Murine Bioluminescent Leber Tumor-Modell

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Induktion der orthotopen Biolumineszenz Lebertumore bei Mäusen, und die anschließende Analyse des Tumorwachstums beschränkt sich auf die Leber mit Live-Ganzkörper-Lumineszenz-Imaging.

Abstract

Dieses Video beschreibt die Einrichtung von Lebermetastasen in einem Mausmodell, die anschließend durch Biolumineszenz Imaging analysiert werden können. Tumorzellen sind speziell auf die Leber, um eine lokalisierte Lebertumor induzieren, über die Mobilisierung der Milz und eine Aufspaltung in zwei, intakt gelassen den Gefäßstiel für jede Hälfte der Milz. Lewis Lungenkarzinom-Zellen, die konstitutiv das Luciferase-Gen (luc1) sind in einem Hemi-Milz, die dann reseziert wird 10 Minuten später geimpft. Die anderen Hemi-Milz ist intakt gelassen und kehrte auf den Bauch. Liver Tumorwachstum kann durch Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Ganzkörperbildgebungssysteme System überwacht werden. Quantitative Bildgebung des Tumorwachstums mit IVIS bietet eine präzise Quantifizierung der vitalen Tumorzellen. Tumor Zelltod und Nekrose durch medikamentöse Behandlung ist eine frühzeitige durch eine Reduktion der Biolumineszenz-Signal angezeigt. Dieses Mausmodell ermöglicht die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen metastasierten Tumor-Zell-Überleben und Wachstum und kann für die Evaluierung von Therapeutika von Lebermetastasen eingesetzt werden.

Protocol

Einführung

Die Leber ist oft der erste Ort der Metastasen und kann der einzige Ort der Ausbreitung in nicht weniger als 30 40% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung sein. Allerdings Optionen zur Behandlung von metastasierenden Tumoren der Leber sind nur wenige mit einer Minderheit der Patienten für Resektion und nur 23% größeren Responder Chemotherapeutika. Präklinische Forschung in diesem Bereich durch das Fehlen eines geeigneten Mausmodell zu isolieren Lebererkrankung Studie beschränkt. Wir beschreiben eine Split-Milz-Ansatz, mit dem zuverlässig einheitliche, diffuse Lebermetastasen werden kann. Resektion von dieser Hälfte der Milz verhindert die Folgen der Milztumor Wachstum und die andere Hälfte der Milz ist mit einem intakten Pfortaderkreislauf zur Milz Immunsystem schützenden Eigenschaften halten zurückgegeben. Das Modell, das wir beschreiben, ist ziemlich einfach durchzuführen und kann schnell durch einen einzigen Schnitt gemacht werden. Die Biolumineszenz Eigenschaften des Tumor-Zelllinie erlaubt eine genaue Quantifizierung Ansprechen auf die Behandlung ohne Tieropfer.

Protokoll

I. Cell Preparation

1. Lewis Lungenkarzinom-Zellen sind Dulbecco Modified Essential Medium mit 10% fötalem Kälberserum bei 37 ergänzt ° C, 5% CO ₂ angebaut und geerntet durch Trypsinierung bei sub-konfluenten.
2. Die Zellen wurden gezählt mit einem NucleoCounter (Chemo-metec, Dänemark) und eine einzelne Zelle Suspension von 1 x 10 ⁶ Zellen in 200 ul wurde in serumfreien Medien vorbereitet.

II. Maus Vorbereitung

Hinweis: Alle Arbeiten wurden von der Ethikkommission des University College Cork genehmigt. In unserem Labor verwenden wir Injektionsnarkosemittel, um die Maus zu betäuben, alternativ kann man Inhalationsanästhetika zu verwenden, um denselben Effekt zu erzielen. Die Maus-Stamm verwendeten wir die haarlose MF1 nu / nu-Stamm von Harlan Laboratories (Oxfordshire, England) gewonnen. Weibliche MF1 nu / nu Mäuse mit einem Gewicht 16-22 g und von 6-8 Wochen alt waren in diesem Experiment einbezogen. Andere Stämme wie die C57-und Balb / c kann auch mit geeigneten Tumor-Zelllinien verwendet werden.

1. Anästhesie wurde durch intraperitoneale Injektion von 100 ul von 1,5 mg Ketamin und 300 ug Xylazin geliefert.
2. Die Narkosetiefe wird anhand Zehen klemmen. Es sollte kein Rückzug Reflex mit toe Prise werden.
3. Die narkotisierten Maus richtig positioniert ist und mit Klebeband über ein Heizkissen.
4. Der Bauch ist mit einem 10% betadine Lösung vorbereitet.
5. Die Bauch-und OP-Gebiet sind in einer sterilen Mode drapiert.

III. Bauchschnitt

1. Eine kleine subkostalen Einschnitt in die Haut gemacht.
2. Der Schnitt wird um 2-3 cm verlängert.
3. Die Bauchwandmuskulatur wurden geteilt und Bauchhöhle getreten.

