マウス生物発光肝腫瘤モデル

Summary

この記事では、マウスで同所生物発光性肝腫瘍の誘発、およびライブ全身の発光イメージングを使用して肝臓に限局する腫瘍の成長のその後の分析のための手順を説明します。

Abstract

このビデオはその後、生物発光イメージングによって解析することができるマウスモデルにおける肝転移の成立を説明します。腫瘍細胞は、脾臓の各半分の茎をそのまま血管を残して、二つに脾臓及び分割の動員を経由して、ローカライズされた肝腫瘍を誘発する肝臓に特異的に投与されています。構成的にホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc1）を発現ルイス肺癌細胞は、その後10分後に切除されているものヘミ脾臓に接種されています。他の半脾臓はそのままにして腹部に返されます。肝臓の腫瘍の成長は、IVIS全身イメージングシステムを用いて生物発光イメージングによって監視することができます。 IVISを用いて腫瘍の成長の定量的なイメージングが可能な腫瘍細胞の正確な定量を提供します。薬物治療による腫瘍細胞死と壊死を​​早期に生物発光信号の減少によって示されます。このマウスモデルは、転移性腫瘍細胞の生存と成長のメカニズムを調査することができますし、肝転移の治療薬の評価に使用することができます。

Protocol

はじめ

肝臓は多くの場合、転移性疾患の最初のサイトであり、先進的な疾患を有する患者のように多くの40 30％程度の広がりの唯一のサイトかもしれません。しかし、転移性肝腫瘍を治療するためのオプションは、切除するのに適した少数の患者にはいくつかあり、化学療法への唯一の23％が主要なレスポンダー。この分野の臨床研究は、分離された肝疾患を研究するために適切なマウスモデルの不在によって制限されています。我々は確実に均一な、びまん性肝転移を確立するために使用することができる分割脾臓のアプローチを説明します。脾臓のこの半分の切除は、脾腫瘍の増殖の影響を回避し、脾臓の残りの半分は、脾臓の免疫保護特性を維持するためにそのままのポータル循環に戻されます。我々が説明するモデルは、実行するために非常に簡単ですし、単一の切開を通じて迅速に行うことができます。腫瘍細胞株の生物発光特性は、動物の犠牲なしに、治療に対する反応の正確な定量が可能になります。

プロトコル

I.細胞の調製

1. ルイス肺癌細胞を37℃、10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変必須培地° C、5％CO _2を成長させ、トリプシン処理するときにサブコンフルエントによって収穫されています。
2. 細胞は無血清培地で調製したNucleocounter（ケモmetec、デンマーク）と200μlの1 × 10 ⁶細胞の単一の細胞懸濁液を用いてカウントした。

II。マウスの準備

注：すべての手順は、コーク大学の倫理委員会によって承認された。私たちのラボでは、マウスを麻酔注射麻酔薬を使用して、別の方法として、同じ効果を達成するために吸入麻酔薬を使用することができます。我々が使用するマウス系統は、ハーランラボラトリーズ（オックスフォード、英国）から得られた無毛のMF1 NU / NU株である。 16〜22グラムと年齢の6-8週の重量を量るメスMF1 nu / nuマウスは、この実験に含まれていました。このようなC57およびBALB / cのような他の株は、適当な腫瘍細胞株で使用できます。

1. 麻酔は1.5 mgのケタミンと300 UGのキシラジンの100ulの腹腔内注射によって送達された。
2. 麻酔の深さはつま先のピンチを利用して評価されます。つま先のピンチでは撤退の反射はないはずです。
3. 麻酔マウスが正しく配置し、加熱パッドを介してテープで固定されています。
4. 腹部は10％betadine液で整形処理されています。
5. 腹部と手術部位を無菌的に覆われている。

III。腹部切開

1. 小さな肋骨下の切開は、皮膚で作られています。
2. 切開は2〜3 cmに拡張されます。
3. 腹壁の筋肉組織が分けられ、腹腔が入力されました。

IV。曝露と脾臓の課

1. 脾臓を動員し、優しくプレカット滅菌ガーゼで体外される。
2. 二つの4から0 vicryl合字は、脾臓の半ばに体の周りに関連付けられています。
3. 脾臓は、2つの半脾臓を作成する2つの合字の間に分かれています。

V.ヘミ-脾臓への細胞の注入

1. 27 Gは、1つの半球脾臓に細胞を100μLの量を注入するために使用されます。
2. 腫瘍細胞は注入された細胞の大部分が肝臓に到達するのに十分な時間を提供する10分のために肝臓への排出を許可されます。

VI。ヘミ - 脾臓、腹部閉鎖およびリカバリの切除

1. 注入された半脾臓を摘出されています。
2. 他の半脾臓は腹腔内に返されます。
3. 筋層は、単純なランニングステッチを使用して4から0までのPDS縫合糸で閉じられます。
4. 腹部の皮膚が中断ステッチを使用して4から0 Proleneで閉じられます。
5. 流体のボーラスが投与され、手術後の鎮痛、Carpofen（5 mg / kg）を24時間の手術後のためにIP注射によって投与される。
6. マウスは、麻酔から回復するために許可されています

VII。 IVIS全身生物発光イメージング

1. マウスは注射麻酔薬を使用して麻酔です。
2. ルシフェリン基質は、10分イメージを作成する前に腹腔内注射で与えられる。
3. マウスがステージ上に配置され、IVIS全身イメージングシステムを用いて3分間撮像する
4. 肝臓からの発光は、関心のツールの領域を使用して測定することができます。

VIII。マウスの肝臓の暴露

1. マウスは注射麻酔薬を使用して麻酔です。
2. 屋上腹部切開は、 生体内のびまん性肝転移の可視化が可能になります。
3. マウスを頚椎脱臼により安楽死され、肝臓は、さらなる分析のために摘出されることがあります。

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図1：新鮮なマウス未処理および腫瘍浸潤肝臓を摘出。

図2。IVIS全身イメージングによって証明されるように肝腫瘍の成長の速度論。

Discussion

肝転移の研究のためのin vivoモデル信頼性の発展は新たな治療戦略の出現により、重要な増加になってきています。新たな戦略の正確な研究のために、動物モデルでは、実行することは比較的容易である転移のかなりの数を形成して、転移カスケードのすべてのステップを含んでおり、転移性細胞の限られた数の検出及び計数を可能にするレポーターシステムを持つ必要があります。前述のように分割脾臓のアプローチは、単一の操作を伴いますし、癌腫症と門脈血栓症¹の非常に低リスクで均一なびまん性肝転移を確立するために学ぶのは比較的簡単な手法です。 two半脾臓に脾臓の一部門一半脾臓に腫瘍細胞の注入を可能にする。腫瘍細胞は転移カスケードの最初のステップを模倣、肝臓の門脈循環や旅行を入力してください。注入された半脾臓の切除は、脾腫瘍の成長を回避し、他の半脾臓のリターンは、動物が前の手順に持っていた脾臓の免疫学的特性の保持を確実に..このモデルは、腫瘍の様々なタイプのに利用することができる。ルイス肺癌のルシフェラーゼの細胞株は、時間の経過とともに肝疾患の生物発光定量化することができます。生物発光システムの強化された感度は、転移性細胞の数が少ないの検出および定量することができます。これは治療プロトコールの開始のための正確なタイミングを可能にし、動物の犠牲なしに肝疾患の定量化が可能になります。シンプルさ、耐久性と再現性は、新規化学療法剤^2、遺伝子治療^3、免疫療法の^1,4を含む様々な治療戦略の研究のためのこのモデルが適しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc