Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Summary

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Abstract

Spezifikation der Trophektoderm ist eine der frühesten Differenzierung Veranstaltungen von Säugetier-Entwicklung. Der Trophoblast Linie aus dem Trophektoderm vermittelt Implantation abgeleitet und generiert die fetalen Teil der Plazenta. Als Ergebnis ist die Entwicklung dieser Linie wichtig für den Embryo Überleben. Herleitung der Trophoblasten Stammzellen (TS)-Zellen von Maus Blastozysten wurde zuerst von Tanaka beschrieben

Protocol

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Herstellung von Maus-Blastozysten und die Einrichtung von TS-Zelllinien. Allgemeine Maus Manipulationen vor der Sammlung von Blastozysten, einschließlich der Einrichtung für die natürliche Paarung und die Induktion von Super Eisprung folgen grundsätzlich dem Standard-Protokoll von Nagy et al dargestellt. 2003 (pp146-150).

Ableitung und Wartung von TS-Zellen

1. Setup-Zucht Kreuzung zwischen Mäusen von Interesse.
2. Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) als Feeder-Zellen. Zwei Tage vor der Sammlung von Blastozysten, MEFs (2 x 10 ⁶ Zellen) werden in 100 mm-Schalen plattiert. Am nächsten Tag sind diese Zellen mit 10 ml TS-Medium mit Mitomycin C (20 mg / ml) für ein 2-Stunden-Inkubation bei 37 ° C, 5% CO ₂ behandelt. Dies wird durch Waschen der Zellen zweimal mit PBS folgten. Die Mitomycin C behandelten Zellen werden dann in 12-Well-Platten (1 x 10 ⁵ Zellen / well) ausgesät.
3. Am Tag der Blastozyste Sammlung (3,5 dpc, die so genannte Tag), ist MEF Kulturmedium durch TS-Medium plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / well) ersetzt.
4. Vorbereitung für die Sammlung der Gebärmutter: euthanize der Maus, und suchen die Gebärmutter (Abbildung 1A).
5. Entfernen der Gebärmutter, indem Sie es mit einer Pinzette an der Zervix (befindet sich hinter der Blase) und quer durch die Kreuzung der Gebärmutter und des Gebärmutterhalses (Abbildung 1B). Ziehen Sie die Gebärmutter, schneiden Sie die Membran-und Fettgewebe weggeschnitten und der Gebärmutter unter der Kreuzung mit der Eileiter (Abbildung 1C). Legen Sie die uteri (Abb. 1D) in einem kleinen Volumen (0,2 ml) von TS-Medium in einem 60 mm Platte.
6. Flush jedes Uterushorn mit 1 ml TS-Medium unter Verwendung einer 1-ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel in die Basis des Uterus und Flush langsam in eine neue 60 mm-Platte mit 1 ml TS Medium. Die Gebärmutter ist aufgeblasen und voll beim Spülen verlängert.
7. Sammeln und Transfer der Blastozysten vorsichtig in einem sauberen 12-Well-Platte mit TS-Medium mit einer Mund-kontrollierten Pipette. Wash Blastozysten dreimal durch serielle Übertragung durch TS Medium in 12-Well-Platten. Legen Sie eine Blastozyste pro Well (Abbildung 2A) in einer 12-Well-Platte mit der Mitomycin C-behandelten MEF Feeder und Kultur bei 37 ° C, 5% CO _2.
8. Die Blastozysten werden von zona pellucida schlüpfen und heften sich an den Brunnen in 24 bis 36 Stunden. Ein kleiner Auswuchs ohne weiteres an Tag 3 beobachtet werden. Feed the Kulturen mit 500 ul frisch TS-Medium plus 1x FGF4/Heparin.
9. Am Tag 4 oder 5 sollte die Blastozyste Auswuchs bereit sein, für die Aufschlüsselung in Abhängigkeit von ihrer Größe. Die ideale Größe für TS Zelle Disaggregation ist in Abbildung 3B dargestellt. Waschen Sie die Kulturen einmal mit 0,5 ml PBS. Add 100 ml 0,25% Trypsin / EDTA und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO _2. Break the Auswuchs in kleine Klumpen von Auf-und Abpipettieren kräftig mit einem P100 pipetteman. Stoppen Sie die Trypsinierung indem TS-70cm-1.5F4H (30% TS-Medium, 70% MEF-CM plus 1.5x FGF4/Heparin) in den Brunnen. Ändern Medium 8 Stunden nach der Disaggregation und weiterhin Zellen ernähren alle 2 Tage.
10. Zwischen Tag 6 und 10 (sehr variabel) TS Zellkolonien beobachtet werden können. Sie haben flache, epithelialen Blatt Morphologie mit einer klaren Kolonie Grenze (Abbildung 2C). Weiter zu den Kulturen Feed alle 2 Tage
11. Wenn TS-Zellen 50% Konfluenz (in der Regel zwischen den Tagen 15 und 20) zu erreichen, einmal waschen mit PBS und 100 ml 0,25% Trypsin / EDTA. Pipette auf und ab während Trypsinierung zu einem in der Nähe Einzel-Zell-Suspension zu gewährleisten. Stoppen Sie die Trypsinierung indem TS-70cm-1.5F4H und Übertragung auf neue 6-well-oder 60mm-Platten mit der Mitomycin C-behandelten MEF Feeder (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well oder 5 x10 ⁵ cells/60mm Platte).
12. Ändern Medium 8 Stunden nach der Passage und auch weiterhin die Kulturen Feed alle 2 Tage.
13. Nach ein oder zwei weitere Passagen (3-5 Tage zwischen den Kanälen) auf der MEF Speiser, kann TS-Zellen ohne sie kultiviert werden. Da MEFs die Kultur Platte viel schneller als TS-Zellen nach Trypsinierung legen, können solche Unterschiede in der Rate Anhänger genutzt werden, um TS-Zellen aus dem MEF Anleger trennen. Nach dem Passieren der kultivierten Zellen, brüten sie bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 30 min. Die meisten MEFs wird auf die Platte legen und die TS Bevölkerung bleibt in der Schwebe. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Gänge zu einem reinen TS Bevölkerung zu erhalten.
14. Pflegen Sie TS-Zellen in TS-70cm-1.5F4H und geben sie alle 4 Tage (von 1.10 bis 01.20 split) oder wenn die Kultur erreicht 70% Konfluenz. Vorbei an den Zellen mit hoher Dichte (höher als 1:5) oder kultiviert werden, wenn übermäßig konfluenten ihre Differenzierung führen kann.
15. Die Identität des TS-Zellen können durch Immunfärbung eines Zell-Marker, Cdx2 (Abbildung 3) bestätigt werden.

Freezing TS-Zellen

1. Bereiten Sie 2x Einfriermedium (50% FBS, 30% TS mittleren und 20% DMSO).
2. Collect TS-Zellen durch Trypsinierung, durch Zentrifugation bei 450g für 6 min folgte. Resuspendieren sie in TS-Medium mit gleichen Volumen 2x Einfriermedium.
3. Einfrieren der Zellen langsam mit einem Isopropylalkohol Kammer bei -70 ° C und Transfer zum flüssigen Stickstoff nach 24-48 Stunden.
4. A 60 mm-Platte (70% konfluent) ist in der Regel in 2 Fläschchen aufbewahrt.

Auftauen TS-Zellen

1. Schnell Tauwetter das Fläschchen in 37 ° C, sammeln sie in 10 ml TS Medien durch Zentrifugation (450g, 6 min) und Resuspension in 30% TS Medien, 70cm-1.5F4H.
2. Ein Fläschchen von Zellen in einer 60 mm-Platte ausgesät.

TS-Zell-Differenzierung in TGC

Die Differenzierung der TS-Zellen in Trophoblast Riesenzellen (TGCs) kann durch den Abzug der MEF-CM, FGF4 und Heparin induziert werden. Das TGC-Phänotyp (große Kerne) kann vier Tage nach der Induktion nachgewiesen werden (Tanaka et al., 1998 und Chiu et al. 2008). Immunfärbung von p450scc erkennen die Expression dieses TGC Marker in der differenzierten Kultur (Abbildung 4A). Durchflusszytometrische Analyse der PI (Propidiumiodid) gefärbten Zellen zeigt weiter das Vorhandensein von differenzierten Zellen mit höheren DNA-Gehalt (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TS-Zellen Endoreduplikation unterziehen, um polyploiden TGCs geworden.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Dissection der Maus uteri. (A) Lage der Gebärmutter ist durch Pfeile angedeutet. (B) über die Kreuzung der Gebärmutter und des Gebärmutterhalses Cut, wie dargestellt. (C) Cut der Gebärmutter direkt unterhalb der Eileiter (OD) unter dem Fruchtknoten (OV). (D) Bild des Uterus.

