Summary
निम्न प्रोटोकॉल आभासी टुकड़ा इमेजिंग के लिए अग्नाशय के विच्छेदन की प्रक्रिया की रूपरेखा है, और सभी GFP टैग पूरे अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के बाद मात्रा का ठहराव है.
Abstract
स्वास्थ्य और रोग में विशेष सेल आबादी के परिवर्तन अनुरेखण जैव चिकित्सा अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है. निगरानी अग्नाशय बीटा सेल प्रसार और आइलेट विकास की प्रक्रिया विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है. हम प्रतिदीप्ति टैग ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /) के लिए लिखा मैक्रो के साथ बीटा कोशिकाओं के साथ ट्रांसजेनिक चूहों की अक्षुण्ण अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के वितरण पर कब्जा करने की विधि विकसित किया है. अग्नाशय के विच्छेदन और ऊतक समाशोधन के बाद, पूरे अग्न्याशय एक आभासी टुकड़ा के रूप में कब्जा कर लिया है, जिसके बाद GFP टैग कोशिकाओं बीटा जांच कर रहे हैं. विश्लेषण कुल क्षेत्र बीटा सेल, आइलेट संख्या और प्रत्येक आइलेट के लिए और बीटा कोशिकाओं के छोटे समूहों के लिए विशिष्ट मापदंडों और स्थानों के लिए संदर्भ के साथ आकार वितरण की मात्रा का ठहराव भी शामिल है. islets के पूरे वितरण तीन आयामों में प्लॉट किया जा सकता है, और प्रत्येक आइलेट के आकार और आकार पर वितरण से जानकारी एक नज़र में समग्र क्षेत्र बीटा सेल में परिवर्तन का एक मात्रात्मक और गुणात्मक तुलना की अनुमति देता है.
Protocol
भाग 1: नमूने की तैयारी
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक माउस प्लेस, ग्रहणी और अभी भी जुड़ी हुई तिल्ली के साथ साथ पूरे अग्न्याशय को हटाने, और एक पूर्व तौला गिलास स्लाइड पर अंगों जगह. पक्ष के साथ अपने संयोजी ऊतक में कटौती जहां यह अग्न्याशय के लिए बाध्य है द्वारा ग्रहणी निकालें. कट और प्लीहा और अग्न्याशय पर अतिरिक्त चर्बी को हटाने जब तक अग्न्याशय स्लाइड पर पूरी तरह अलग है. (अग्नाशय वसा अपनी सफेद रंग के रूप में अग्नाशय के ऊतक के रंग थोड़ा गहरा और टान्नर से भेदभाव से अलग पहचाना है.)
- अग्न्याशय इतना है कि यह पूरी तरह से कवर किया जाता है पर, एक coverslip (मानक कवर गिलास 25x75mm बड़े कवर 50x75mm कांच) रखें. एक वजन (उदाहरण के लिए एक भारी किताब) का उपयोग करने के लिए स्लाइड और कवर के बीच अग्न्याशय समतल. वजन पर निर्भर करता है, अग्न्याशय सपाट लगभग पांच मिनट लगते हैं.
- बंद वजन ले लो. यदि अग्न्याशय स्लाइड के खिलाफ अच्छी तरह से चपटा है, 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) में यह जगह. सुबह में, coverslips को हटा दें और अच्छी तरह से दिन के दौरान (6-8 घंटे) पीएफए पूरे अग्न्याशय को बेनकाब. यदि अग्न्याशय अच्छी तरह से तय नहीं है, यह पीएफए में रहने के लिए अब अनुमति है, संभवतः रातोंरात. कंटेनर के लिए 1% के साथ स्लाइड्स स्थानांतरण ट्राइटन फॉस्फेट में x-100 खारा buffered रातोंरात (पीबीएस). अगले दिन, 1-2 दिनों के लिए संतृप्त sucrose के कंटेनर के लिए स्लाइड्स हस्तांतरण. फिर 100% ग्लिसरॉल के एक कंटेनर जब तक ऊतक को मंजूरी दे दी है, जो फ्लोरोसेंट संकेतों के इष्टतम संकल्प के लिए अनुमति देता है के लिए स्लाइड्स का हस्तांतरण, ऊतक समाशोधन लगभग 1-3 दिन लगते हैं. (फ्लोरोसेंट संकेत सप्ताह, और भी महीने के लिए जारी रहती है, लेकिन हो सकता है इमेजिंग जल्द ही किया जाना चाहिए के बाद ऊतक इष्टतम समाधान के लिए मंजूरी दे दी है.)