IV. Belichtung und Division of Spleen

1. Die Milz ist mobilisiert und sanft exteriorisierten auf einem vorgestanzten steriler Gaze.
2. Zwei 4-0 Vicryl Ligaturen um die Mitte des Körpers der Milz gebunden.
3. Milz ist zwischen den beiden Ligaturen die Schaffung von zwei hemi-Milzen unterteilt.

V. Injektion von Zellen in die Hemi-Milz

1. A 27 G wird benutzt, um eine 100-ul-Volumen von Zellen in einem Hemi-Milz zu injizieren.
2. Tumorzellen sind zulässig, um die Leber für 10 Minuten eine ausreichende Zeit für die Mehrheit der injizierten Zellen in die Leber gelangen abtropfen lassen.

VI. Exzision von Hemi-Milz-, Viszeral-Verschluss und Wiederherstellung

1. Die injizierten Hemi-Milz herausgeschnitten wird.
2. Die anderen Hemi-Milz ist in die Bauchhöhle zurück.
3. Die Muskelschicht ist mit 4-0 PDS Naht mit einem einfachen Laufstich geschlossen.
4. Die Bauchhaut wird mit 4-0 Prolene mit unterbrochenen Nähten verschlossen.
5. Fluid-Bolus verabreicht und postoperativen Analgesie, Carpofen (5 mg / kg) ist durch ip-Injektion für 24 h nach der Operation verabreicht wird.
6. Die Maus ist erlaubt, aus der Narkose erholen

VII. IVIS Whole Body Imaging Bioluminescent

1. Die Maus ist betäubt mit injizierbaren Betäubung.
2. Luciferin-Substrat wird durch intra-peritoneale Injektion 10 Minuten vor dem Imaging gegeben
3. Mäuse sind auf der Bühne platziert und bebildert für 3 min mit IVIS Ganzkörper-Imaging-System
4. Lumineszenz aus der Leber lassen sich mit einem region of interest-Tool werden

VIII. Die Exposition von Mausleber

1. Die Maus ist betäubt mit injizierbaren Betäubung.
2. Ein Dach Bauchschnitt ermöglicht die Visualisierung der diffuse Lebermetastasen in vivo.
3. Die Maus ist durch Genickbruch getötet und die Leber kann zur weiteren Analyse ausgeschnitten werden.

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Abbildung 1. Frisch herausgeschnitten murine unbehandelt und Tumor-infiltrierte Leber.

Abbildung 2. Kinetik der Leber Tumorwachstum durch IVIS Ganzkörperbildgebungssysteme belegt.

Discussion

Die Entwicklung von In-vivo-Modelle für die Untersuchung von Lebermetastasen wird immer steigt mit dem Aufkommen von neuen therapeutischen Strategien wichtig. Für die genaue Untersuchung von neuen Strategien, Tiermodelle sollte relativ einfach durchzuführen, bilden eine bedeutende Anzahl von Metastasen, beinhalten alle Schritte der metastatischen Kaskade und ein Reporter-System, das Erfassen und Zählen von einer begrenzten Anzahl von metastatischen Zellen ermöglicht. Die Split-Milz-Ansatz wie beschrieben über einen einzigen Betrieb und ist eine relativ einfache Technik zu erlernen, um eine einheitliche diffuse Lebermetastasen mit einem sehr geringen Risiko von Karzinomatose und Pfortaderthrombose ^{1 zu} begründen. Die Aufteilung der Milz in zwei Hemi-Milzen ermöglichen die Injektion von Tumorzellen in einem Hemi-Milz. Tumorzellen geben den Pfortaderkreislauf und Reisen in die Leber, imitiert den ersten Schritt der metastatischen Kaskade. Excision der injizierten Hemi-Milz verhindert das Wachstum eines Milztumor und die Rückkehr der anderen Hemi-Milz sorgt für die Beibehaltung der Milz immunologischen Eigenschaften, die das Tier hatte vor dem Eingriff .. Dieses Modell kann für eine Vielzahl von Tumorarten eingesetzt werden. Die Lewis-Lungen-Luciferase-Zelllinie ermöglicht die Biolumineszenz Quantifizierung von Lebererkrankungen im Laufe der Zeit. Die erhöhte Empfindlichkeit der Biolumineszenz-System ermöglicht die Detektion und Quantifizierung von einer kleinen Anzahl von metastatischen Zellen. Dies ermöglicht eine genaue Zeitpunkt für die Einleitung der Behandlung Protokolle und ermöglicht die Quantifizierung der Lebererkrankung ohne Opfer des Tieres. Die Einfachheit, Haltbarkeit und Reproduzierbarkeit machen dieses Modell geeignet für die Untersuchung der verschiedenen Behandlungsstrategien einschließlich neuartiger Chemotherapeutika ^2, Gentherapie ³ und Immuntherapie ^1,4.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc