Summary
Questo articolo descrive una procedura per l'induzione di tumori al fegato ortotopico bioluminescenti nei topi, e la successiva analisi di crescita del tumore confinato al fegato utilizzando vivere tutto l'imaging luminescenza corpo.
Abstract
Questo video descrive la creazione di metastasi del fegato in un modello murino che può essere successivamente analizzato da immagini bioluminescenti. Le cellule tumorali vengono somministrati appositamente per il fegato per indurre un tumore localizzato al fegato, attraverso la mobilitazione della milza e la divisione in due, lasciando intatto il peduncolo vascolare per ogni metà della milza. Lewis cellule di carcinoma del polmone che esprimono costitutivamente il gene della luciferasi lucciola (luc1) vengono inoculati in un emi-milza che viene poi asportato dopo 10 minuti. L'altro emi-milza viene lasciato integro e restituito all'addome. La crescita del tumore del fegato può essere monitorato l'imaging bioluminescenza utilizzando l'intero IVIS sistema di imaging del corpo. L'imaging quantitativo della crescita tumorale mediante IVIS fornisce quantificazione precisa delle cellule tumorali vitali. La morte delle cellule tumorali e la necrosi a causa di un trattamento farmacologico è indicato all'inizio di una riduzione del segnale bioluminescente. Questo modello del mouse permette di indagare i meccanismi alla base del tumore metastatico delle cellule di sopravvivenza e di crescita e può essere utilizzato per la valutazione delle terapie delle metastasi epatiche.
Protocol
Introduzione
Il fegato è spesso il primo sito di malattia metastatica e può essere l'unico sito di diffusione in circa il 30 40% dei pazienti con malattia avanzata. Tuttavia le opzioni per il trattamento di tumori epatici metastatici sono pochi con una minoranza di pazienti idonei per la resezione e solo il 23% responder importante per chemioterapici. Ricerca pre-clinica in questo campo è stata limitata dall'assenza di un modello murino adatto per studiare le malattie del fegato isolato. Descriviamo uno split-milza approccio che può essere usato per stabilire in modo sicuro uniforme, metastasi epatiche diffuse. Resezione di questa metà della milza evita le conseguenze della crescita del tumore della milza e l'altra metà della milza viene restituito con una circolazione portale per mantenere intatto splenica proprietà immunitarie protettive. Il modello che abbiamo descritto è abbastanza semplice da eseguire e può essere effettuata rapidamente attraverso una singola incisione. Le proprietà bioluminescenti della linea di cellule tumorali consente la quantificazione accurata della risposta al trattamento senza sacrificio di animali.
Protocollo
I. Preparazione cellulare
- Lewis cellule di carcinoma del polmone sono cresciuti mezzo modificato Essential Dulbecco supplementato con 10% siero di vitello fetale a 37 ° C, 5% di CO 2 e raccolte trypsinisation quando sub-confluenti.
- Le cellule sono state contate utilizzando un NucleoCounter (chemio-metec, Danimarca) e una sospensione singola cella di 1 x 10 6 cellule in 200 microlitri è stato preparato nel siero media liberi.
II. Preparazione del mouse
Nota: Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico della University College Cork. Nel nostro laboratorio usiamo anestetici iniettabili per anestetizzare il mouse, in alternativa, si può usare anestetici inalatori per ottenere lo stesso effetto. Il ceppo di topi che abbiamo usato è il glabro MF1 nu / nu ceppo ottenuti da laboratori di Harlan (Oxfordshire, Inghilterra). Femmina MF1 nu / nu topi pesa 16-22 grammi e di 6-8 settimane di età sono stati inclusi in questo esperimento. Altri ceppi, come la C57 e Balb / c può essere utilizzato anche con le linee appropriato delle cellule tumorali.
- L'anestesia è stata consegnata mediante iniezione intraperitoneale di 100ul di 1,5 mg di ketamina e 300 xylazina ug.
- La profondità di anestesia viene valutata usando un pizzico piedi. Non ci dovrebbero essere riflesso ritiro con pizzico punta.
- Il mouse è posizionato correttamente anestetizzato e registrato su una piastra elettrica.
- L'addome viene preparato con una soluzione di Betadine al 10%.
- Dell'addome e del sito chirurgico sono drappeggiati in modo sterile.
III. Incisione addominale
- Una piccola incisione sottocostale è realizzata in pelle.
- L'incisione è estesa a 2-3 cm.
- La muscolatura della parete addominale sono stati divisi e la cavità peritoneale è entrato.
IV. L'esposizione e la Divisione di Milza
- La milza è mobilitato e delicatamente esteriorizzata in un pre-tagliati garza sterile.
- Due legature Vicryl 4-0 sono legate intorno al corpo a metà della milza.
- Milza è diviso tra le due legature creando due emi-milza.
V. iniezione di cellule nel Hemi-milza
- A 27 G è usato per iniettare un volume di 100 l di cellule in un semi-milza.
- Le cellule tumorali sono autorizzati a drenare il fegato per dieci minuti fornendo un tempo sufficiente per la maggior parte delle cellule iniettate per raggiungere il fegato.
VI. Asportazione di milza-Hemi, la chiusura addominale e recupero
- Il iniettato emi-milza è escisse.
- L'altro emi-milza viene restituito alla cavità addominale.
- Lo strato muscolare è chiuso con 4-0 sutura PDS utilizzando un punto semplice esecuzione.
- La pelle dell'addome è chiusa con Prolene 4-0 con punti di sutura interrotta.
- Liquido viene somministrato in bolo e analgesia post-operatoria, Carpofen (5 mg / kg) viene somministrato mediante iniezione IP per 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Il mouse è permesso di recuperare da anestesia
VII. IVIS tutto il corpo Bioluminescent Imaging
- Mouse è anestetizzato con iniettabili anestetico.
- Substrato luciferina è dato da iniezione intra-peritoneale dieci minuti prima di imaging
- I topi sono immessi sul palco e ripreso per 3 minuti utilizzando IVIS intero sistema di imaging del corpo
- Luminescenza dal fegato può essere misurato utilizzando una regione di strumento di interesse
VIII. Esposizione di fegato di topo
- Mouse è anestetizzato con iniettabili anestetico.
- Un tetto incisione addominale permette la visualizzazione di metastasi epatiche diffuse in vivo.
- Il mouse è eutanasia da dislocazione del collo dell'utero e del fegato può essere asportato per ulteriori analisi.
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Figura 1. Fresco non trattato asportato murini e tumore fegato infiltrato.
Figura 2. Cinetica di crescita del tumore epatico come dimostra l'imaging IVIS corpo intero.
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Discussion
Lo sviluppo di affidabili modelli in vivo per lo studio delle metastasi al fegato sta diventando sempre più importante con l'avvento di nuove strategie terapeutiche. Per lo studio accurato di nuove strategie, modelli animali dovrebbe essere relativamente facile da eseguire, formare un numero significativo di metastasi, coinvolgere tutte le fasi della cascata metastatica e hanno un sistema giornalista che consente il rilevamento e il conteggio di un numero limitato di cellule metastatiche. Split-milza approccio descritto avviene una volta sola ed è una tecnica relativamente facile da imparare per stabilire uniforme metastasi diffuse al fegato con un rischio molto basso di carcinosi e la trombosi della vena porta 1. La divisione della milza in due emi-milza permettono l'iniezione di cellule tumorali in un semi-milza. Le cellule tumorali entrano nella circolazione portale e viaggi al fegato, imitando il primo passo della cascata metastatica. Escissione del iniettato emi-milza evita la crescita di un tumore della milza e il ritorno degli altri emi-milza assicura il mantenimento della proprietà immunologiche della milza, che l'animale aveva prima della procedura .. Questo modello può essere utilizzato per una varietà di tipi di tumore. La linea del polmone Lewis luciferasi cellulare consente la quantificazione bioluminescente della malattia epatica nel tempo. La maggiore sensibilità del sistema di bioluminescenza permette l'individuazione e la quantificazione di un piccolo numero di cellule metastatiche. Questo permette tempistica precisa per l'avvio di protocolli di trattamento e consente la quantificazione delle malattie del fegato, senza sacrificio dell'animale. La semplicità, la durata e la riproducibilità rendono questo modello adatto per lo studio di strategie di trattamento diverse tra romanzo chemioterapici 2, terapia genica 3 e 1,4 immunoterapia.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato attraverso il Cork Sud Infermeria fondo Victoria University Hospital con il seno, il Cancer Society irlandese (CRI07TAN) e il Cancer Centre Cork Research. Linea del polmone Lewis cellule che esprimono stabilmente luciferasi è stato un gentile dono del Dr. Karin Jooss, Cell Genesys, Inc., San Francisco, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
