Summary
Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.
Abstract
Oligodendrocyten zijn de myelinating cellen van het centrale zenuwstelsel. Voor regeneratieve celtherapie bij demyeliniserende ziekten, is er groot belang bij de afleiding van een zuivere populatie van de lijn-vastgelegde oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) voor transplantatie. OPC's worden gekenmerkt door de activiteit van de transcriptiefactor Olig2 en de oppervlakte-expressie van een proteoglycan NG2. Met behulp van de GFP-Olig2 (G-Olig2) muis embryonale stamcellen (Mesc) reporter lijn hebben we optimale condities voor de differentiatie van mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In ons protocol, beschrijven we eerst de generatie van embryoid instanties (EBS) uit mESCs. Ten tweede, beschrijven we de behandeling van Mesc-afgeleide EBS met kleine moleculen: (1) retinoïnezuur (RA) en (2) een sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) onder bepaalde voorwaarden aan cultuur EB differentiatie direct in de oligodendroglia geslacht. Door deze aanpak kunnen OPC's worden verkregen met een hoge efficiëntie (> 80%) in een periode van 30 dagen. Cellen, afkomstig van mESCs in dit protocol zijn fenotypisch gelijk aan OPC's ontleend aan het primaire weefselkweek. De Mesc afgeleide OPC's tonen niet de stekelige woning beschreven voor een subpopulatie van de hersenen OPCs in situ. Om dit te onderzoeken elektrofysiologische woning, beschrijven we de generatie van spiking Mesc-afgeleide OPCs door ectopisch uiten Na
Protocol
Gedetailleerde procedures van het genereren van oligodendrocyt voorloper cellen (OPC) van GFP-Olig2 muis embryonale stamcellen (mESCs):
- Muis ES-cellijn GFP-Olig2 (G-Olig2), wordt gekocht van de American Type Culture Collection (ATCC). De mESCs worden routinematig gepasseerd om de 3 dagen op een bestraald muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-laag. De MEF cellen worden uitgeplaat in 0,1% gelatine beklede zes-well weefselkweek plaat ten minste een dag voor passage van de SER. De Mesc kweekmedium is Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) (GIBCO) aangevuld met 20% foetaal runderserum (GIBCO), 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 0,1 mM β-mercapto-ethanol /, 1% niet-essentiële aminozuren ( NEAA), en 1000 U / ml leukemie remmende factor.
- MES kolonies zijn getrypsiniseerd (TrypLE, 5 min, 37 ° C) in afzonderlijke cellen en gesuspendeerd in knockout serum vervanging (KSR) medium, dan de cellen worden overgebracht naar een Costar ultra-low attachment zes-well plaat (Corning) in een cel dichtheid van 50.000 cellen / cm 2. In deze omstandigheden, mESCs vorm embryoid organen (EBS). KSR medium bestaat uit-minimal essentieel medium (MEM-) aangevuld met 20% KSR, 1 mM natrium pyruvaat, 1% NEAA, en 0,1 mM β-mercapto-ethanol /.
- Vanaf dag 4 tot dag 7, zijn retinoïnezuur (RA, 0,2 M) en purmorphamine (Pur, een M) opgenomen zoals weergegeven in Fig. 1A in KSR of N2 medium. De N2 medium is-MEM bevattende 1X N2 aan te vullen, 1 mM natrium pyruvaat, 1% NEAA, en 0,1 mM β-mercapto-ethanol /. Het medium is veranderd elke dag.
- Op dag 8 worden opgesplitst EBS met TrypLE (5 min, 37 ° C) en uitgeplaat op 0,01% polyornithine-coating gerechten in OPC medium dat bestaat uit N2 middelgrote en fibroblast groeifactor-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Het medium is om de twee dagen.
- De cellen zijn getrypsiniseerd (TrypLE, 3 min, 37 ° C) en opnieuw uitgeplaat ongeveer elke week wanneer ze confluent. Op dag 30, meer dan 80% van de cellen vertonen GFP/Olig2 expressie en zijn NG2-positief, kenmerkend voor OPC's.
- Om spiking OPCs genereren, de BacMam Na + kanaal kit wordt gebruikt om Na v 1.2 subunit te introduceren in deze Mesc afgeleide OPCs. De BacMam reagens (1 ml, component A) wordt gemengd met PBS tot een uiteindelijk volume van 5 ml. Daarna wordt het gemengde BacMam reagens toegevoegd aan Mesc-afgeleide OPCs cultuur in een 60 mm cultuur schaal (bij 50-70% confluentie) voorafgaand aan de spoelen met PBS. Na 2 uur incubatie wordt de gemengde BacMam reagens verwijderd en vervangen door een OPC-medium aangevuld met 1X enhancer. De versterker is de component B opgelost in DMSO (component C). Vervolgens na aanvullende 2-uur incubatie het medium met de versterker wordt verwijderd en vervangen door volledige OPC medium. De cellen zijn 24 uur later getest.
