Summary
Nous décrivons une molécule à base de petites protocole pour la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ce protocole génère Olig2 + NG2 + OPC avec un rendement élevé de 30 jours de différenciation. Nous décrivons également une méthode pour générer des "dopage" OPC qui peut tirer des potentiels d'action.
Abstract
Les oligodendrocytes sont les cellules myélinisantes du système nerveux central. Pour la thérapie cellulaire régénérative dans les maladies démyélinisantes, il ya un intérêt significatif en dérivant une population pure de la lignée de cellules précurseurs commis-oligodendrocytes (OPC) pour la transplantation. Les OPC sont caractérisées par l'activité du facteur de transcription Olig2 et d'expression de surface d'un NG2 protéoglycanes. Utilisation de la GFP-Olig2 (G-Olig2) de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) ligne journaliste, nous avons optimisé les conditions de la différenciation des mESCs en GFP + + Olig2 NG2 + OPC. Dans notre protocole, nous décrivons d'abord la génération des corps embryoïdes (EB) à partir mESCs. Deuxièmement, nous décrivons le traitement des MESC dérivés EBS avec de petites molécules: (1) l'acide rétinoïque (AR) et (2) purmorphamine un hérisson Sonic agoniste (Shh) (Pur), dans des conditions de culture définie pour diriger une différenciation EB dans la lignée oligodendrocyte. Par cette approche, les OPC peuvent être obtenus avec un rendement élevé (> 80%) dans un délai de 30 jours. Les cellules dérivées de mESCs dans ce protocole sont phénotypiquement similaire à OPCs issus de culture de tissus primaires. L'OPC MESC dérivés ne montrent pas la propriété de dopage décrites pour une sous-population des OPC du cerveau in situ. Pour étudier cette propriété électrophysiologique, nous décrivons la génération de dopage MESC dérivé OPC par ectopique exprimer Na
Protocol
Les procédures détaillées de générer des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) de cellules de souris GFP-Olig2 souches embryonnaires (mESCs):
- Ligne de cellules ES de souris GFP-Olig2 (G-Olig2), est acheté à l'American Type Culture Collection (ATCC). Le mESCs sont régulièrement repiquées tous les 3 jours sur un embryon de souris irradiées couche de desserte des fibroblastes (MEF). Les cellules MEF sont étalées dans 0,1% de gélatine enduit de six puits plaque de culture tissulaire au moins un jour avant le repiquage du CES. Le milieu de culture MESC est moyen Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) (Gibco) supplémenté avec 20% sérum de veau fœtal (Gibco), 2 mM L-glutamine, 1 mM pyruvate de sodium, 0,1 mM β-mercaptoéthanol /, 1% acides aminés non essentiels ( NEAA), et 1000 U / ml de facteur inhibiteur de leucémie.
- MES colonies sont trypsinisées (TrypLE, 5 min, 37 ° C) dans des cellules individuelles et suspendu en huitièmes de finale de remplacement (KSR) milieu sans sérum, puis les cellules sont transférées à un Costar ultra-faible attachement à six puits plaque (Corning) à une cellule la densité de 50.000 cellules / cm 2. Dans ces conditions, mESCs forment des corps embryoïdes (EBS). Moyenne se compose de KSR-milieu essentiel minimal (MEM-) complété avec KSR 20%, 1 mM pyruvate de sodium, NEAA 1%, et 0,1 mM β-mercaptoéthanol /.
- Du jour 4 au jour 7, l'acide rétinoïque (RA, 0,2 M) et purmorphamine (Pur, 1 M) sont inclus, comme indiqué dans la Fig. 1A dans KSR ou moyen N2. Le milieu N2 est-MEM contenant complément N2 1X, 1 mM pyruvate de sodium, NEAA 1%, et 0,1 mM β-mercaptoéthanol /. Le milieu est changé tous les jours.
- Au jour 8, EBS sont ventilées en utilisant TrypLE (5min, 37 ° C) et plaqué sur 0,01% polyornithine enduits plats en milieu OPC qui se compose de moyennes et de croissance des fibroblastes N2 facteur-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Le milieu est changé tous les deux jours.
- Les cellules sont trypsinisées (TrypLE, 3 min, 37 ° C) et réétalées environ chaque semaine quand ils deviennent confluentes. A 30 jours, plus de 80% des cellules montrent GFP/Olig2 expression et sont NG2-positif, caractéristique des OPC.
- Pour générer les OPC de dopage, le Na + canal BacMam kit est utilisé pour introduire Na v 1.2 sous-unité dans ces OPC MESC dérivés. Le réactif BacMam (1 ml, composant A) est mélangé avec du PBS pour un volume final de 5 ml. Ensuite, le réactif BacMam mixte est ajouté dans MESC dérivées de la culture OPC dans une boîte de culture de 60 mm (à 50-70% de confluence) avant le rinçage avec du PBS. Après une incubation de 2 h, le réactif BacMam mixte est supprimé et remplacé par du milieu OPC complétée par 1X Enhancer. L'activateur est le composant B reconstitué dans du DMSO (composante C). Ensuite, après 2 heures supplémentaires d'incubation du milieu avec Enhancer est retiré et remplacé par du milieu complet OPC. Les cellules sont analysés 24 heures plus tard.
