Summary
Le protocole suivant décrit le processus de dissection pancréatique pour imagerie en coupes virtuelles, et la quantification ultérieure de tous les GFP-taggés cellules bêta dans le pancréas entier.
Abstract
Traçage des changements de populations de cellules spécifiques dans la santé et la maladie est un objectif important de la recherche biomédicale. Le processus de surveillance du pancréas des cellules bêta des îlots prolifération et la croissance est particulièrement difficile. Nous avons développé une méthode pour capturer la distribution de cellules bêta dans le pancréas intact de souris transgéniques avec fluorescence taggés bêta-cellules avec une macro écrite pour ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Après dissection du pancréas et de compensation des tissus, le pancréas entier est capturé comme une tranche virtuel, après quoi le GFP-taggés bêta-cellules sont examinées. L'analyse inclut la quantification du total des cellules bêta des îlots nombre domaine, et la distribution granulométrique en référence à des paramètres spécifiques et des emplacements pour chaque îlot et des petits amas de cellules bêta. La distribution complète des îlots peuvent être tracées en trois dimensions, et les informations provenant de la distribution de la taille et la forme de chaque îlot permet une comparaison quantitative et qualitative des changements dans l'ensemble des cellules bêta région à un coup d'œil.
Protocol
Partie 1: Préparation des spécimens
- Placez une souris sous un microscope de dissection, retirer tout le pancréas avec le duodénum et la rate encore attaché, et placer les organes sur une lame de verre pré-pesés. Retirez le duodénum en coupant le tissu conjonctif le long du côté où il est lié au pancréas. Couper et enlever la rate et l'excès de graisse sur le pancréas jusqu'à ce que le pancréas est complètement isolée sur la diapositive. (Graisse pancréatique se distingue par sa couleur blanche, comme différencié de la couleur légèrement plus foncée et des tanneurs du tissu pancréatique.)
- Placer une lamelle (couvercle en verre 50x75mm grande; norme couvercle en verre 25x75mm) sur le pancréas afin qu'il soit entièrement recouvert. Utilisez un poids (par exemple, un livre lourd) pour aplatir le pancréas entre la lame et sa couverture. Selon le poids, l'aplatissement du pancréas prend environ cinq minutes.
- Enlever le poids. Si le pancréas est bien plaqué contre la diapositive, placez-la dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) à 4 ° C pendant la nuit. Dans la matinée, retirer les lamelles et bien exposer le pancréas entier à l'IFP au cours de la journée (6-8 heures). Si le pancréas n'est pas bien fixé, lui permettent de rester dans la PFA plus, peut-être une nuit. Placer les lames dans le récipient avec 1% de Triton X-100 dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant la nuit. Le lendemain, le transfert des diapositives sur le contenant du sucrose saturée pendant 1-2 jours. Puis transférez les diapositives dans un conteneur de glycérol 100% jusqu'à ce que le tissu est effacé, ce qui permet la résolution optimale de signaux fluorescents; compensation des tissus prend environ 1-3 jours. (Les signaux fluorescents peuvent persister pendant des semaines, voire des mois, mais l'imagerie doit être réalisée rapidement après que le tissu est effacé pour une résolution optimale.)
- Boutique du pancréas dans un endroit sombre et frais afin de préserver l'orgue et ses signaux fluorescents.
Partie 2: Imagerie et quantification de la zone des cellules bêta dans le pancréas intacts
- L'utilisation de forceps ou les mains gantées, prendre le glisser hors du conteneur avec du glycérol à 100%. Préparer la lame d'imagerie par essuyer l'excès de glycérol et exclusivement de nettoyage à l'arrière du couvercle en verre avec de l'éthanol.
- Ouvrez le logiciel StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) et sélectionnez l'objectif 2x pour les souris imagerie pancréas plus de 3 semaines sur lames de verre de grande taille ou l'objectif 10x pour les souris imagerie pancréas moins de 3 semaines pressée entre deux lamelles de 25mm. Visualisez l'image en réglant c'est de vivre l'image (Image → image en direct). Sélectionner un temps d'exposition qui montre clairement que la GFP-taggés cellules bêta. (Underexposing l'image excluant petits ilôts et des bêta-cellules, tandis que surexposer l'image crée de faux signaux supplémentaires.)