Abbildung 2. Representative Bilder illustrieren Maus Blastozyste, Blastozyste Auswuchs und Trophoblast Kolonie. (A) Eine Maus Blastozyste an E3.5 gesammelt wird angezeigt. ICM, innere Zellmasse, MT, Wandmalerei Trophektoderm; PT, polar Trophektoderm. (B) A Trophoblasten Auswuchs am MEF Feeder wird angezeigt. TS, Trophoblast Stammzelle. (C) A Trophoblasten Stammzellen Kolonie zeigt einen klaren Vorsprung am MEF Feeder. Die Pfeile zeigen die Zellgrenze.

Abbildung 3. Identifizierung von TS-Zellen durch Immunfärbung Analyse. TS (AD) und ES (Steuerung, EH)-Zellen unterliegen Marker-Identifizierung. Die Zellen werden mit Antikörpern gegen Oct4 (A, E) oder Cdx2 (B, F) zu erkennen immungefärbt und gegengefärbt von DAPI (C, G) in fusionierten Bildern dargestellt (D, H). Scale-bar, 50 pm.

Abbildung 4. Differenzierung der TS-Zellen in vitro. (A) Undifferenzierte (Undiff) oder differenziert (Diff)-Zellen in Kultur für den Ausdruck einer TGC-Marker untersucht, gegengefärbt p450scc (grün), mit DAPI (rot). (B) Durchflusszytometrische Analyse der differenzierten Zellen mit PI gefärbt, misst den DNA-Gehalt (M1, zwei Minuten vor vier Exemplare; M2, mehr als vier Exemplare). Die M2 Bevölkerung stellt die polyploiden Trophoblastzellen.

Discussion

In diesem Video zeigen wir, den Prozess zu E3.5 Blastozysten aus uteri und experimentellen Verfahren zu sammeln, um TS-Zelllinien zu etablieren. Wir beschreiben auch die Voraussetzung für die Stammzell-Seins der TS-Zellen zu erhalten und deren Differenzierung in differenzierten Zellen zu induzieren. Zwei entscheidende Schritte zur reinen TS-Zelllinien zu erhalten sind das Timing für Auswuchs Disaggregation (Schritt 9) und die Verarbeitung der ersten Passage (Schritt 11). Es wurde berichtet, dass primitive Endoderm-abgeleiteten Zellen können in der Kultur entstehen nach umfangreichen Blastozyste in Schritt 9 oder Überwucherung der TS Kolonien (> 50% Konfluenz) hinauswachsen in Schritt 11 (Kunath et al., 2005). Obwohl primitive Endoderm abgeleitete Zellen, die durch ihre markante Morphologie mit einer abgerundeten Zellform und reduzierte Zell-Zell-Kontakt im Vergleich zu den TS-Zellen identifiziert werden können, ist es schwierig, sie von der Kultur zu entfernen, weil sie gut in der TS-Medium wachsen und nicht scheinen MEF Abzweige oder FGF4 erfordern.

Die differenzierte TGCs kann entstehen ständig in der TS Kultur auch in Gegenwart von MEF-CM und FGF4. Wenn eine reine TS Bevölkerung gewünscht wird, kann diese differenzierten Zellen auf der Grundlage der Differenz Anhänger Raten getrennt werden. Ähnlich wie bei MEFs, TGCs zur Kultur-Platten schneller als TS-Zellen legen, bietet ein Verfahren möglich, eine reine TS Bevölkerung wie in Schritt 13 beschrieben zu erwerben. Alternativ, weil TGCs stark haftenden und widerstandsfähiger gegen Trypsinierung sind, eine reine TS Bevölkerung auch durch schnelle trypisinization (3 min), durch Sammlung der suspendierten TS-Zellen erhalten werden.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).