Representatieve resultaten:
Naar aanleiding van de differentiatie protocol getoond in Fig. 1A, G-Olig2 mESCs waren in eerste instantie gesuspendeerd in KSR medium en voor 4 dagen naar embryoid instanties (EBS) (Fig. 1B) te vormen. Dan hebben we achtereenvolgens behandeld de EBS met RA en Pur. De EBS heeft geen GFP fluorescentie niet zien op dag 4 en uitgedrukt sterke GFP fluorescentie bij D8 (Fig. 1B). Op dit tijdstip werden de EBS getrypsiniseerd en uitgeplaat in N2 medium aangevuld met groeifactoren FGF-2. Na een verdere cultuur voor 22 dagen (D30), het percentage van de GFP + cellen bereikt 80,3 ± 0,6% volgens onze flow cytometrie resultaten. Zoals getoond in Fig. 1C, GFP +-cellen overlapt met NG2 vlekken consequent (96,4 ± 1,3% van het GFP positieve cellen werden NG2 positief en 94,8 ± 1,5% van NG2 positieve cellen werden GFP positief). Zo, deze cellen te uiten GFP/Olig2 en NG2, ze te definiëren als OPCs.
De Mesc afgeleide OPC's (76 cellen) niet actiepotentialen vuur op depolarisatie (Fig. 2A). Na transductie met een baculovirus het dragen van de Na v 1.2 subunit, zouden deze Mesc afgeleide OPC's (94,1%, 16 van de 17 cellen) worden aangemerkt als stekelige (Fig. 2B).
Figuur 1. Differentiatie van GOlig-Mesc in OPCs. (A) Regeling met het protocol van de embryoid lichaam (EB)-gebaseerde en kleine molecule-driven differentiatie. Op D8, werden de EBS opgesplitst en uitgeplaat. De cellen werden een keer per week gepasseerd toen zij werden confluent. (B) D8, maar niet D4 EBS, toonde GFP expressie. (C) Immunokleuring van NG2 (rood) in overeenstemming is met GFP (groen) expressie D30. DAPI (blauw) werd gebruikt om de kernen te identificeren. Schaalbalk: 20 mm.
Figuur 2. Generatie van spiking OPC uit nonspiking Mesc-afgeleide OPCs door virus-gemedieerde Na v kanaal expressie. (A) De membraanpotentiaal werd gehouden bij -60 mV en Mesc-afgeleide OPCs niet actiepotentialen vuur, zelfs wanneer de cel werd gedepolariseerd op 0 mV. (B) Een voorbeeld van Mesc-afgeleide OPCvuren actie potentiaal (rood gemarkeerd) na de virale transductie.
Discussion
Embryonale stamcellen (SER), geïsoleerd uit een blastocyst embryo, kunnen differentiëren in alle cellijnen van het organisme 3, 4, die een in vitro model systeem voor het bestuderen van vroege zoogdieren ontwikkeling, met inbegrip oligodendrocyt specificatie. mESCs is aangetoond dat ze in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) onderscheiden met de behandeling van sonic hedgehog (Shh) 5. Bovendien is de Shh-geïnduceerde OPC differentiatie van mESCs behoudt zich het juiste timing waargenomen in de embryonale ontwikkeling 6. Daarom is de aard van de in vitro OPC differentiatie van mESCs beschouwd worden in overeenstemming met wat er is geleerd van in vivo ontwikkeling. Hier, met behulp van de kleine moleculen RA en de Shh agonist Pur, hebben we met succes gedifferentieerde de G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie.
OPCs, gekenmerkt door de uitdrukking van de proteoglycanen NG2 7 en de helix-loop-helix transcriptiefactor Olig2 8, het genereren van oligodendrocyten in de zich ontwikkelende en volwassen CNS, waar ze bestaan uit een aanzienlijk percentage (~ 5%) van de totale cellen en zijn de prolifererende belangrijkste celtype 9. Al bijna twee decennia onderzoekers hebben aangetoond Na V-kanalen worden uitgedrukt in een subpopulatie van OPC's en kan worden geactiveerd bij de depolarisatie 10, 11. Bovendien, een recente opvallende vaststelling was dat in negen in situ rat CNS witte stof, OPC's (~ 50%) actiepotentialen gegenereerd wanneer gedepolariseerd, afhankelijk van de expressie van de voltage-gated natrium (Na V) kanalen, en dus kan worden onderverdeeld in pieken en nonspiking subpopulaties. Echter, de functies van deze spiking eigenschappen zijn nog grotendeels onbekend. Wij vonden dat, elektrofysiologische, de Mesc-afgeleide OPC's onderscheiden met de Shh-afhankelijke protocol, niet hetzelfde als de in situ hersenen OPCs. Na de introductie van subunit Na 1,2 V, deze stille Mesc afgeleide OPC's in staat waren spiking.
Zo kan de stekelige / nonspiking Mesc-afgeleide OPC's en differentiatie protocol hier beschreven te vergemakkelijken (1) studie van de functionele verschillen tussen de pieken en nonspiking OPCs, (2) toetsing van nieuwe factoren die de natriumkanalen uitdrukking zou kunnen bevorderen in de Mesc afgeleide OPCs, ( 3) het ontwikkelen en optimaliseren van de differentiatie protocol van de OPC's van menselijke ESC of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs).
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gesteund door subsidies aan WD van National Institutes of Health (RO1 NS059043 en RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stichting voor Anemie Research, Feldstein Medical Foundation, en de Shriners Hospitals for Children.
We willen graag Dr David Pleasure en Jennifer Plane bedanken voor suggesties. Wij verklaren geen concurrerende belangen met betrekking tot dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