- Cliquez n'importe où sur l'écran pour établir un point de référence et de procéder à dessiner un contour autour du pancréas entier. Initier le processus de Slice (Virtual Image → Acquérir Slice virtuel). Déterminer et sélectionner les meilleurs à savoir le plan focal, l'avion avec le plus grand nombre d'îlots visibles et ciblés et des bêta-cellules sur l'axe Z en faisant défiler le bouton de mise. Une fois choisi, StereoInvestigator capture automatiquement l'image affichée sur l'écran. Avec la platine motorisée, la fonction Slice virtuel capte séquentiellement chaque panneau optique comme une image distincte dans le contour dessiné (fig. 1A), puis combine tous comme une image fusionnée (Fig. 1B). Trancher l'imagerie virtuelle utilise une configuration de filtres à épifluorescence dire grand champ qui permet à l'appareil photo pour capturer tous les signaux présents à une certaine profondeur, y compris ceux qui n'étaient pas parfaitement au point, de sorte que la tranche finale virtuel est intégré à deux dimensions d'image qui n'est pas un maximum projection de la reconstruction en trois dimensions du pancréas entier. Temps moyen virtuel de balayage Slice est de 30 min par échantillon, mais peut prendre jusqu'à une heure pour un pancréas grande.
- Après avoir enregistré l'image, commence son analyse par l'ouverture de l'image avec ImageJ. Lorsque l'image se termine le chargement et s'affiche sur l'écran, ouvrez et exécutez la macro Slice Virtual analyse ( une documentation supplémentaire ).
- Suivez les instructions étape-par-étape fournies par la macro. Éliminer les artefacts indésirables créés par diffusion de la lumière avec le "Magic Wand" et "Select Zone" outils. Vérifiez et soustraire de fond inutiles de l'image. Déterminer le rayon de la plus grande île avec la "Ligne" outil de sorte que la fonction de bal qui a suivi roulant peuvent éliminer efficacement la lumière d'autofluorescence et dispersés. Test et sélectionner le plus approprié de «bas seuil» pour capter les signaux fluorescents de petits îlots et des grappes de cellules bêta (<3x10 4 um 2). Test et sélectionner le plus approprié «seuil haut» pour capter les signaux fluorescents des îlots. Exécutez la quantification de la tranche virtuel, ce qui permettra de mesureret de produire une liste de la zone de l'îlot, le périmètre, la circularité, et le diamètre de Féret.
Figure 1A analyse de l'image virtuelle Tranche de toute la distribution des cellules bêta dans le pancréas adulte une intacts
Images de panneaux individuels optiques d'un pancréas de souris mâles à 10 semaines prises en vertu d'un objectif 2x. Les images incluent la distribution complète des îlots, même de petits amas de cellules bêta (<10 cellules).
Figure 1B analyse virtuelle Slice image de toute la distribution des cellules bêta dans le pancréas adulte une intacts
Une tranche unique virtuel avec le pancréas dorsal sur le droit et le pancréas ventral sur la gauche. La barre d'échelle est de 5 mm.
Les résultats représentatifs
Compétent la préparation d'un pancréas pour l'imagerie virtuelle Slice permettra une quantification efficace de toutes les GFP-taggés cellules bêta du pancréas dans un ensemble comme une image virtuelle Trancher avec des îlots clairs et distincts. Le succès d'imagerie virtuelle Slice du pancréas entier in situ fournit les moyens d'examiner et de quantifier les cellules bêta, non seulement l'îlot espace individuel et au total, mais aussi la distribution de taille des îlots, des analyses régionales, et les schémas de croissance aussi bien. Alors que ImageJ maintient la capacité de détecter toutes les cellules bêta-simultanément dans l'analyse des images virtuelles Slice, il peut également contrôler les cellules bêta afin de quantifier en limitant l'analyse aux tailles des îlots de certains (par zone ou un diamètre), ou par emplacement. Une analyse standard exclut par exemple les artefacts, les débris de moins d'un bêta-cellule unique (<170 um 2) et enregistre la surface, le périmètre (la distance entourant une zone), la circularité (un degré de rondeur, où 1,0 représente un cercle parfait), et le diamètre de Féret (la plus longue distance dans une zone) pour chaque îlot détectée. Trancher l'analyse virtuelle est capable d'améliorer des images virtuelles en employant tranche de la segmentation des bassins versants, ce qui distingue et sépare les îlots qui se chevauchent en îlots individuels en fonction de leurs formes. L'analyse produit en outre une série d'images détaillées, ce qui comprend des masques de l'image sous les deux de basse intensité et haute (Fig. 1C), un aperçu de tous les îlots présumés, qui sont chacun individuellement numérotés et répertoriés dans un tableau d'information correspondant (Fig. . 1D), et l'image virtuelle tranche d'origine (Fig. 1B). Notez que le biais potentiel technique lors du choix des valeurs de seuil peuvent fausser la quantification des îlots de lumière, y compris par les grandes structures environnantes gratuite, ou en réduisant le nombre total d'îlots, les signaux faibles en particulier à partir de petites particules.
