الأسبوع عندما أصبحت متكدسة. (B) D8 ، ولكن ليس D4 EBS ، أظهرت GFP التعبير. (C) وكان من Immunostaining NG2 (الحمراء) بما يتفق مع GFP (الخضراء) في التعبير D30. وقد استخدم دابي (الأزرق) لتحديد النوى. شريط الحجم : 20 ملم.
الشكل 2. جيل من OPCs التشويك من nonspiking MESC المستمدة من فيروس OPCs بوساطة فشل نا التعبير القناة الخامس (أ) عقدت في غشاء المحتملة -60 بالسيارات وOPCs MESC المستمدة من امكانات العمل لاطلاق النار ، حتى عندما كانت الخلية استقطابها إلى 0 MV. (ب) مثال على مسك المستمدة OPCإطلاق إمكانات العمل (الضوء الاحمر) بعد تنبيغ الفيروسية.
Discussion
يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس) ، معزولة عن الجنين الكيسة ، تفرق في جميع الأنساب خلية من خلايا الكائن الحي 3 ، 4 ، وتوفير نظام نموذجي في المختبر لدراسة تطور الثدييات في وقت مبكر ، بما في ذلك مواصفات oligodendrocyte. وقد ثبت mESCs على التمايز إلى خلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs) مع معاملة القنفذ سونيك (SHH) 5. وعلاوة على ذلك ، فإن التمايز OPC SHH التي يسببها من mESCs يحتفظ التوقيت الصحيح لوحظ في التطور الجنيني 6. وبالتالي ، تعتبر طبيعة التمايز في المختبر من OPC mESCs أن تكون متسقة مع ما تم تعلمه من التنمية في الجسم الحي. هنا ، وذلك باستخدام جزيئات صغيرة RA وبور ناهض SHH ، نحن متباينة بنجاح mESCs G - Olig2 في Olig2 + + + OPCs GFP NG2 ذات كفاءة عالية.
OPCs ، والتي تتميز تعبير عن بروتيوغليكان NG2 (7) وعامل النسخ الحلزون ، الحلزون Olig2 حلقة 8 ، تولد oligodendrocytes في الجهاز العصبي المركزي النامية والناضجة ، حيث أنهم يشكلون نسبة كبيرة (~ 5 ٪) من مجموع الخلايا وهما نوع من الخلايا المتكاثرة الرئيسية 9. يتم التعبير عن ما يقرب من عقدين من الزمن الباحثين أظهروا قنوات الصوديوم في الخامس من subpopulation OPCs ويمكن تفعيلها عند الاستقطاب 10 و 11. علاوة على ذلك ، كانت الملاحظة الأخيرة التي ضرب 9 في الوضع الطبيعي في الجهاز العصبي المركزي الفئران المادة البيضاء ، OPCs (~ 50 ٪) ولدت إمكانات العمل عندما استقطابها تبعا للتعبير عن الجهد بوابات الصوديوم (نا V) قنوات ، وبالتالي يمكن تقسيمها الى التشويك وnonspiking المجموعات السكانية الفرعية. ومع ذلك ، فإن مهام هذه الخصائص التشويك لا تزال غير معروفة الى حد كبير. وجدنا أنه electrophysiologically ، ومسك OPCs المستمدة متباينة مع البروتوكول تعتمد SHH ، لم تكن في نفس الموقع OPCs الدماغ. بعد إدخال الوحيدات نا V 1.2 ، وكانت هذه الصامتة MESC المستمدة OPCs قادرة على ارتفاعه.
وبالتالي ، قد التشويك / nonspiking MESC المستمدة OPCs وبروتوكول تمايز الموصوفة هنا يسهل (1) دراسة الفروق الوظيفية بين التشويك وnonspiking OPCs ، (2) عوامل الفرز الجديدة التي يمكن أن تعزز الصوديوم التعبير في قناة مسك OPCs المشتقة ، ( 3) تطوير وتحسين بروتوكول تمايز OPCs ESC من الإنسان أو الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكان في جزء منه دعم هذا العمل عن طريق منح لWD من المعاهد الوطنية للصحة (وRO1 NS059043 ES015988 RO1) ، جمعية التصلب المتعدد الوطنية ، شركة روش مؤسسة البحوث فقر الدم ، فيلدشتاين المؤسسة الطبية ، والمستشفيات Shriners للأطفال.
نود أن نشكر الدكتور ديفيد متعة وجنيفر الطائرة للحصول على اقتراحات. لم نعلن المصالح المتنافسة المتعلقة بهذه المادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
