Summary
本文介绍了一种发光小鼠原位肝肿瘤的诱导，和随后的分析局限于使用Live全身发光成像的肝肿瘤的生长过程。
Abstract
本视频介绍了建立在小鼠模型可随后由发光成像分析肝转移。诱发局部肝肿瘤肝肿瘤细胞是专门管理，通过动员健脾和分裂成两个，留下完好的血管蒂脾各占一半。组成性表达萤火虫荧光素酶基因（luc1）的Lewis肺癌细胞接种到一个半脾，这是10分钟后，然后切除。其他半脾保持不变，并返回到腹部。可以使用IVIS全身成像系统由生物发光成像监测肝肿瘤的生长。使用IVIS定量成像肿瘤的生长提供了可行的肿瘤细胞的精确定量。减少在发光信号，表明早期肿瘤细胞死亡和坏死由于药物治疗。允许调查转移性肿瘤细胞的生存和发展的内在机制，这种小鼠模型，可用于评价治疗肝转移。
Protocol
简介
肝脏往往是转移性疾病的第一个站点，可能是唯一的站点多达30〜40％的晚期患者的蔓延。然而，用于治疗转移性肝癌肿瘤的选项很少，少数病人适合手术切除和化疗药物的只有23％的主要反应。在这一领域的临床前研究已经有限，没有一个合适的小鼠模型，研究离体肝疾病。我们描述一个分裂脾脏的方法，可以用来可靠地建立统一的，弥漫性肝转移。这一半的脾切除术脾肿瘤的生长和脾脏的另一半是一个完整的门静脉循环，以维持脾脏免疫防护性能返回避免的后果。我们描述的模型是相当简单的执行，并可以通过单一切口迅速。肿瘤细胞株的发光特性，允许在不牺牲动物的治疗反应的准确定量。
协议
一，细胞制备
- 贝科必要的修改液含10％小牛血清，在37 ° C，5％CO 2的 Lewis肺癌细胞生长和trypsinisation时，分，合流收获。
- 细胞计数使用一个Nucleocounter（化学METEC，丹麦）和一个单细胞悬液1 × 10 6细胞200μL无血清媒体准备。
二。鼠标的制备
注：所有程序，由科克大学伦理委员会的批准。在我们的实验室中，我们使用注射麻醉剂，麻醉鼠标，另外，可以使用吸入麻醉药来达到同样的效果。我们使用的小鼠品系无毛米德兰NU / NU哈伦实验室（牛津，英国）获得的应变。在这个实验中，被列入女米德兰NU / nu小鼠，体重16-22克和6-8周龄。其他菌株，如C57和BALB / C也可以使用适当的肿瘤细胞株。
- 交付100ul 1.5毫克氯胺酮和300微克甲苯噻嗪腹腔注射麻醉。
- 用脚趾捏麻醉深度评估。应该没有撤出脚趾捏反射。
- 麻醉鼠标是正确的定位，并在一个加热垫录音。
- 腹部是prepped与10％优碘溶液。
- 腹部手术部位的披在无菌的方式。
三。腹部切口
- 小肋下切口皮肤。
- 切口延长至2-3厘米。
- 腹壁肌肉被划分并进入腹腔。
四。曝光和脾部
- 脾脏是动员和一个预先切开的无菌纱布上，轻轻exteriorized。
- 脾中旬的身体绑在两个4-0薇乔连字。
- 脾脏分为两者之间建立两个半，脾连字。
五，半脾细胞注射
- 27 G是一个半侧脾注入100μL的细胞量。
- 肿瘤细胞被允许流失到肝脏，大部分注入细胞到达肝脏有足够的时间为10分钟。
六。半侧切除脾脏，关腹和恢复
- 注入的半脾切除。
- 其他半脾脏是腹腔。
- 用4-0的PDS使用一个简单的运行针缝合肌肉层封闭。
- 腹部皮肤是用4-0普理灵使用中断针封闭。
- 管理和手术后的镇痛，Carpofen（5毫克/公斤）24小时的手术后管理是通过IP注射液静脉推注。
- 鼠标是允许从麻醉中恢复
七。 IVIS全身生物发光成像
- 鼠标是使用注射麻醉剂麻醉。
- 荧光素底物是由腹腔注射10分钟前成像
- 小鼠被放置在舞台上，3分钟的影像，使用IVIS全身显像系统
- 使用地区利益的工具，可以测量从肝脏的发光
八。暴露小鼠肝
- 鼠标是使用注射麻醉剂麻醉。
- 一个屋顶腹部切口，使可视化体内的肝脏弥漫性转移。
- 鼠标安乐死颈椎脱位，切除肝脏可作进一步的分析。
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图1。新鲜切除的小鼠未经处理和肿瘤浸润肝脏。
图2。IVIS全身显像证明肝肿瘤生长动力学。
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Discussion
可靠的体内研究肝转移模型的发展是越来越重要的新的治疗策略的到来。对于新战略的准确研究，动物模型，应该是比较容易执行，形成的大量转移，涉及转移级联的所有步骤和记者有一个系统，使检测和计数的转移细胞的数量有限。分裂脾脏的方法，所述涉及一个单一的操作，是一个相对容易的技术学习，建立统一的肝 脏弥漫性转移的癌病和门静脉血栓形成1的风险非常低。分为两半，脾脏的脾的分工，使肿瘤细胞注射到一个半侧脾。肿瘤细胞进入门脉循环和旅行到肝脏，模仿转移级联的第一步。注入半脾切除术，避免了脾脏肿瘤的生长和其他半脾的回报，保证了保留脾脏的免疫学特性的动物手术前..这种模式可被用于多种类型的肿瘤。 Lewis肺癌的荧光素酶的细胞株，可随着时间的推移，肝脏疾病的发光定量。提高灵敏度生物发光系统，让少数的转移细胞的检测和定量。这样就可以开始治疗方案精确的计时，并可以在不牺牲动物的肝脏疾病的量化。简易性，耐用性和可重复性，使这种模式适合不同的治疗策略的研究，包括小说化疗2， 基因治疗和免疫1,4。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是通过科克南疗养院维多利亚大学医院乳腺基金，爱尔兰癌症协会（CRI07TAN）和科克癌症研究中心资助。 Lewis肺癌细胞株稳定表达荧光素酶是一个博士样的礼物，卡琳Jooss细胞Genesys公司，美国旧金山。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
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- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
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