Les résultats représentatifs:
Après le protocole de différenciation Fig. 1A, G-Olig2 mESCs avaient été suspendus dans le milieu de KSR et pendant 4 jours pour former des corps embryoïdes (EB) (Fig. 1B). Ensuite, nous avons traité de façon séquentielle l'EBS avec AR et Pur. L'EBS n'a pas montré de fluorescence de la GFP au jour 4 et ont exprimé une forte fluorescence de la GFP à J8 (Fig. 1B). A ce point du temps, l'EBS ont été trypsinées et plaqués en milieu N2 complété avec des facteurs de croissance FGF-2. Après une nouvelle culture pour 22 jours (J30), le pourcentage de cellules GFP + a atteint 80,3 ± 0,6%, selon nos résultats de cytométrie en flux. Comme le montre la Fig. 1C, cellules GFP + double emploi avec NG2 coloration constante (96,4 ± 1,3% de cellules GFP-positives ont été NG2 positif, et 94,8 ± 1,5% de cellules positives ont été NG2 GFP-positives). Ainsi, ces cellules expriment GFP/Olig2 et NG2, les définissant comme les OPC.
L'OPC MESC dérivés (76 cellules) a échoué au feu des potentiels d'action sur la dépolarisation (figure 2A). Après transduction avec un baculovirus portant le Na v 1.2 sous-unité, ces OPC MESC dérivés (94,1%, 16 des 17 cellules) pourraient être classés comme enrichissement (figure 2B).
Figure 1. Différenciation des GOlig-MESC dans les OPC. (A) Schéma montrant le protocole du corps embryoïdes (EB) à base de petites molécules et axée sur la différenciation. A J8, l'EBS ont été ventilées et plaqué. Les cellules ont été repiquées une fois par semaine quand ils sont devenus confluentes. (B) D8, mais pas D4 EBS, a montré expression de la GFP. (C) Immunocoloration des NG2 (rouge) est compatible avec la GFP (green) l'expression à J30. DAPI (bleu) a été utilisé pour identifier les noyaux. Barre d'échelle: 20 mm.
Figure 2. Génération d'OPC de dopage à partir nonspiking MESC dérivé OPC par le virus médiée par le canal Na v expression. (A) Le potentiel de membrane a été tenue à -60 mV et MESC dérivé OPC échoué au feu des potentiels d'action, même lorsque la cellule est dépolarisée à 0 mV. (B) Un exemple de MESC dérivé OPCtir potentiel d'action (en rouge) après la transduction virale.
Discussion
Les cellules souches embryonnaires (CSE), isolé à partir d'un embryon de blastocyste, peuvent se différencier en tous les lignées cellulaires de l'organisme 3, 4, fournissant un système modèle in vitro pour étudier le développement précoce des mammifères, y compris la spécification des oligodendrocytes. mESCs a été démontré que de se différencier en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) avec le traitement de Sonic Hedgehog (Shh) 5. Par ailleurs, la différenciation induite par Shh OPC de mESCs conserve la synchronisation correcte observés dans le développement embryonnaire 6. Ainsi, la nature du diagnostic in vitro OPC différenciation par mESCs est considéré comme compatible avec ce qui a été appris de développement in vivo. Ici, en utilisant les petites molécules et la RA Pur agoniste Shh, nous avons réussi à différencier l'mESCs G-Olig2 en GFP + + Olig2 NG2 + OPC avec une grande efficacité.
OPC, caractérisé par l'expression du protéoglycane NG2 7 et le facteur de transcription hélice-boucle-hélice Olig2 8, générer des oligodendrocytes dans le SNC en développement et matures, où ils représentent une proportion importante (~ 5%) du nombre total de cellules et sont les principaux types de cellules proliférantes 9. Pour les chercheurs de près de deux décennies ont démontré Na canaux V sont exprimés dans une sous-population d'OPC et peut être activé à la dépolarisation 10, 11. Par ailleurs, une récente observation frappante est que, dans neuf dans le système nerveux central chez le rat in situ de la matière blanche, les OPC (~ 50%) ont généré des potentiels d'action lors dépolarisée selon l'expression de voltage-dépendants de sodium (Na V) des canaux, et pourrait donc être subdivisé en de dopage et nonspiking sous-populations. Cependant, les fonctions de ces propriétés de dopage sont encore largement inconnus. Nous avons constaté que, électrophysiologique, l'OPC MESC dérivés différenciés avec le protocole Shh-dépendants, ne sont pas les mêmes que l'OPC dans le cerveau in situ. Après l'introduction de la sous-unité Na V 1.2, ces silencieux MESC dérivé OPC étaient capables de dopage.
Ainsi, le dopage / nonspiking MESC dérivé OPC et le protocole de différenciation décrites ici peuvent faciliter (1) étudier les différences fonctionnelles entre dopage et nonspiking OPC, (2) les facteurs de dépistage de nouvelles qui pourraient favoriser l'expression des canaux sodiques dans les OPCs MESC dérivés, ( 3) le développement et l'optimisation du protocole de différenciation des OPC de CSE humaines ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP).
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été en partie soutenu par des subventions à partir de DEO National Institutes of Health (RO1 NS059043 et RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for recherche de l'anémie, Feldstein Fondation médicale, et les Hôpitaux Shriners pour enfants.
Nous tenons à remercier le Dr David Plaisir et Jennifer Avion pour des suggestions. Nous déclarons sans intérêts concurrents liés à cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
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