- एक अंधेरे और शांत क्षेत्र में अग्न्याशय स्टोर क्रम में अंग और उसके फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने.
भाग 2: इमेजिंग और अक्षुण्ण अग्न्याशय में बीटा सेल क्षेत्र बढ़ाता
- संदंश या दस्ताने हाथ का प्रयोग, स्लाइड 100% ग्लिसरॉल के साथ कंटेनर के बाहर ले. अतिरिक्त ग्लिसरॉल पोंछते और विशेष रूप से इथेनॉल के साथ कवर कांच के पीछे सफाई इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार है.
- StereoInvestigator सॉफ्टवेयर (MicroBrightField, Williston, VT) खोलें और इमेजिंग चूहों के लिए 2x उद्देश्य लेंस का चयन करें बड़े गिलास स्लाइड पर 3 सप्ताह से अधिक पुराने pancreata, या 10x उद्देश्य लेंस इमेजिंग चूहों के लिए दो 25mm coverslips के बीच दबाया 3 सप्ताह की तुलना में छोटी pancreata. यह छवि को जीने के लिए (छवि → लाइव छवि) की स्थापना के द्वारा छवि कल्पना. है कि स्पष्ट रूप से GFP टैग बीटा कोशिकाओं से पता चलता है एक जोखिम समय का चयन करें. (छवि Underexposing छोटे islets और बीटा कोशिकाओं शामिल है, जबकि छवि overexposing अतिरिक्त झूठी संकेतों बनाता है.)
- स्क्रीन पर कहीं भी क्लिक करने के लिए एक संदर्भ बिंदु की स्थापना और पूरे अग्न्याशय के चारों ओर एक समोच्च आकर्षित करने के लिए आगे बढ़ना. आभासी स्लाइस (→ छवि आभासी स्लाइस मोल) की प्रक्रिया आरंभ करें. निर्धारित करें और सबसे अच्छा फोकल हवाई जहाज़ यानी, दृश्य और ध्यान केंद्रित ध्यान केंद्रित घुंडी स्क्रॉल द्वारा Z-अक्ष पर और islets बीटा कोशिकाओं की संख्या सबसे ज्यादा के साथ विमान चयन करें. एक बार चुना है, StereoInvestigator स्वचालित रूप से स्क्रीन पर प्रदर्शित छवि captures. Motorized मंच के साथ, आभासी स्लाइस सुविधा sequentially तैयार समोच्च (छवि 1A) के भीतर एक विशिष्ट छवि के रूप में प्रत्येक ऑप्टिकल पैनल कब्जा और फिर एक मर्ज किए गए छवि (छवि 1B) के रूप में उन सभी को जोड़ती है. आभासी स्लाइस इमेजिंग एक epifluorescent विन्यास का उपयोग करता है यानी widefield फिल्टर है कि कैमरा एक निश्चित गहराई में मौजूद सभी संकेतों को ध्यान में पूरी तरह से नहीं उन सहित, पर कब्जा करने के लिए तो यह अनुमति देता है कि अंतिम आभासी स्लाइस एक एकीकृत दो आयामी छवि है कि एक अधिकतम नहीं है है पूरे अग्न्याशय के तीन आयामी पुनर्निर्माण से प्रक्षेपण. औसत आभासी स्लाइस स्कैनिंग समय नमूना प्रति 30 मिनट है, लेकिन एक बड़े अग्न्याशय के लिए एक घंटे के लिए ले जा सकते हैं.
- छवि को सहेजने के बाद, ImageJ के साथ छवि को खोलने के द्वारा अपने विश्लेषण शुरू. जब छवि लोड हो रहा है खत्म है और स्क्रीन पर दिखाई देता है, तो खुला है, और आभासी स्लाइस विश्लेषण मैक्रो ( चलाने के पूरक सामग्री 1).
- कदम दर कदम मैक्रो द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करें. अवांछित "जादू की छड़ी" और "का चयन करें क्षेत्र" उपकरणों के साथ प्रकाश तितर बितर द्वारा बनाई गई कलाकृतियों को हटा दें. छवि से अनावश्यक पृष्ठभूमि की जाँच करें और घटाना. "रेखा" उपकरण के साथ सबसे बड़ी आइलेट की त्रिज्या निर्धारित इतना है कि आगामी रोलिंग गेंद सुविधा को प्रभावी ढंग से autofluorescence और बिखरे हुए प्रकाश निकाल सकते हैं. टेस्ट और सबसे उपयुक्त "कम थ्रेसहोल्ड" का चयन करने के लिए छोटे और islets बीटा कोशिकाओं के समूहों के फ्लोरोसेंट संकेतों पर कब्जा (<3x10 4 2 सुक्ष्ममापी) . टेस्ट और सबसे उपयुक्त "उच्च थ्रेसहोल्ड" islets की फ्लोरोसेंट संकेतों पर कब्जा करने का चयन करें. आभासी स्लाइस की मात्रा का ठहराव है, जो उपाय करेंगे चलाएँऔर आइलेट क्षेत्र, परिधि, घेरा, और Feret व्यास की एक सूची का उत्पादन.
चित्रा 1A आभासी स्लाइस एक अक्षुण्ण वयस्क अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के पूरे वितरण की छवि विश्लेषण
10 सप्ताह में एक पुरुष माउस अग्न्याशय के अलग - अलग ऑप्टिकल पैनलों की छवियाँ एक 2x उद्देश्य के तहत लिया है. छवियों islets की संपूर्ण वितरण भी बीटा कोशिकाओं (<10 कोशिकाओं) के छोटे समूहों में शामिल हैं.
चित्रा 1B आभासी स्लाइस एक अक्षुण्ण वयस्क अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के पूरे वितरण की छवि विश्लेषण
सही और बाईं तरफ के उदर अग्न्याशय पर पृष्ठीय अग्न्याशय के साथ एक एकीकृत आभासी टुकड़ा. स्केल बार 5 मिमी है.
प्रतिनिधि परिणाम
आभासी स्लाइस इमेजिंग के लिए एक अग्न्याशय के प्रवीण तैयारी सभी का एक प्रभावी मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देगा GFP टैग स्पष्ट और विशिष्ट islets के साथ एक आभासी स्लाइस छवि के रूप में एक पूरे अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं. बगल में पूरे अग्न्याशय के सफल आभासी स्लाइस इमेजिंग जांच करने के लिए और बीटा कोशिकाओं, यों न केवल व्यक्तिगत और कुल आइलेट क्षेत्र, लेकिन यह भी आइलेट आकार के वितरण, क्षेत्रीय विश्लेषण, और विकास पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से साधन प्रदान करता है. जबकि ImageJ क्षमता रखता है आभासी स्लाइस छवियों के विश्लेषण में सभी बीटा कोशिकाओं को एक साथ पता लगाने, यह भी जो बीटा कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए कुछ आइलेट आकार (क्षेत्र या व्यास द्वारा) के लिए विश्लेषण सीमित, या स्थान के आधार पर द्वारा यों कर सकते हैं. एक मानक विश्लेषण कलाकृतियों जैसे, एक एकल (<170 2 सुक्ष्ममापी) बीटा सेल रिकॉर्ड और क्षेत्र, परिधि (एक दूरी आसपास के क्षेत्र), घेरा (गोलाई का एक डिग्री है, जहां 1.0 एक संपूर्ण चक्र का प्रतिनिधित्व करता है) की तुलना में छोटे मलबे शामिल नहीं है, और प्रत्येक आइलेट लिए Feret व्यास (एक क्षेत्र के भीतर लंबे समय तक दूरी) का पता चला. आभासी स्लाइस विश्लेषण वाटरशेड विभाजन है, जो अलग है और अलग अतिव्यापी islets उनके आकार के अनुसार अलग - अलग islets में रोजगार के द्वारा आभासी टुकड़ा छवियों को बढ़ाने के लिए सक्षम है. विश्लेषण आगे विस्तृत छवियों की एक श्रृंखला का उत्पादन, इस छवियों के दोनों कम और उच्च तीव्रता (छवि 1C) के तहत मास्क, सभी प्रकल्पित islets की एक रूपरेखा है, जो व्यक्तिगत रूप से गिने और इसी जानकारी की एक तालिका में सूचीबद्ध प्रत्येक (चित्र शामिल हैं ). 1D, और मूल आभासी स्लाइस छवि (छवि 1B). कि संभावित तकनीकी पूर्वाग्रह नोट जब तिरछा कर सकते हैं अहेतुक बड़े ढांचे के आसपास प्रकाश सहित islets की मात्रा का ठहराव, या islets, विशेष रूप से छोटे कणों से अस्पष्ट संकेतों की कुल संख्या को कम करने के द्वारा दहलीज मूल्यों को चुनने.
चित्रा 1C आभासी स्लाइस एक अक्षुण्ण वयस्क अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के पूरे वितरण की छवि विश्लेषण
आभासी टुकड़ा में फ्लोरोसेंट कणों का एक मुखौटा. रंग कोड: [1] नीले रंग: कम तीव्रता प्रतिदीप्ति, [2] हरी: मध्यवर्ती तीव्रता प्रतिदीप्ति, और [3] लाल: उच्च तीव्रता प्रतिदीप्ति.
1D एक अक्षुण्ण वयस्क अग्न्याशय में वर्चुअल स्लाइस बीटा कोशिकाओं के पूरी वितरण की छवि विश्लेषण चित्रा
अलग - अलग islets / बीटा कोशिकाओं के समूहों की मात्रा का ठहराव. ध्यान दें कि प्रत्येक आइलेट (बीटा कोशिकाओं के छोटे समूहों सहित), एक इसी चार्ट में विस्तृत जानकारी के साथ गिने है. चार मापदंडों प्रत्येक संरचना के लिए ले जाया गया: (1) क्षेत्र, (2) परिधि, (3) घेरा: गोलाई का एक डिग्री है जहां 1.0 संख्या एक संपूर्ण चक्र का प्रतिनिधित्व करता है, और (4) Feret व्यास: एक क्षेत्र के भीतर लंबे समय तक दूरी. नोट कि 706 # केवल कुछ बीटा कोशिकाओं का एक क्षेत्र के साथ विश्लेषण संकल्प प्रदर्शित करता है. वाटरशेड विभाजन आसन्न islets के समूहों का पता लगाता है, दिखाया गया है एक जैसे, और उचित उन्हें अलग islets (1554 islets, 1555, और +१,५५६) के रूप में अलग.
चित्रा 1E आभासी स्लाइस एक अक्षुण्ण वयस्क अग्न्याशय में बीटा कोशिकाओं के पूरे वितरण की छवि विश्लेषण
वर्चुअल टुकड़ा विश्लेषण के तीन आयामी क्षेत्र, परिधि, और Feret व्यास के अक्ष के साथ, की साजिश. प्रत्येक डॉट एक छोटा सा टाप का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
और islets बरकरार अग्न्याशय में बीटा सेल समूहों के आभासी स्लाइस छवियों का विश्लेषण islets के पूरे वितरण के एक बड़े पैमाने पर दृश्य प्रदान करता है. विकास और समय पर कुल आइलेट वितरण में परिवर्तन इस प्रकार और अध्ययन किया जा सकता है तुलना में. इस तरह के एक उदाहरण के अग्नाशय आइलेट गठन (1) के हमारे विश्लेषण में प्रदर्शन किया है. विभिन्न समय अंक (P1-p21) में एक नवजात चूहों pancreata के व्यापक विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि islets के विखंडन द्वारा गठित कर रहे हैं. जबकि बीटा सेल प्रसार P1-P10 से एक lognormal प्रायिकता घनत्व समारोह के साथ चूहों में फिट बैठता है, p12 से आगे आइलेट वितरण बाई ओर lognormal पैटर्न से दूर भटक विखंडन की एक प्रक्रिया का सुझाव दे. ऐसा ही एक विश्लेषण चूहों में प्रगतिशील insulinoma, विकास, जो चोटी स्थिति और x-अक्ष के पैमाने के मानकों के साथ एक lognormal समारोह फिट और एक बिजली कानून वितरण (2) पर प्रदर्शन किया गया था: 
पी (एक्स) = कुल्हाड़ी y. डेटा को प्रभावी ढंग से क्षेत्र, परिधि और Feret व्यास (छवि 1E) के तीन आयामी भूखंडों में प्रस्तुत कर रहे हैं. के लिए हमारे अध्ययन, ट्रांसजेनिक चूहों, जिसमें अग्नाशय बीटा कोशिकाओं आनुवंशिक थे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, 3, 4) के साथ टैग, माउस इंसुलिन I प्रमोटर (एमआईपी) के नियंत्रण के तहत इस्तेमाल किया गया. एमआईपी GFP भी भविष्य के अध्ययनों में अन्य विशिष्ट ट्रांसजेनिक चूहों के साथ पार किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अध्ययन के द्वारा समर्थित है अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा डी.के.-081,527 अनुदान, डी.के. - ०,७२,४७३ और शिकागो मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र (पशु मॉडल कोर) के विश्वविद्यालय, और Kovler परिवार फाउंडेशन से एक उपहार के लिए डी.के.-+२०,५९५.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