Figure 1C analyse de l'image virtuelle Tranche de toute la distribution des cellules bêta dans le pancréas adulte une intacts
Un masque des particules fluorescentes dans la tranche virtuelle. Codes couleur: [1] bleu: faible intensité de fluorescence [2]; vert: la fluorescence d'intensité moyenne, et [3] rouge: la fluorescence de haute intensité.
Figure 1D l'analyse d'image virtuelle Tranche de toute la distribution des cellules bêta dans le pancréas adulte une intacts
Quantification des îlots individuels / groupes de cellules bêta. Notez que chaque îlot (y compris de petits amas de cellules bêta) est numéroté, avec ses informations détaillées dans un tableau correspondant. Quatre paramètres ont été pris pour chaque structure: (1) Zone; (2) du périmètre (3); circularité: un degré de rondeur, où le nombre 1.0 représente un cercle parfait, et (4) de diamètre Féret: la plus longue distance dans une zone. Notez que # 706 affiche la résolution des analyses d'une superficie de seulement quelques cellules bêta. Segmentation du bassin versant détecte groupes d'îlots adjacents, tels que celui illustré, et distingue de façon appropriée les îlots distincts que (îlots 1554, 1555 et 1556).
Figure 1E analyse de l'image virtuelle Tranche de toute la distribution des cellules bêta dans le pancréas adulte une intacts
3-dimensionnel parcelle de l'analyse tranches virtuelles, avec des axes de surface, périmètre, et le diamètre de Féret. Chaque point représente un îlot.
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Discussion
L'analyse des images virtuelles Slice d'îlots et de cellules bêta dans le pancréas grappes intactes offre une vue à grande échelle de toute la distribution des îlots. Évolution et les changements dans la distribution de l'îlot au total au cours du temps peuvent ainsi être étudiées et comparées. Un tel exemple est montré dans notre analyse de la formation des îlots pancréatiques (1). Une analyse complète de pancréas des souris néonatales à des moments différents (P1-P21) a démontré que les îlots sont formés par la fission. Alors que la prolifération des cellules bêta correspond à une fonction de densité de probabilité lognormale chez la souris à partir de P1-P10, P12 de distribution des îlots pancréatiques de partir vers la gauche s'écarte loin du modèle log-normale, suggérant un processus de fission. Une analyse similaire a été réalisée sur le développement progressif de l'insulinome souris, qui équipé d'une fonction lognormale avec les paramètres de la position de pointe et l'axe x échelle, et une distribution en loi de puissance (2): 
P (x) = ax Y. Les données sont effectivement présentés en trois dimensions des parcelles de la zone, le périmètre et le diamètre de Féret (Fig. 1E). Pour notre étude, des souris transgéniques, dans laquelle les cellules bêta pancréatiques ont été génétiquement marqués avec la protéine fluorescente verte (GFP, 3, 4) sous le contrôle de l'insuline de souris, je promoteur (MIP), ont été utilisés. MIP-GFP peut aussi être croisés avec d'autres souris transgéniques spécifiques dans les études futures.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
L'étude est soutenue par l'US Public Health Service Grant DK-081527, 072473 et DK-DK-20595 à l'Université de Chicago recherche sur le diabète et le Centre de Formation (Animal Core Model), et un don de la Fondation de la Famille Kovler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
