Summary
Bu makalede, farelerde ortotopik bioluminescent karaciğer tümörleri indüksiyon ve canlı tüm vücut lüminesans görüntüleme ile karaciğer sınırlı tümör büyümesini sonraki analiz için bir prosedür açıklanmıştır.
Abstract
Bu video, daha sonra bioluminescent görüntüleme ile analiz edilebilir bir fare modelinde karaciğer metastazlarının kurulması açıklanmıştır. Tümör hücreleri, dalak her bir yarısı için pedikül sağlam vasküler bırakarak ikiye dalak ve bölme sağlanması yoluyla, özellikle lokalize bir karaciğer tümörü neden karaciğer yönetilmektedir. Yapısal ateşböceği lusiferaz gen (luc1) ifade Lewis akciğer kanseri hücreleri, daha sonra 10 dakika sonra rezeke bir hemi-dalak inoküle. Diğer yarı dalak sağlam ve sol karın döndü. Karaciğer tümör büyümesini IVIS tüm vücut görüntüleme sistemi kullanılarak biyoparlaklık görüntüleme ile takip edilebilir. IVIS kullanarak tümör büyümesi nicel görüntüleme canlı tümör hücrelerinin hassas kantitatif sağlar. Tümör hücre ölümü ve ilaç tedavisi nedeniyle nekroz bioluminescent sinyali bir azalma erken gösterilir. Bu fare modeli metastatik tümör hücresi hayatta kalma ve büyüme altında yatan mekanizmaları araştıran sağlar ve karaciğer metastazı terapötikler değerlendirilmesi için kullanılabilir.
Protocol
Giriş
Karaciğer genellikle metastatik hastalığın ilk site ve ileri hastalığı olan hastaların% 30 gibi birçok 40 yayılmış tek bir site olabilir. Ancak metastatik karaciğer tümörleri tedavi etmek için seçenekler rezeksiyonu için uygun hasta bir azınlık azdır ve kemoterapötikler için sadece% 23 oranında önemli bir yanıt. Klinik öncesi araştırma, bu alanda izole karaciğer hastalığı incelemek için uygun bir fare modeli yokluğunda sınırlı kalmıştır. Biz güvenilir üniforma, diffüz karaciğer metastazlarının kurmak için kullanılabilecek bir split-dalak yaklaşımı açıklar. Dalak bu yarım Rezeksiyon dalak tümör büyümesi ve dalak immün koruyucu özellikleri sağlamak için sağlam bir portal sirkülasyon ile dalak, diğer yarısı iade edilir sonuçlarını önler. Tarif modeli gerçekleştirmek için oldukça basit ve tek bir kesi yoluyla hızlı bir şekilde yapılabilir. Tümör hücre hattı bioluminescent özellikleri hayvanların kurban olmadan, tedaviye yanıt doğru kantifikasyon verir.
Protokol
I. Hücre Hazırlık
- Lewis akciğer kanseri hücreleri 37% 10 fetal sığır serumu ile takviye Dulbecco'nun Modifiye Essential Orta ° C,% 5 CO 2 trypsinisation alt-konfluent tarafından yetiştirilen ve hasat edilir.
- Hücreler, serum serbest medya hazırlanan bir Nucleocounter (Kemo-METEC, Danimarka) ve 200 ul 1 X 10 6 hücreleri tek bir hücre süspansiyonu kullanılarak sayıldı .
II. Fare Hazırlık
Not: Tüm işlemler University College Cork etik komite tarafından kabul edildi. Laboratuarımızda fare uyutmak için enjektabl anestezikler kullanır; alternatif olarak, aynı etkiyi elde etmek için inhale anestezikler kullanabilirsiniz. Biz kullanılan fare suşu Harlan Laboratuvarları (Oxfordshire, İngiltere) elde tüysüz MF1 nu / nu gerginlik. Bu deneyde 16-22 g ve yaş 6-8 hafta ağırlığında kadın MF1 nu / nu fareler dahil edildi. C57 ve Balb / c gibi diğer türleri de uygun tümör hücre hatları ile kullanılıyor olabilir.
- Anestezi 100ul 1.5 mg ketamin ve 300 ug ksilizin intraperitoneal tarafından teslim edildi.
- Anestezi derinliği ayak tutam kullanılarak değerlendirilir. Ayak tutam herhangi bir geri çekilme refleksi olmalıdır.
- Anestezi fare doğru konumda ve bir ısıtma yastığı üzerinde bantlanmış.
- Karın% 10 betadin çözümü ile prepped.
- Karın ve cerrahi alan steril bir moda dökümlü.
III. Karın Kesi
- Deride küçük bir subkostal insizyon yapılır.
- Kesi 2-3 cm kadar uzatılmıştır.
- Karın duvarı kas bölünmüş ve periton boşluğuna girildi.
IV. Pozlama ve Dalak Bölümü
- Dalak, önceden kesilmiş steril gazlı bez üzerine harekete ve hafifçe exteriorized.
- İki 4-0 Vicryl ligatür dalak orta vücudu etrafında bağlıdır.
- Dalak iki hemi-dalak yaratan iki bitişik harfler arasında bölünmüş durumda.
Hemi-dalak içine V. Hücre Enjeksiyonu
- A 27 G 100 mcL bir hücre hacmi bir hemi-dalak içine enjekte etmek için kullanılır.
- Tümör hücreleri karaciğer karaciğer ulaşmak için enjekte edilen hücrelerin çoğunluğu için yeterli zaman sağlamak için on dakika akıtmak için izin verilir.
VI. Eksizyon Hemi-dalak, karın kapatılması ve Kurtarma
- Enjekte hemi-dalak eksize.
- Diğer hemi-dalak, karın boşluğuna geri döndü.
- Kas tabakası çalışan basit bir dikiş kullanarak 4-0 PDS sütür ile kapatılır.
- Karın cilt 4-0 Prolen kesintiye dikiş ile kapatılır.
- Akışkan bolus verilir ve 24 saat cerrahi sonrası post-operatif analjezi, Carpofen (5 mg / kg) IP enjeksiyon yoluyla uygulanır.
- Fare anestezi kurtarmak için izin verilir
VII. IVIS Tüm Vücut Bioluminescent Görüntüleme
- Fare enjektabl anestezi ile uyuşturulduktan.
- Luciferase Yüzey görüntüleme önce periton içi enjeksiyon on dakika verilir
- Fareler sahne üzerine yerleştirilen ve 3 dakika görüntülü IVIS Tüm vücut görüntüleme sistemi kullanılarak
- Karaciğer Lüminesans bir bölge faiz aracını kullanarak ölçülebilir.
VIII. Fare karaciğerinde maruz kalma
- Fare enjektabl anestezi ile uyuşturulduktan.
- Çatı katındaki abdominal kesi in vivo diffüz karaciğer metastazı görselleştirme sağlar.
- Fare servikal dislokasyon ötenazi ve karaciğer daha fazla analiz için eksize edilebilir.
_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil ciğeri 1. Taze eksize fare tedavi edilmemiş ve tümör infiltre.
Şekil 2 IVIS tüm vücut görüntülemesi ile kanıtlandığı gibi karaciğer tümörü büyüme kinetiği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer metastazı çalışması için in vivo modeller güvenilir gelişimi yeni tedavi stratejilerinin gelişiyle birlikte artan önemli hale gelmektedir. Yeni stratejilerin doğru çalışması için, hayvan modelleri gerçekleştirmek için nispeten kolay olmalı, önemli sayıda metastaz formu metastatik kaskadın tüm adımları içeren ve sınırlı sayıda metastatik hücrelerinin algılama ve sayma sağlayan bir muhabir sistemine sahip. Split-dalak yaklaşımı olarak tanımlanan tek bir işlemle içerir ve Karsinomatozis ve portal ven trombozu, 1 çok düşük bir risk ile aynı diffüz karaciğer metastazı kurmak öğrenmek için nispeten kolay bir tekniktir . Iki hemi-dalak dalak bölünmesi bir hemi-dalak içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu izin verir. Tümör hücreleri, portal dolaşıma girer ve metastatik kaskad ilk adımı taklit, karaciğer seyahat. Eksizyonu enjekte hemi-dalak dalak bir tümörün diğer hemi-dalak büyümesi ve dönüş önler hayvan İşlemden önce dalak immünolojik özelliklerini muhafaza sağlar .. Bu model, çeşitli tümör tipleri için kullanılabilir. Lewis akciğer lusiferaz hücre hattı zamanla karaciğer hastalığı bioluminescent kantifikasyon sağlar. Biyoparlaklık sisteminin gelişmiş hassasiyeti metastatik hücrelerinin küçük bir sayı ve miktar tespiti sağlar. Bu tedavi protokollerinin başlatılması için doğru bir zamanlama sağlar ve hayvan kurban olmadan karaciğer hastalığı ölçümü sağlar. Basitlik, dayanıklılık ve tekrarlanabilirlik roman kemoterapötikler 2, gen tedavisi 3 ve immünoterapi 1,4 dahil olmak üzere çeşitli tedavi stratejilerinin çalışma için uygun bu model olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Cork Güney Revir Victoria Üniversitesi Hastanesi Göğüs fonu, İrlanda Kanser Derneği (CRI07TAN) ve Cork Kanser Araştırma Merkezi ile finanse edildi. Lewis akciğer hücre hattı stably lusiferaz ifade eden Dr bir tür hediye Jooss Karin Cell Genesys, Inc, San Francisco, ABD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
