Flash Frysning och Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Summary

Visats i denna video är de tekniker för flash frysning och sektionering embryonal hjärnvävnad från mus. Användbara tips för att använda kryostat ges, inklusive felsökning metoder som kan användas samtidigt minska för att säkerställa att den resulterande vävnaderna sektionerna är fria från sprickor och andra störningar.

Protocol

1. Fix vävnad i 4% paraformaldehyd i PBS för önskad tid.
2. Sackaros ingjuta vävnad (cryoprotection)
   1. Gör 30% sackaroslösning i PBS w / v under 2059 rör.
   2. Skölj vävnad 3x i PBS (~ 5 min med gungande).
   3. Placera vävnad i 30% sackaroslösning. Tissue kommer inte att sjunka.
   4. Placera vävnad i 4 ° C över natten, eller tills den har sjunkit.
3. Etikett lämplig storlek cryomold med information och orientering.
4. Fyll cryomold med oktober (undvik bubblor).
5. Överföring vävnad till oktober bad och päls den med oktober
6. Överföring vävnad till oktober i cryomold.
7. Orient vävnaden i mikroskop.
8. Häll flytande kväve i plast petriskål.
9. Snabbt och försiktigt sänka vävnad i cryomold till kväve. (Inte doppa toppen av cryomold.)
10. När oktober är solid vit, placera fryst vävnad till -80 ° C frys för förvaring.
11. Jämvikta vävnad till ~ 20 ° C under minst 30 min. innan snittning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Sucrose solution			30% sucrose solution in PBS w/v
paraformaldehyde			4% paraformaldehyde in PBS