Murina Bioluminescent Nedsatt tumör Modell

Summary

I artikeln beskrivs ett förfarande för induktion av orthotopic självlysande levertumörer hos möss, och efterföljande analys av tumörtillväxt begränsade till levern använder levande hela imaging kroppen luminiscens.

Abstract

Denna video beskriver upprättandet av metastaser i levern i en musmodell som senare kan analyseras med självlysande avbildning. Tumörceller ges specifikt till levern för att inducera en lokal levertumör, genom mobilisering av mjälten och delas upp i två, lämnar intakt vaskulära BLOMSTJÄLK för varje halva av mjälte. Lewis lungcancer celler som konstitutivt uttryck för Firefly luciferas genen (luc1) är inokuleras i en hemi-mjälte som sedan opererande 10 minuter senare. Den andra hemi-mjälten är kvar intakt och återvände till buken. Lever tumörtillväxt kan övervakas av mareld avbildning med IVIS hela systemet kropp avbildning. Kvantitativa avbildning av tumörtillväxt med IVIS ger exakt kvantifiering av livskraftiga tumörceller. Tumör celldöd och nekros på grund av läkemedelsbehandling är indicerad tidigt av en minskning av den självlysande signalen. Denna musmodell gör för att undersöka mekanismerna bakom metastaserande tumör-cell överlevnad och tillväxt och kan användas för utvärdering av läkemedel av levermetastaser.

Protocol

Inledning

Levern är ofta den första platsen för metastaserad sjukdom och kan vara den enda platsen för spridning i så många som 30 40% av patienter med avancerad sjukdom. Men alternativ för behandling av metastaserande levertumörer är få med en minoritet av patienterna som lämpar sig för resektion och bara 23% större som svarade på kemoterapi. Prekliniska forskningen inom detta område har begränsats av bristen på en lämplig musmodell för att studera isolerade leversjukdom. Vi beskriver en delad mjälte metod som kan användas för att tillförlitligt fastställa enhetliga, diffusa levermetastaser. Resektion av hälften av mjälten undviker konsekvenserna av mjälten tumörtillväxt och den andra hälften av mjälten är tillbaka med ett intakt portal cirkulation att behålla mjälten immun skyddande egenskaper. Den modell vi beskriver är ganska enkel att utföra och kan göras snabbt genom ett enda snitt. Den självlysande egenskaper tumör cellinje låter exakt kvantifiering av behandlingssvar utan offer av djur.

Protokoll

I. cellberedningen

1. Lewis lungcancer celler odlas Dulbecco ändrade Essential Medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum vid 37 ° C, 5% CO ₂ och skördas av trypsinisation när sub-konfluenta.
2. Cellerna räknades med hjälp av en Nucleocounter (Chemo-metec, Danmark) och en enda cellsuspension på 1 x 10 ⁶ celler i 200 l har upprättats i serum fria medier.

II. Mus Förberedelser

Notera: Alla förfaranden godkändes av den etiska kommittén vid University College Cork. I vårt laboratorium använder vi Injektionsanestetika att söva musen, alternativt kan man använda inhalationsanestetika att uppnå samma effekt. Den musstam vi använde den hårlösa MF1 nu / nu stam från Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). Kvinna MF1 nu / nu möss som väger 16-22 g och med 6-8 veckors ålder inkluderades i detta experiment. Andra stammar som t.ex. C57 och BALB / c kan också användas med lämplig tumörcellinjer.

1. Anestesi levererades av intraperitoneal injektion av 100ul på 1,5 mg ketamin och 300 ug xylazin.
2. Djupet av anestesi bedöms med hjälp av tå nypa. Det bör inte vara tillbakadragande reflex med tå nypa.
3. Den sövda mus är korrekt placerad och tejpade över en värmedyna.
4. Buken är förberedd med en 10% Betadine lösning.
5. Buken och operationsområdet är draperad i ett sterilt sätt.

III. Buksnitt

1. En liten subcostal snitt görs i huden.
2. Snittet utökas till 2-3 cm.
3. Bukväggen muskulatur delades och bukhålan in.

IV. Exponering och Avdelningen för mjälte

1. Mjälten är mobiliserade och försiktigt exteriorized på färdigskurna steril gasbinda.
2. Två 4-0 vicryl ligaturer knyts runt mitten av kroppen av mjälte.
3. Spleen är uppdelat mellan de två ligaturer skapa två hemi-mjälte.

V. Injektion av celler i Hemi-mjälten

1. En 27 G används för att injicera en 100 mikroliter volym av celler till en hemi-mjälte.
2. Tumörceller får rinna till levern i tio minuter att ge tillräcklig tid för majoriteten av de injicerade cellerna att nå levern.

VI. Excision av Hemi-mjälte, buken stängning och återställning

1. Den injicerade hemi-mjälten är censurerade.
2. Den andra hemi-mjälten är tillbaka till bukhålan.
3. Muskeln lagret stängs med 4-0 PDS sutur med en enkel rakstygn.
4. Den bukhuden stängs med 4-0 Prolene med avbruten stygn.
5. Fluid bolus administreras och postoperativ smärtlindring, Carpofen (5 mg / kg) administreras av IP injektion i 24 timmar efter operation.
6. Musen är tillåtet att återhämta sig från anestesi

VII. IVIS Whole Body Bioluminescent Imaging

1. Musen är sövda med injicerbart bedövningsmedel.
2. Luciferin substrat ges av intraperitonealt injektion tio minuter innan bildbehandling
3. Möss är placerade på scenen och avbildade i 3 min hjälp IVIS Hela systemet kroppens avbildning
4. Luminiscens från levern kan mätas med en region av intresse verktyg

VIII. Exponering av möss lever

1. Musen är sövda med injicerbart bedövningsmedel.
2. En takterrass buksnitt tillåter visualisering av diffusa levermetastaser in vivo.
3. Musen är avlivades av halsdislokation och levern kan vara utskurna för vidare analys.

_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Färskt censurerade murina obehandlade och tumör-infiltrerade lever.

Figur 2. Kinetik av nedsatt tumörtillväxt vilket framgår av IVIS hela kroppen avbildning.

Discussion

Utvecklingen av tillförlitliga in vivo-modeller för studier av levermetastaser blir allt viktigare med tillkomsten av nya terapeutiska strategier. För noggrann studie av nya strategier bör djurmodeller vara relativt lätt att utföra, utgör ett betydande antal metastaser, omfatta alla stegen i metastaserande kaskad och har en reporter som gör det möjligt att upptäcka och räkning av ett begränsat antal metastaserande celler. Uppdelningen-mjälte tillvägagångssätt som beskrivs görs en enda gång och är en relativt enkel teknik för att lära sig att skapa enhetliga diffusa levermetastaser med en mycket låg risk för karcinomatos och portal ventrombos ^1. Uppdelningen av mjälte i två hemi-mjälte tillåter injektion av tumörceller i en hemi-mjälte. Tumörceller in i portalen cirkulationen och resor till levern, imitera det första steget av metastaserande kaskad. Excision av det injicerade hemi-mjälten undviker tillväxten av en mjälten tumör och återlämnande av andra hemi-mjälten säkerställer bevarande av mjälten immunologiska egenskaper som djuret hade före ingreppet .. Denna modell kan utnyttjas för olika tumörtyper. Den Lewis lungan luciferas cellinje gör den självlysande kvantifiering av leversjukdom över tiden. Den förbättrade känslighet mareld systemet tillåter detektion och kvantifiering av ett litet antal metastaserande celler. Detta möjliggör exakt tidpunkt för start av behandling protokoll och möjliggör kvantifiering av leversjukdom utan offer av djuret. Den enkelhet, hållbarhet och reproducerbarhet gör denna modell lämplig för studier av olika behandlingsstrategier, inklusive nya kemoterapeutika ^2, genterapi ³ och ^1,4 immunterapi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc