In situ Quantifizierung von Pankreas-Beta-Zellmasse in Mäuse

Summary

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess des Pankreas dissection für virtuelle Scheibe Bildgebung, und die anschließende Quantifizierung aller GFP-markierten Beta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Abstract

Tracing Veränderungen spezifischer Zellpopulationen in Gesundheit und Krankheit ist ein wichtiges Ziel der biomedizinischen Forschung. Der Prozess der Überwachung pankreatischen Beta-Zell-Proliferation und Inselchen Wachstum ist eine besondere Herausforderung. Wir haben eine Methode, um die Verteilung von Beta-Zellen im intakten Pankreas transgener Mäuse mit Fluoreszenz-markierten beta-Zellen mit einem Makro für ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /) geschrieben Bildaufzeichnung entwickelt. Nach Pankreas-Dissektion und Gewebe Lichtung, wird die gesamte Bauchspeicheldrüse als virtuelle Scheibe gefangen genommen, nach denen die GFP-markierten beta-Zellen untersucht werden. Die Analyse beinhaltet die Quantifizierung von insgesamt Beta-Zell-Bereich, Inselchen Anzahl und Größenverteilung in Bezug auf bestimmte Parameter und Standorte für jede Insel und für kleine Gruppen von beta-Zellen. Die gesamte Verteilung der Inseln kann in drei Dimensionen dargestellt werden, und die Informationen aus der Verteilung auf die Größe und Form der einzelnen Insel ermöglicht eine quantitative und qualitative Vergleich der Veränderungen in insgesamt Beta-Zell-Bereich auf einen Blick.

Protocol

Teil 1: Vorbereitung der Proben

1. Legen Sie eine Maus unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse zusammen mit dem Zwölffingerdarm und der Milz noch angebracht ist, und legen die Organe auf einem vorher gewogenen Glas gleiten. Entfernen Sie den Zwölffingerdarm, indem es seine Bindegewebe an der Seite, wo es um die Bauchspeicheldrüse gebunden ist. Ausschneiden und Entfernen der Milz und überschüssiges Fett an der Bauchspeicheldrüse, bis die Bauchspeicheldrüse ist komplett auf der Folie isoliert. (Pankreas-Fett zeichnet sich durch seine weiße Farbe, wie aus den etwas dunkleren und Gerber Farbe Pankreasgewebe unterschieden.)
2. Legen Sie ein Deckglas (großen Deckglas 50x75mm; Standard-Deckglas 25x75mm) über die Bauchspeicheldrüse so, dass sie vollständig bedeckt ist. Verwenden Sie ein Gewicht (zB ein schweres Buch), um die Bauchspeicheldrüse zwischen dem Schieber und seine Abdeckung zu glätten. Je nach Gewicht, Abflachung der Bauchspeicheldrüse dauert ca. 5 Minuten.
3. Nehmen Sie das Gewicht. Wenn die Bauchspeicheldrüse ist gut abgeflacht gegen die Folie, legen Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C über Nacht. Am Morgen, entfernen Sie die Deckgläser und gut Setzen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse zu PFA während des Tages (6-8 Stunden). Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht mehr gut fest, damit sie in die PFA länger bleiben, eventuell über Nacht. Die Objektträger in den Behälter mit 1% Triton x-100 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Folien in den Container von gesättigten Saccharose für 1-2 Tage. Übertragen Sie anschließend die Dias in einem Behälter mit 100% Glycerin, bis das Gewebe gelöscht wird, die für die optimale Auflösung der Fluoreszenz-Signale ermöglicht; Gewebe Clearing dauert ca. 1-3 Tage. (Die Fluoreszenz-Signale können über Wochen und sogar Monate andauern, aber Bildgebung sollte bald durchgeführt werden, nachdem das Gewebe für eine optimale Auflösung deaktiviert ist.)
4. Shop der Bauchspeicheldrüse in einem dunklen und kühlen Raum, um das Organ und seine Fluoreszenz-Signale zu erhalten.

Teil 2: Imaging und Quantifizierung der Beta-Zell-Bereich in der intakten Pankreas

1. Mit einer Pinzette oder Handschuhen, nehmen Sie die Folie aus dem Behälter mit 100% Glycerin. Bereiten Sie den Schieber für die Bildgebung durch Wischen Sie überschüssiges Glycerin und ausschließlich der Reinigung der Rückseite des Deckglases mit Ethanol.
2. Öffnen Sie die StereoInvestigator Software (MicroBrightField, Williston, VT) und wählen Sie die 2x Objektiv für die Bildgebung Mäusen Pankreata älter als 3 Wochen auf großen Glasplatten oder 10x Objektiv für die Bildgebung Mäusen Pankreata jünger als 3 Wochen zwischen zwei 25mm Deckgläschen gedrückt. Visualisieren Sie das Bild, indem es auf Bild zu leben (Bild → Live-Bild). Wählen Sie eine Belichtungszeit, die eindeutig zeigt die GFP-markierten beta-Zellen. (Unterbelichtung des Bildes schließt kleinere Inselchen und beta-Zellen, während eine Überbelichtung des Bildes schafft zusätzlichen falsche Signale.)
3. Klicken Sie irgendwo auf dem Bildschirm, um einen Bezugspunkt zu etablieren, und fahren Sie eine Kontur um die gesamte Bauchspeicheldrüse zu ziehen. Starten Sie die virtuelle Scheibe-Prozess (Bild → Acquire Virtuelle Slice). Bestimmen Sie, und wählen Sie die besten Brennebene dh, das Flugzeug mit der höchsten Anzahl der sichtbaren und konzentrierte Inselchen und beta-Zellen auf der Z-Achse durch Scrollen der Fokus-Regler. Einmal gewählt, StereoInvestigator erfasst automatisch das Bild auf dem Bildschirm angezeigt. Mit dem motorisierten Bühne, die Virtual Slice-Funktion sequentiell erfasst jede optische Platte als ein deutliches Bild innerhalb der gezeichneten Kontur (Abb. 1A) und dann verbindet sie alle als eine zusammengefügte Bild (Abb. 1B). Virtuelle Scheiben Bildgebung verwendet eine epifluoreszenten Konfiguration dh Weitfeld-Filter, dass die Kamera auf alle vorhandenen Signale in einer bestimmten Tiefe, darunter diejenigen, die nicht perfekt fokussiert, erfasst werden können, so dass die endgültige virtuelle Scheiben ein integriertes zweidimensionales Bild, das nicht ein Maximum Projektion von der dreidimensionalen Rekonstruktion der gesamten Bauchspeicheldrüse. Durchschnittliche Virtuelle Scheiben Scanzeit beträgt 30 min pro Probe, sondern kann bis zu einer Stunde für eine große Bauchspeicheldrüse.
4. Nach dem Speichern des Bildes beginnt seine Analyse durch die Öffnung des Bildes mit ImageJ. Wenn das Bild vollständig geladen ist und auf dem Bildschirm erscheint, öffnen und starten Sie die virtuelle Scheibe Analyse Makro ( Ergänzende Material 1 ).
5. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Anleitung durch das Makro zur Verfügung gestellt. Beseitigen Sie unerwünschte Artefakte, die durch Lichtstreuung mit dem "Magic Wand" und "Select Area"-Tools erstellt wurden. Überprüfen Sie und ziehen Sie unnötige Hintergrundgeräusche aus dem Bild. Bestimmen Sie den Radius der größten Insel mit dem "Line"-Werkzeug, so dass die anschließende Rolling Ball Feature effektiv entfernen können Autofluoreszenz und Streulicht. Testen Sie, und wählen Sie die am besten geeignete "Low Threshold", um die Fluoreszenz-Signale von kleinen Inseln und Clustern von Beta-Zellen zu erfassen (<3x10 ⁴ um ^2). Testen Sie, und wählen Sie die am besten geeignete "High Threshold", um die Fluoreszenz-Signale von Inselchen zu erfassen. Führen Sie die Quantifizierung der virtuellen Scheibe, die messenund erzeugen eine Liste der Insel Fläche, Umfang, Rundheit und Feret der Durchmesser.

Abbildung 1A Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse
Bilder von einzelnen optischen Platten eines männlichen Maus Bauchspeicheldrüse bei 10-wk unter einem 2x Ziels ergreifen. Die Bilder umfassen die gesamte Verteilung der Inseln, auch kleine Gruppen von Beta-Zellen (<10 Zellen).

Abbildung 1B Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse
Eine einheitliche virtuelle Scheibe mit dem dorsalen Pankreas auf der rechten und der ventralen Pankreas auf der linken Seite. Skala bar beträgt 5 mm.

Repräsentative Ergebnisse

Kompetente Vorbereitung einer Bauchspeicheldrüse für virtuelle Scheiben Bildgebung für eine effektive Quantifizierung aller damit GFP-markierten Beta-Zellen in einer ganzen Bauchspeicheldrüse als virtuelle Scheibe Bild mit klaren und deutlichen Inselchen. Erfolgreiche virtuelle Scheiben Bildgebung des gesamten Pankreas in situ bietet die Möglichkeit zu untersuchen und zu quantifizieren, die beta-Zellen, nicht nur Einzel-und Gesamtkosten Inselchen Bereich, aber auch kleine Insel Größenverteilung, regionale Analyse und Wachstumsmuster auch. Während ImageJ unterhält die Fähigkeit, alle Beta-Zellen gleichzeitig zu erfassen in der Analyse der virtuellen Scheibe Bilder, kann sie auch steuern, welche Beta-Zellen durch die Beschränkung der Analyse auf bestimmte Insel Größen (Flächen-oder Durchmesser), oder nach Standort zu quantifizieren. Eine Standard-Analyse schließt Artefakte wie zB Ablagerungen kleiner als eine einzige Beta-Zelle (<170 um ²⁾ und zeichnet die Fläche, Umfang (der Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo 1,0 stellt einen perfekten Kreis), und Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) für jede Insel entdeckt. Virtuelle Scheiben-Analyse ist in der Lage eine optimierte virtuelle Schnittbilder durch den Einsatz von Watershed Segmentierung, welche und unterscheidet trennt überlappende Inseln in einzelne Inseln nach ihrer Form. Die Analyse weiterer produziert eine Reihe von detaillierten Bildern, dazu gehört auch die Masken der Bilder, die unter niedrigen und hohen Intensität (Abb. 1C), eine Übersicht über alle vermuteten Inseln, die jeweils einzeln nummeriert und aufgelistet in einer Tabelle mit entsprechenden Informationen (Abb. sind . 1D), und die ursprüngliche virtuelle Scheiben Bild (Abb. 1B). Beachten Sie, dass mögliche technische Bias bei der Auswahl Schwellwerte können skew die Quantifizierung der Inseln, indem überflüssige Licht um große Strukturen, oder durch eine Verringerung der Gesamtzahl der Inseln, besonders schwache Signale aus kleinen Partikeln.

Abbildung 1C Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse
Eine Maske der fluoreszierenden Partikel in der virtuellen Scheibe. Farbcodes: [1] blau: niedrige Intensität Fluoreszenz; [2] grün: mittlerer Intensität Fluoreszenz; und [3] rot: hohe Intensität Fluoreszenz.

1D virtuellen Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse
Die Quantifizierung der einzelnen Inseln / Cluster von Beta-Zellen. Beachten Sie, dass jede Insel (einschließlich kleiner Cluster von beta-Zellen) gezählt wird, mit seinen Informationen in ein entsprechendes Diagramm detailliert. Vier Parameter wurden für jede Struktur getroffen: (1) Bereich, (2) Umfang, (3) Zirkularität: ein gewisses Maß an Rundheit, wo die Zahl 1,0 stellt einen perfekten Kreis, und (4) Feret der Durchmesser: die längste Strecke in einem Raum. Beachten Sie, dass # 706 Analysen auflösende Displays mit einer Fläche von nur ein paar Beta-Zellen. Watershed Segmentierung erkennt Gruppen von benachbarten Inseln, wie der gezeigte, und entsprechend unterscheidet sie als getrennte Inseln (Inseln 1554, 1555 und 1556).

Abbildung 1E Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse
3-dimensionale Darstellung der virtuellen Scheibe Analyse, mit Achsen der Fläche, Umfang, und Feret der Durchmesser. Jeder Punkt steht für eine kleine Insel.

Discussion

Die Analyse der virtuellen Scheibe Bilder von Inselchen und Beta-Zell-Clustern im intakten Pankreas stellt eine große Aussicht auf die gesamte Verteilung der Inseln. Entwicklungen und Veränderungen in insgesamt Insel Verteilung im Laufe der Zeit können so untersucht und verglichen werden. Ein solches Beispiel ist in unserer Analyse der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Bildung (1) gezeigt. Eine umfassende Analyse der neugeborenen Mäusen Bauchspeicheldrüsen zu verschiedenen Zeitpunkten (P1-P21) hat gezeigt, dass kleine Inseln durch Spaltung gebildet werden. Während Beta-Zell-Proliferation passt mit einer logarithmischen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion in Mäusen aus P1-P10, weicht Insel Verteilung von P12 weiter nach links weg von der logarithmischen Muster, was auf einen Prozess der Kernspaltung. Eine ähnliche Analyse wurde auf progressive Insulinom Entwicklung in Mäusen, die einer logarithmischen Funktion mit den Parametern der Peak-Position und x-Achsen-Skala ausgestattet, und ein Potenzgesetz Verteilung (2) durchgeführt:



P (x) = ax ^y. Die Daten werden effektiv in dreidimensionale Diagramme der Fläche, Umfang und Feret der Durchmesser (Abb. 1E) vorgestellt. Für unsere Studie, transgene Mäuse, in denen pankreatischen Beta-Zellen genetisch mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP; 3, 4) versehen waren unter der Kontrolle von Maus-Insulin I Promotor (MIP), verwendet wurden. MIP-GFP kann auch mit anderen spezifischen transgenen Mäusen in zukünftigen Studien überquert werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Miltex Inc.
Scissors	F.S.T.	14001-13	01n2
Scissors	F.S.T.	14072-10	02s5
Large glass slide	Electron Microscopy Sciences	71862-01	75x51x1.2mm
Large cover glass	Ted Pella, Inc.	260462	50x75mm
Glass Slide	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0mm
Cover glass	Fisher Scientific	12-458-5M	75x25mm
Cover glass	Erie Scientific		25mm circle
Fluorescent microscope	Olympus Corporation
Dissection microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Jackson Laboratory