Summary
이 문서는 생쥐에 orthotopic 발광 생물 간 종양의 유도, 그리고 라이브 온 몸이 발광 이미징을 사용하여 간장에 국한 종양 성장의 후속 분석을 위해 절차를 설명합니다.
Abstract
이 동영상은 이후 발광 생물 이미징으로 분석 수있는 마우스 모델에서 간 metastases의 설립을 설명합니다. Tumour 세포는 비장의 각 절반 작은 꽃자루 그대로 혈관을두고 두로 비장과 분할의 동원을 통해 지역화된 간 종양을 유발하는 간을 위해 특별히 관리하고 있습니다. constitutively 반딧불의 루시페라제 유전자 (luc1)를 표현 루이스 폐 암종 세포는 다음 10 분 후 resected 하나 헤미 - 비장에 주사를하고 있습니다. 다른 헤미 - 비장은 그대로 왼쪽 복부에 반환됩니다. 간 종양의 성장은 IVIS 온 몸이 이미징 시스템을 사용 bioluminescence 이미징에 의해 모니터할 수 있습니다. IVIS를 사용하여 종양 성장의 양적 이미징이 가능한 종양 세포의 정확한 quantitation를 제공합니다. Tumour 세포 죽음과 약물 치료로 인한 괴사는 발광 생물 신호의 감소에 의해 초기 표시됩니다. 이 마우스 모델은 전이성 종양 세포의 생존과 성장을 기본 메커니즘을 조사 가능하며 간 전이의 치료제의 평가에 사용될 수 있습니다.
Protocol
소개
간은 종종 전이성 질병의 첫 번째 사이트입니다 고급 질환 환자의 많은 40 30 %에서 확산의 유일한 사이트가 될 수 있습니다. 그러나 전이성 간 종양을 치료하기위한 옵션은 절제술에 적합한 환자의 소수로 몇 가지하고 chemotherapeutics에만 23% 주요 조치. 이 분야에 잠복기 연구는 절연 간 질환을 연구하기 위해 적합한 마우스 모델의 부재에 의해 제한되었습니다. 우리는 안정적으로 균일, 확산 간 metastases을 수립하는 데 사용할 수있는 분할 비장의 접근 방식을 설명합니다. 비장의 절반 절제술은 지라 종양의 성장과 비장의 다른 절반 지라 면역 보호 특성을 유지하기 위해 손상 포털 순환과 함께 반환되는의 결과를 피할 수. 우리가 설명하는 모델은 수행하기 위해 아주 간단하고 단일 절개를 통해 신속하게 수행할 수 있습니다. 종양 세포 라인의 발광 생물 특성은 동물의 희생없이 치료 반응의 정확한 양을 정함 수 있습니다.
프로토콜
I. 셀 준비
- 루이스 폐 암종 세포는 37 10 % 태아 송아지 혈청 보충 Dulbecco의 수정된 필수 중간 ° C, 5 % CO 2를 증가하고 trypsinisation 때 하위 합류하여 수확하고 있습니다.
- 세포 혈청 무료로 미디어에 준비되었습니다 Nucleocounter (화학 metec, 덴마크) 200 μl 1 X 10 6 세포의 단일 세포 현탁액을 사용하여 계산되었다.
II. 마우스 준비
참고 : 모든 절차는 대학 코크의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 저희 연구실에서는 마우스를 마취하는 주사용 anesthetics를 사용하여, 또는 하나는 동일한 효과를 달성하기위한 흡입 anesthetics을 사용할 수 있습니다. 우리가 사용하는 마우스 변형은 할런 연구소 (옥스 퍼 드셔, 영국)에서 얻은 사나이 답게 MF1 뉴 / 뉴 변형입니다. 16-22그램 연령 6-8 주간의 무게여 MF1 뉴 / 뉴 생쥐는이 실험에 포함되었습니다. 같은 C57와 Balb / C와 같은 다른 변종도 적절한 종양 세포 라인과 함께 사용할 수 있습니다.
- Anaesthesia는 100ul 1.5 MG의 케타민을 300 UG의 xylazine의 intraperitoneal 주사에 의해 전달되었다.
- 마취의 깊이는 발가락 핀치를 사용하여 평가됩니다. 발가락 핀치와도 금단 반응이 없어야합니다.
- anesthetized 마우스가 제대로 위치하고 손난로 지워졌을 것입니다.
- 복부는 10 % betadine 솔루션 준비합니다.
- 복부와 외과 사이트는 살균 방식에 draped 있습니다.
III. 복부 절개
- 작은 subcostal 절개는 피부에 이루어집니다.
- 절개는 2~3cm로 연장됩니다.
- 복벽 근육을 나누어 복막 캐비티가 입력되었습니다.
IV. 노출과 비장 학부
- 비장은 미리 절단 멸균 거즈에 동원하고 부드럽게 exteriorized입니다.
- 두 4-0 vicryl ligatures는 비장의 중반 몸 주위에 연결되어 있습니다.
- 비장 두 헤미 - spleens을 만드는 두 ligatures 사이에 나눌 수 있습니다.
헤미 - 비장에 전지의 V. 사출
- 27 G는 하나 헤미 - 비장에 세포 100 μL 볼륨을 삽입하는 데 사용됩니다.
- Tumour 세포는 10 분 간 도달 주입된 세포의 대부분을위한 충분한 시간을 제공하는 간으로 배수하기 위해 사용할 수 있습니다.
VI. 의 절단 헤미 - 비장, 복부 폐쇄 및 복구
- 주입 헤미 - 비장이 excised됩니다.
- 다른 헤미 - 비장은 복강에 반환됩니다.
- 근육 계층은 간단한 실행 바늘을 사용하여 4-0 PDS의 봉합과 함께 닫힙니다.
- 복부 피부가 중단 봉합사를 사용하여 4-0 Prolene와 함께 닫힙니다.
- 유체 볼러스가 관리하고 이후 수술 진통제, Carpofen는 (5 밀리그램 / kg) 24 H 포스트 수술에 대한 IP 주입에 의해 관리됩니다.
- 마우스가 마취에서 회복하기 위해 허용
VII. IVIS 전신 발광 생물 이미징
- 마우스 주사용 마취제를 사용하여 anesthetized 있습니다.
- Luciferin 기판은 이미징 전에 내부 복막 주사 십분에 의해 주어집니다
- 생쥐는 무대에 위치하고 IVIS 온 몸이 이미징 시스템을 사용하여 3 분 군데 아르
- 간장의 발광은 관심이 도구의 영역을 사용하여 측정할 수
VIII. 마우스 간의 노출
- 마우스 주사용 마취제를 사용하여 anesthetized 있습니다.
- 옥상 복부 절개는 생체내의 확산 간 전이의 시각화 수 있습니다.
- 마우스는 자궁 전위에 의해 euthanized이며 간장은 추가 분석을 위해 excised 수 있습니다.
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그림 간은 1. 갓 excised murine 치료 및 종양 - 침입.
그림 2.로서 IVIS 온 몸이 이미징에 의해 입증 간장 종양의 성장 속도론.
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Discussion
간 전이의 연구에 대한 생체내 모델로 신뢰성의 개발은 새로운 치료 전략의 도래와 함께 중요한 증가되고있다. 새로운 전략의 정확한 연구를위한 동물 모델을 수행하기 위해 상대적으로 쉽게해야, 전이의 상당수를 형성 전이성 폭포의 모든 단계를 포함하고 전이성 세포의 제한된 수의의 감지 및 카운팅 수있는 기자 시스템을합니다. 로 설명한 분할 비장의 접근 방식은 단일 작업과 관련된하고 carcinomatosis 및 포털 정맥 혈전증 1 매우 낮은 위험과 균일한 확산 간 전이를 설정하는 법을 배워야 비교적 쉬운 기법입니다. 이 헤미 - spleens에 비장의 분단 한 헤미 - 비장에 종양 세포의 주입을 허용합니다. Tumour 세포는 포털 순환을 입력하고 전이성 폭포의 첫 번째 단계를 흉내낸, 간 여행. 주입 헤미 - 비장의 절단은 지라 종양의 성장과 다른 헤미 - 비장의 반환을 피할 동물이 이전 절차했다 지라 면역 속성의 보존을 보장합니다 .. 이 모델은 종양의 종류의 다양한 활용 수 있습니다. 루이스 폐 루시페라제 셀 라인은 시간이 지남에 간 질병의 발광 생물 부량 수 있습니다. bioluminescence 시스템의 향상된 감도 전이성 세포의 소수의 탐지 및 부량 수 있습니다. 이것은 치료 프로토콜의 개시에 대한 정확한 타이밍을 허용하고 동물의 희생없이는 간 질환의 부량 수 있습니다. 단순, 내구성 및 재현성이 소설 chemotherapeutics 2, 유전자 치료 3 immunotherapy의 1,4 등 다양한 치료 전략의 학습이 모델이 적합합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 코르크 사우스 의무실 빅토리아 대학 병원 유방 펀드, 아일랜드 암 협회 (CRI07TAN)와 코르크의 암 연구 센터를 통해 투자되었다. 안정 루시페라제을 표현 루이스 폐 세포 라인 박사에서 어떤 선물 Jooss 카린, 세포 Genesys, 주식 회사, 샌프란 시스코, 미국.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
